全 文 ：Vol131 , No15
pp1 647 - 652 May , 2005作 物 学 报ACTA A GRONOM ICA SIN ICA第 31 卷 第 5 期2005 年 5 月 647～652 页
利用 RAPD 技术研究弱秋眠性紫花苜蓿遗传多样性
毕玉芬 车伟光 李季蓉 Ξ
(云南农业大学动物科技学院 ,云南昆明 650201)
摘 要 : 在 42 个供试品种中选出生长势良好的半秋眠、不秋眠紫花苜蓿 ( Medicago sativa L1)品种 13 份 ,用 RAPD 技术
对其遗传多样性进行分析。结果表明 ,30 个随机引物均能扩增出清晰的条带 ,数目在 1～14 条之间。其中 12 条引物占
所用引物的 40 % ,在 13 份材料中共产生分子量不同的 126 个 RAPD 标记 ,其中多态性条带 116 条 ,占 92106 %。说明半
秋眠、不秋眠紫花苜蓿的多态性远高于中国紫花苜蓿地方品种 (70168 %) ,是一类具有较高遗传多样性的苜蓿基因类群。
弱秋眠性苜蓿品种具有丰富的遗传基础 ,其遗传保守性可能较差 ,或具有更广泛的适应潜力和开发价值。遗传距离分析
结果表明 ,弱秋眠性紫花苜蓿在遗传上既具有一定的一致性 ,又具有各自独立的遗传性 ,遗传背景丰富。本试验结果为
云南省今后进一步引进、利用优质弱秋眠性紫花苜蓿种质资源 ,丰富种质资源信息库 ,培育新良种提供了分子生物学依据。
关键词 : 紫花苜蓿 ;秋眠性 ;遗传多样性
中图分类号 : S551
Genetic Diversity Analysis of Weak2fall Dormancy Alfalfa
BI Yu2Fen ,CHE Wei2Guang ,L I Ji2Rong
( College of A ni mal Science and Technology , Y unnan A gricult ural U niversity , Kunming 650201 , Y unnan , China)
Abstract :Alfalfa ( Medicago sativa L1) is planted mainly in North China1 Most of researches on it also focus on those
accessions with strong2fall dormancy1 Studies have shown that fall dormancy of alfalfa and lower soil’s pH are main
obstacles to prevent alfalfa extension from north to south1 On conditions that sunlight is not enough but temperature is
adaptive to plant growth , the accessions with weak2fall dormancy can give a higher yield yearly , while those with non2fall
dormancy can improve their yield seasonally1 With the increase of K value ( wet2degree) and decrease of latitude , fall
dormant degrees of adaptive alfalfa species will be increase (while the fall dormant trait of alfalfa weaked) 1 Yunnan Province
is located in the subtropical region of South China1 Climate here is temperate with a long frost2free period and plenty of
rain1 Theoretically , alfalfa with weak2fall dormancy should have a promising adaptability1
Thirteen alfalfa cultivars were selected from forty2two promising cultivars with semi2fall dormancy and non2dormancy ,
they can grow very well in natural climate of Kunming1 We employed RAPD to do some analyses of the genetic
polymorphism of these cultivars1 The results showed that the amplification products were obtained using 30 random
primers , showing 1 - 14 distinguishable bands1 Among them , 12 primers were need to thirteen samples , which were 40 %
of those employed , producing 126 RAPD markers with different molecular weights , among which there were 116
polymorphic bands , accunted for 92106 % of the total1 Cultivars with semi2dormancy and non2dormancy had high genetic
polymorphism, showing much higher polymorphism than native cultivars ( 70168 %) 1 The cultivars with weak2fall
dormancy were with rich genetic foundation1 Their adaptability and merits were discussed1 The result of genetic distance
analysis showed that alfalfa with weak2fall dormancy has certain coincident and independent as well as rich genetic
backgrounds1 The studies offer some molecular biological foundation for aiding to introduce and utilize of alfalfa accessions
with weak2fall dormancy and high quality in Yunnan Province , enrich genetic information database and promote alfalfa
breeding.
