全 文 ：Vol131 , No15
pp1 603 - 607 　May , 2005作 　物 　学 　报ACTA A GRONOM ICA SIN ICA第 31 卷 第 5 期2005 年 5 月 　603～607 页
水稻转高赖氨酸蛋白质基因 ( sb401)植株的获得及种子中蛋白质和氨基
酸的含量分析
王为民　赵　倩　于静娟　朱登云　敖光明 3 Ξ
(中国农业大学农业生物技术国家重点实验室 ,北京 100094)
摘 　要 : 用来源于马铃薯花粉的高赖氨酸蛋白质基因和玉米醇溶蛋白基因启动子构建了一个植物表达载体。采用农杆
菌介导法导入籼稻品种龙特甫B ,PCR 和 Southern blot 结果表明外源基因已整合到水稻基因组中 ,Western blot 分析表明
高赖氨酸蛋白质基因已在转基因水稻种子中表达。对 7 株转基因水稻种子的分析表明 ,蛋白质的含量 (10187 %～
13116 %)平均提高了 1817 % ,赖氨酸的含量 (0147 %～0160 %) 平均提高了 10 % ,苏氨酸的含量 (0142 %～0153 %) 平均
提高了 15171 % ,苯丙氨酸、蛋氨酸、组氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸等必需氨基酸的含量也均有不同程度的提高。
关键词 : 水稻 ;高赖氨酸蛋白质基因 ;农杆菌
中图分类号 : S511
Transfer of High Lysine Gene sb401 into Rice and Analysis for Protein and Amino
Acid Content in Transgenic Rice Seeds
WAN G Wei2Min , ZHAO Qian , YU Jing2J uan , ZHU Deng2Yun , AO Guang2Ming 3
( State Key L aboratories f or A grobiotechnology , China A gricult ural U niversity , Beijing 100094 , China)
Abstract : The expression vector was constructed with lysine2rich protein gene sb401 from potato pollen and the promoter of
maize prolamin gene1 The cultivar LongTeFuB was transfected with the above expression vector by Agrobacterium
tumef aciens1 Genomic PCR , Southern2blotting analysis showed that the foreign gene was integrated into the rice genome1
The Western2blotting analysis confirmed that the transfected protein gene conferred high lysine were expressed in the mature
seeds of the transgenic plants1 The analysis result of mature seeds from 7 transgenic plants revealed that the content of
protein was 10187 % - 13116 % with the increase more than 1817 % , the content of lysine was 0147 % - 0160 % with the
increase more than 10 % ; the content of threonine ( 0142 % - 0153 %) increased by 15171 % ; and the contents of
phenylalanine , methionine , histidine , valine leucine and isoleucine were also increased respectively1
Key words :Rice ; Lysine2rich protein gene ; A grobacterium tumef aciens
　　水稻是我国的主要粮食作物之一 ,但在食用精
米中的蛋白质平均含量仅为 613 %～711 % ,是谷类
作物中最低的。其赖氨酸含量仅为 0122 % ～
0128 % ,为第一位限制性氨基酸[ 1 ] 。增加稻米中蛋
白质和赖氨酸的含量将提高稻米的生物价 ,促进人
和动物对其蛋白质的消化吸收和利用。
传统的水稻育种技术已大幅提高了稻米的产量
(9 tΠhm2 ) [ 2 ] ,但其周期长 ,且难以解决诸如稻米中
蛋白质的氨基酸营养组分不平衡和不含维生素 A
等问题。由于稻米蛋白质含量主要受遗传基因控
制[ 3 ] ,利用基因工程将自然界植物体内分子量较小、
且富含赖氨酸的蛋白质基因导入水稻 ,可能是一个
改良营养品质的可行途径。
sb401 是从马铃薯花粉中克隆的一个高赖氨酸
蛋白质基因 ,其 cDNA 序列编码的赖氨酸含量高达
1617 %[ 4 ] ,本室利用基因枪法将其导入玉米 ,发现转
基因种子的赖氨酸含量提高了 16 %[ 5 ] 。本实验利
用高赖氨酸蛋白质基因和玉米醇溶蛋白基因启动子
构建了一个植物表达载体 ,利用农杆菌法转化水稻
保持系龙特甫 B ,获得了转基因水稻株系 ,并分析了
第一代糙米的蛋白质和氨基酸含量。Ξ基金项目 : 国家“863”计划 (2001AA212091 ,2002AA212101)资助项目。
作者简介 : 王为民 (1970 - ) ,男 ,博士研究生。3 通讯作者 :敖光明 (1939 - ) ,男 ,教授 ,湖南长沙人 ,研究方向 :作物品质改良的基因工程。
Received(收稿日期) :2004202206 ,Accepted(接受日期) :20042072141

1 　材料与方法
111 　实验材料
　　籼稻品种龙特甫 B 由中国水稻研究所提供。
常用试剂为国产分析纯试剂 ;内切酶、T4 连接酶购
自 Promega 公司 ;双元表达载体 pCAMBLA2300 由
上海复旦大学提供 ,含有醇溶蛋白基因启动子 ,高赖
氨酸蛋白质基因 cDNA 的质粒 p19ZL RP 为本实验
室自备。农杆菌菌株为 EHAl05。
112 　实验方法
11211 　植物表达载体的构建及农杆菌的转化 　　
参照 Sambrook 等方法[ 6 ] , 构建植物表达载体
pC19ZK。以 冻 融 法 转 化 根 癌 土 壤 农 杆 菌
EHA105[ 7 ] 。
11212 　农杆菌转化水稻 　　将水稻种子除去颖壳 ,
接种于含 2 mgΠL ABA 和 2 mgΠL 2 ,42D 的 N6 培养
基上 ,27 ℃暗培养约 20 d ,切取愈伤组织用于农杆菌
转化。将含有质粒 pC19ZK的农杆菌 EHA105 接种
于 YEP 液体培养基 (含 100 mgΠL Kan 和 25 mgΠL
利福平)中 , 28 ℃振荡摇菌至 018～019ΠOD600 ,集菌
后用含 10 gΠL 葡萄糖、100μmolΠL As 和 2 mgΠL 2 ,
42D 的 N6 液体培养基适量稀释后备用。将愈伤块放
入上述稀释液中 , 浸染 10 min 后取出 ,用无菌滤纸吸
干 ,置固体共培养基 (成分同 N6 液体培养基)上暗培
养 48 h。用 011 molΠL 甘露醇溶液清洗愈伤组织至清
洗液清亮 ,弃上清液 ,转入含 500 mgΠL 头孢霉素和
200 mgΠL 羧苄青霉素的溶液中振摇灭菌 4～5 h ,用无
菌滤纸吸干 ,愈伤组织块转移至含 500 mgΠL 头孢霉
素、100 mgΠL G418、2 mgΠL 2 ,42D 的 N6 培养基中筛
选培养 ,14 d 继代 1 次 ,筛选约 45 d 后 ,将生长良好的
愈伤组织块转入含 2 mgΠL 62BA、012 mgΠL NAA、012
mgΠL Zeatin 和 500 mgΠL 头孢霉素的 MS 培养基 ,在
光下进行分化。小苗高 1～2 cm 时 ,转移到含 100
mgΠL G418、1 mgΠL 多效唑的 1Π2 MS 培养基上继续
培养 ;待苗高 7～15 cm 时 ,移栽到温室 (上述培养基
均含有 30 gΠL 蔗糖 ,除液体培养基外 ,均加有 215～
3 gΠL phytagel) 。
11213 　转基因水稻的 PCR 检测 　　再生苗定植成
活后 ,用 CTAB 法提取总 DNA ,根据玉米醇溶蛋白
基因启动子序列设计特异扩增引物 Pro21 和 Pro22。
引 物 序 列 为 Pro21 : 5′ primer ( 22nt ) :
TCCTAA GCTTCTTCCTA GTGTT ; Pro22 : 3′primer
(21nt) : TGTTGGTACACTA TTGTGCTT。PCR 反
应条件为 94 ℃预变性 5 min ,94 ℃变性 1 min ,53 ℃
复性 1 min ,72 ℃延伸 1 min ,共 30 个循环。PCR 结