Key words :Alfalfa ; Fall dormancy ; Genetic diversity
基金项目 : 国家自然基金项目 (30260075)和云南省自然科学基金项目 (2001C0037)资助。
作者简介 : 毕玉芬 (1960 - ) ,女 ,蒙古族 ,内蒙古通辽市人 ,教授 ,博士 ,主要从事草业科学的教学和科研工作。Tel :13099904625 ; E2mail :
biyufenynnd @sina1com
Received(收稿日期) :2004203209 , Accepted(接受日期) :20042082171
我国苜蓿 ( Medicago sativa L1) 种植区域主要
在北方 ,因此 ,目前选育和引进的苜蓿品种大多数为
抗寒性强、耐中性或偏碱性土壤的强秋眠性品种 ,大
多数研究的内容也集中在强秋眠性苜蓿资源上。研
究表明 ,苜蓿秋眠特性和较低的土壤 p H 是中国苜
蓿难以南移的重要障碍因素[1 ] 。在光照成为植物生
长的限制因素而温度却仍适宜植物生长的条件下 ,种
植休眠性较弱的品种有可能提高苜蓿的年产量 ;非休
眠性苜蓿品种具有提高季节性产量的作用[2 ,3 ] ;随种
植地区 K 值 (湿润度) 增加和纬度的降低 ,适宜种植
的苜蓿品种秋眠级增高 (秋眠性减弱) [4 ] 。
云南地处我国南方 ,土壤大多为红壤 ,主要气候
带为亚热带 ,气候温暖 ,降雨充分 ,无霜期长 ,弱秋眠
性苜蓿品种具有良好的适应潜力。本研究以 13 份
弱秋眠性苜蓿为材料 ,利用 RAPD 技术对遗传多样
性进行分析 ,有助于了解弱秋眠性苜蓿适应性的遗
传基础 ,为云南弱秋眠性苜蓿的引种、育种和遗传改
良奠定基础 ,对于推动云南苜蓿产业的发展具有积
极作用。
1 材料与方法
111 试验地自然条件
试验地设在云南农业大学后山草业科学实验实
习基地。地处北纬 25°01′,东经 103°,海拔 1931 m ,
年平均气温 1417 ℃,年降水量 900～1 100 mm ,年日
照 2 41118 h ,土壤 p H 值为 615。
112 试验材料
本试验所采用的 13 份苜蓿品种是从 42 个供试
品种中选出的 ,均为生长势良好的半秋眠、不秋眠紫
花苜蓿 ,其序号、品种名称及来源列于表 1。
表 1 供试材料
Table 1 13 alfalfa cultivars in this experiment
编号
Material No1 品种Cultivar 秋眠级FDR 来源Source
7 优克21465 UC21465 11 美国俄勒冈州立大学韩大卫博士提供 Provided by Hannaway D B
10 猎人河 Hunter River 414 卢欣石提供 Provided by Lu Xinshi
15 德宝 Derby 412 法国 ,卢欣石提供 France , provided by Lu Xinshi
16 爱库勒 Acrora 416 澳大利亚 ,卢欣石提供 Australia , provided by Lu Xinshi
20 三得利 Sanditi 412 法国 , 卢欣石提供 France , provided by Lu Xinshi
21 德福 DEFI 415 法国 , 卢欣石提供 France , provided by Lu Xinshi
34 GT13R 13R Supreme 711 美国 , 卢欣石提供 USA , provided by Lu Xinshi
35 牧歌 701 Ameri Graze 701 611 云南草山与饲料总站吴维群提供 Provided by Wu Weiqun
36 路宝 Lobo 513 云南草山与饲料总站吴维群提供 Provided by Wu Weiqun
39 射手 2 号 Archer Ⅱ 412 云南草山与饲料总站吴维群提供 Provided by Wu Weiqun
40 牧歌 702 Ameri Graze 702 714 云南草山与饲料总站吴维群提供 Provided by Wu Weiqun
41 爱博 Arriba 615 云南草山与饲料总站吴维群提供 Provided by Wu Weiqun
42 射手 Archer 414 云南草山与饲料总站吴维群提供 Provided by Wu Weiqun
113 RAPD 多态性标记筛选
本实验采用 N22CTAB 法提取苜蓿基因组
DNA[ 5 ] ,通过比较样品与标准样品的荧光强度可测
定 DNA 的浓度。
PCR 的反应体系为 25 μL ,含有 10 ×缓冲液
215μL 、012 mmolΠL dN TP、20 ng 引物、Taq DNA
聚合酶 (含 Mg2 + ) 1 U、DNA 模板 15 ng。
PCR 反应先在 94 ℃预变 4 min ,然后 94 ℃变性
30 s ,36 ℃退火 30 s ,72 ℃延伸 1 min ,45 个循环后 ,
再在 72 ℃延伸 10 min。
对购自上海生物工程有限公司的 30 个随机引
物进行初步 PCR ( HB2PX2220 型) 扩增 ,淘汰扩增结
果不稳定的引物 ,再以 13 个苜蓿品种的 DNA 为模
板 ,对所选引物进行 PCR 扩增以筛选多态性稳定的
RAPD 标记 ,每个引物重复 2～3 次。
RAPD 反应条件参照国内外研究者对苜蓿基因
组所做的 RAPD 反应条件优化的结果[ 6～12 ]设立。
扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶上 120 V 电压下电