束后 ,产物进行 1 %琼脂糖电泳检测。
11214 　转基因水稻的 Southern 检测 　　随机引物
法制备α232 P 标记的 DNA 探针 , Southern blot 分析
参照文献[6 ]。
11215 　Western blot 分析 　　按照 Schaeffer[ 8 ] 方
法 ,提取种子清蛋白 ,经预电泳调整上样量 ,12 %的
SDS2PA GE 后转移到 PVDF 膜。按《蛋白质技术手
册》中介绍的方法进行 Western blot 分析[ 9 ] 。
11216 　种子中蛋白质和氨基酸含量测定 　　蛋白
质含量用凯氏定氮法测定 ,蛋白质系数为 5195 ;氨
基酸分析采用酸水解法在农业部饲料质量检测中心
进行。
2 　结果与分析
211 　表达载体 pC19ZK的构建
　　将质粒 p19ZL RP (417 kb) 用 EcoR Ⅰ, Pst Ⅰ
双酶切 ,回收片段 (包括玉米醇溶蛋白 19Z 启动子、
高赖氨酸蛋白质基因 cDNA 和 nos 终止子) , EcoR
Ⅰ、Pst Ⅰ双切处理载体 pCAMBLA2300 ,利用 T4
连接酶将回收片段克隆到载体 pCAMBLA2300 的
多克隆位点中 ,构建成表达载体 pC19ZK(图 1) 。
图 1 植物表达载体 pC19ZK的结构简图
Fig. 1 Construction of plant expression vector pC19ZK
212 　转基因水稻的获得和 PCR检测
含有植物表达载体 pC19ZK的农杆菌 ,转化水
稻龙特甫 B 的成熟胚愈伤组织块 600 个 ,在含 G418
的选择培养基中筛选约 45 d 后 ,分化出绿色芽 ,而
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对照组在含 G418 的选择培养基中生长即被完全抑
制 ,愈伤块逐渐死亡。将分化的绿色芽经过分化培
养 ,移栽定植后成活 89 株。提取总 DNA ,用引物
Pro21 和 Pro22 进行 PCR 检测 ,其中 35 株扩增出 1
个与预期长度 649 bp 相符的 DNA 片段 (图 2) 。
图 2 T0 代转基因水稻的 PCR检测
Fig. 2 PCR assay of T0 regenerated rice plants
1～11 : T0 代转基因苗 ;12 :非转基因水稻 ;13 :质粒 pC19ZL RP 扩增产物 ;14 :1 kb 分子量标准 ( Promega) 。
1 - 11 : DNA from transgenic plants as templates ; 12 : DNA from non2t ransgenic plants as templates ;
13 : plasmid control as templates ; 14 : 1 kb marker.
213 　转基因水稻的 Southern blot 检测
用 Xho Ⅰ单酶切质粒 pC19ZK ,电泳回收 018
kb npt Ⅱ基因 ,用 [α232 P ]dCTP 进行标记。将 PCR
检测为阳性的植株总 DNA、未转化植株总 DNA (阴
性对照)和质粒 pC19ZK分别用 EcoR Ⅰ和 Pst Ⅰ双
酶切 ,常规电泳后用碱转移法转移至尼龙膜。以标
记的 npt Ⅱ基因为探针 ,进行 Southern blot 分析。
部分检测结果如图 3 所示 ,图中编号 4、5 的再生植
株中出现 2 条杂交带 ,大小分别约为 817 kb 和 5
kb ;编号 2、3、6 和 7 的再生植株中出现 1 条杂交带 ,
大小约为 5 kb ;上述结果说明外源基因 npt Ⅱ已整
合到转基因水稻的基因组中 ,在不同的转基因植株
基因组中插入的拷贝数不同。因此确认本实验得到
了转基因的水稻植株。共有 24 株呈阳性 ,转化效率
约为 4 %。将其分别命名为 T021 , T022 , T023 , ⋯⋯
T0224。
图 3 部分 T0 代植株的 Southern blot 结果
Fig. 3 Southern blotting assay of T0 regenerated rice plants
1～7 : T0 代转基因苗 ;8 :非转基因水稻 ;
9 :质粒 pC19ZL RP 的酶切产物。
1 - 7 : DNA from transgenic plants ;
8 : DNA from non2t ransgenic plants as a negative control ;
9 : p19ZKBARΠPst Ⅰ+ EcoR Ⅰas positive control.
214 　转基因水稻种子的 Western blot 检测
提取 Southern blot 阳性植株种子的清蛋白 ,用
高赖氨酸蛋白质基因原核表达产物的免疫兔的抗血
清为一抗 ,连接有碱性磷酸酶的羊抗兔血清为二抗 ,
高赖氨酸蛋白质基因原核表达产物 (50 kD) 为阳性
对照 ,进行 Western blot 分析 ,结果如图 4 所示 ,样
品在与对照位置一致的地方出现了条带 ,说明高赖
氨酸蛋白质基因 ( sb401) 已整合到转基因水稻的基
因组中 ,并在水稻的种子中进行了正确的表达。
图 4 转基因水稻种子中高赖氨酸蛋白质的 Western blot 检测
Fig. 4 Western blot assay of high lysine protein of
transgenic rice seeds
1～4 : T0 代转基因水稻 ;5 :非转基因水稻 ;
6 :高赖氨酸蛋白质基因的原核表达产物。
1 - 4 : Protein from transgenic rice seeds ;
5 : Protein from non2t ransgenic rice seeds as a negative control ;
6 : Expressed by high lysine protein gene product of
prokaryocyte as positive control.
215 　转基因水稻种子中蛋白质和氨基酸含量及千
粒重的测定
　　对部分转基因 T0 代种子中的蛋白质和必需氨
基酸含量及千粒重进行测定 (表 1) ,与未转基因对
照相比 ,转基因龙特甫 B 成熟种子中蛋白质含量
(10187 %～13116 %) 平均提高了 1817 %。以种子
干重计算 ,苯丙氨酸的含量 (0159 %～0171 %) 平均
提高了 25171 % , 异亮氨酸的含量 ( 0148 % ～
0157 %) 平 均 提 高 了 17161 % , 赖 氨 酸 的 含 量
(0147 %～0160 %)平均提高了 10 % ,苏氨酸的含量
(0142 %～0153 %) 平均提高了 15171 % ,其他必需
氨基酸如亮氨酸、组氨酸、蛋氨酸和缬氨酸的含量也
均有不同幅度的提高。但转基因种子的千粒重呈下
506　第 5 期 王为民等 :水稻转高赖氨酸蛋白质基因 ( sb401)植株的获得及种子中蛋白质和氨基酸的含量分析 　　　

降趋势 ,在不同的株系中下降的幅度不同 (3164 %～ 17147 %) ,平均下降了 12116 %。
表 1 转基因水稻种子必需氨基酸和蛋白质含量( %)及千粒重的测定
Table 1 Protein and essential amino acid content ( %) and thousand2grain weight in transgenic rice seeds
编号
No1 氨基酸Amino acid ( %) 蛋白质Protein
Phe Leu Ile Thr Val Lys His Met
含量
Content
( %)
增加
Increase
( %)
千粒重
1 0002grain
weight
(g)
千粒重下降
1 0002grain
weight
decreasing
( %)
1 0171 1112 0157 0153 0181 016 0139 0127 13116 34104 21132 16149
2 0165 1103 0152 0148 0176 0153 0138 0127 12101 22125 23183 6166
3 0159 0192 0148 0142 0165 0147 0128 0121 10187 10164 24160 3164
4 0160 0195 0149 0144 0167 0148 013 0121 11104 12144 23108 9160
5 0162 0199 0150 0146 0170 0153 0131 0124 11170 19113 21107 17147
6 0162 0198 0149 0146 0171 0150 0133 0129 11163 18145 21124 16180
7 0161 0197 0149 0145 0170 0151 0133 0123 11119 13192 21184 14145
平均 Average 0163 0199 0151 0146 0171 0152 0133 0125 11166 18170 22143 12116
对照 Control 0150 0183 0143 014 0162 0147 0130 0122 9182 25153
　　注 :色氨酸含量未测。Note : The content of Tryptophane was not measured1
3 　讨论
利用转基因技术 ,改良水稻营养品质需要能在
水稻种子中高效和特异性表达的启动子 ,使目的基
因的表达产物在水稻种子中积累 ,以减少外源基因
表达对水稻其他农艺性状的影响。本实验利用玉米
醇溶蛋白基因启动子驱动目的基因的表达、Western
blot 分析和对转基因水稻种子中蛋白质和氨基酸的
分析结果表明 ,该启动子能够指导高赖氨酸蛋白质
基因在水稻种子中高效表达。
改良稻米的营养品质 ,主要是增加稻米中的蛋
白质含量以及赖氨酸和苏氨酸等必需氨基酸的含
量。测定结果表明 ,与对照相比 ,转基因水稻种子中
的蛋白质含量平均提高 1817 %。导致转基因种子
蛋白质含量升高的原因是转基因种子在成熟过程
中 ,淀粉的沉积不正常而含量降低导致种子中蛋白
质的含量相对增高 ,同时种子的千粒重下降 ;或由于
目的基因在种子中的表达并积累 ,导致种子中的蛋
白质含量增加。表 1 的数据显示 ,上述情况在转基
因水稻种子中均有体现 ,即转基因种子的千粒重呈
下降趋势 ,种子中蛋白质的含量呈上升趋势。进一
步分析发现 ,除样品 4 种子中蛋白质含量的增幅略
小于千粒重下降的幅度外 ,其余样品中蛋白质的增
幅均大于千粒重下降的幅度。结合 Western blot 分
析结果 ,表明主要是由于目的基因在种子中表达和
积累导致其蛋白质含量的增加。转基因种子中蛋白
质含量最多的增加了 34104 % , 最少的增加了
10164 % ,不同种子中增幅不同。其原因可能是转基
因插入的拷贝数不同以及目的基因整合在受体基因
组的位置不同 ,而导致的“位置效应”,使目的基因在
不同的转基因植株中的表达量不同。Southern blot
结果显示 ,杂交条带为 1～2 ,表明每个转基因植株
中插入目的基因的拷贝数是不同的。样品 4 种子
中 ,蛋白质含量升高的幅度 ,小于千粒重下降的幅
度 ,表明是第一种原因起主导作用 ,而失去应用
价值。
不同转基因水稻样品种子蛋白质中赖氨酸、苏
氨酸和蛋氨酸等必需氨基酸含量的变化亦不一致 ,
其原因可能是目的基因的表达干扰了受体植株蛋白
质的代谢。由于植物体中各种蛋白质的合成和分解
是协调进行的 ,某一种蛋白质合成的增多 ,会导致其
他一些蛋白质的数量发生变化 ,其结果是种子中的
各种氨基酸的比例发生变化。从营养角度出发 ,赖
氨酸和苏氨酸是稻米蛋白质中的限制性氨基酸 ,提
高水稻种子中蛋白质、赖氨酸和苏氨酸的含量 ,即提
高稻米的营养价值。以种子蛋白质的干重计算 ,转
基因水稻种子蛋白质中赖氨酸和苏氨酸的平均含量
分别为 4143 %和 3197 % ,均高于或接近于 RDAs
(推荐的每日膳食中营养素供给量)对成人和儿童的
推荐量 (414 %和 218 %) [ 10 ] ,结合种子中蛋白质的含
量变化考虑 ,转基因水稻种子中赖氨酸和苏氨酸等
必需氨基酸的增加 ,使其营养价值高于未转基因水
稻的种子。但转基因水稻种子蛋白质中苯丙
氨酸、亮氨酸和异亮氨酸含量增加的幅度大于赖氨
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酸和苏氨酸等必需氨基酸含量增加的幅度 ,造成转
基因稻米蛋白质氨基酸组分新的不平衡。如何使转
基因稻米蛋白质成为完全蛋白质 ,最大限度地提高
其营养价值 ,尚需进一步研究。
利用植物基因工程改良水稻的营养品质 ,转基
因水稻的安全性是另一个值得关注的问题。在本试
验中 , 所用的目的基因来源于马铃薯 , 通过与
GenBank 数据库比较 ,未发现与过敏蛋白和毒蛋白
有同源序列。目前认为 npt Ⅱ基因是相对安全的标
记基因[ 11 ] ,转化受体为具有应用价值的籼稻保持系
龙特甫 B。实验结果表明 ,转基因水稻种子中的蛋
白质、赖氨酸和苏氨酸的含量与未转基因的对照相
比 ,均有不同程度的提高 ,且未见其他农艺性状有明
显改变。但要得到种子赖氨酸含量高和能够稳定遗
传的转基因水稻 ,还需进一步选育。
致 　谢 :水稻种子由中国水稻所孙宗修研究员惠赠。
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(上接第 591 页)
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