泳 215 h ,紫外成像仪下观察结果并照相。
114 D NA扩增带的统计与数据处理
每个引物所有扩增片段按分子量大小的顺序排
列 ,全部材料在重复扩增过程中稳定出现的带无论
强弱均赋值为 1 ,不存在时赋值 0[ 13 ] 。
建立 0、1 统计表 ,采用聚类分析软件 Statistic
计算材料间的欧氏遗传距离 ,按软件中的非加权组
平均法 ( unweighted pair group with mathematic
average , U PGMA)对所有供试材料进行系统聚类 ,
建立 DNA 片段亲缘关系树状图。计算公式 :
dij = ∑
m
k = 1
( X ik - X jk ) 2
1Π2
其中 : dij为 Xi 与 Xj 两品种间的欧氏距离 , Xik 、Xjk 分
别为 i、j 两品种第 k 个位点的扩增带 , m 为扩增位点。
846 作 物 学 报 第 31 卷
2 结果与讨论
211 引物的筛选
本试验以 30 条引物对 13 个供试材料的 DNA
样本进行了扩增 (图 1) 。结果显示 ,30 条引物均能
扩增出清晰的条带 ,数目在 1～14 条之间。其中 ,有
12 条引物对 13 个样品均能检测出扩增片段 ,具有
多态性 ,扩增效果良好 ,占所用引物的 40 %。在聚
类分析时 ,引物数量不一定要多 ,但多态性要高[ 12 ] 。
12 条引物的序号、编号见表 2。
图 1 12 个引物对 13 份供试材料的 RAPD 扩增电泳图谱
Fig11 RAPD patterns with 12 primers on 13 alfalfa cultivars
泳道 1 :DNA Marker DL2 000 + 15 000 ;泳道 2～14 :优克21465、猎人河、德宝、爱库勒、
三得利、德福、GT13R、牧歌 701、路宝、射手 2 号、牧歌 702、爱博、射手。
Lane 1 :DNA Marker DL2 000 + 15 000 ;Lane 2 - 14 :UC21465 ,Hunter River ,Derby ,Acrora ,Sanditi ,DEFI ,13R Supreme ,
Ameri Graze 701 ,Lobo ,Archer Ⅱ,Ameri Graze 702 ,Arriba ,Archer1
212 弱秋眠性紫花苜蓿 RAPD 多态性分析
对 30 个引物进行多态性筛选 ,均能产生多态性
带 ,其中有 12 条引物对 13 个 DNA 样本扩增后都能
得到清晰的扩增带 ,所得 RAPD 电泳图谱见图 1。
对这 12 条引物的扩增结果进行统计分析 ,结果见表
3。由表 3 可见 ,每个引物都获得了基因组 DNA 指
946 第 5 期 毕玉芬等 :利用 RAPD 技术研究弱秋眠性紫花苜蓿遗传多样性
纹图谱 ;不同引物对不同材料的指纹图谱和扩增条
带数差异很大 ;同一引物在不同材料上具有不同的
指纹图谱 , 12 个引物中 ,扩增带数最少的引物是
S226 ,带数变幅为 1～4 ,扩增带数最多的是 S311 ,带
数变幅为 2～10 ,其次是引物 S192、S208、S1394 ;同
一材料 ,不同引物扩增条带数也具差异 ,最大的变幅
为 1～10 ,最小的为 1～7。此外 ,统计了特有带的数
目 (特有带为某个弱秋眠性紫花苜蓿品种 DNA 所
特有的而其他品种不具备) ,在 13 个 DNA 样本中
只有 GT13R、牧歌 701、路宝和牧歌 702 没有出现特
有带 ,其余 9 个品种均出现了特有带 ,其百分率见表
3。
表 2 引物对供试材料的扩增结果
Table 2 Amplif ied results of RAPD with 12 primers among thirteen alfalfa samples
引物名称
Name of the
prime
序列
Prime sequence
(5′→3′)
标记数
Number of
amplified bands
多态数
Number of
polymorphic bands
多态频率
Frequency of
polymorphic bands( %)
S192 CTGGGCTGAC 10 9 90
S208 AACGGCGACA 14 14 100
S226 ACGCCCAGGT 4 3 75
S311 GGAGCCTCAG 12 11 91167
S407 CCGTGACTCA 11 9 81182
S485 CCGCGTCTTG 11 11 100
S1222 GTCCTCGTGT 11 11 100
S1394 AACGGGCCAA 13 12 92131
S1404 GGCACGCGTT 12 11 91167
S1407 GTAAACCGCC 11 11 100
S1439 AGTCCGCCTG 6 5 83133
S1474 GAGAGGCTCC 11 9 81182
总数 Total 12 126 116 92106
表 2 列出了最后的扩增结果。在全部供试材料
中总共扩增出 126 条带 ,引物 S208、S485、S1222、
S1407 扩增出的带均为多态性条带。在所有扩增带
中 ,只有 10 条带是共有的 ,引物 S192、S226、S311、
S1394、S1404、S1439 中各有 1 条 ,引物 S407、S1474
中有 2 条。共有带仅占总扩增带的 7194 % ,多态性
程度高达 92106 % ,远高于中国紫花苜蓿地方品种
(70168 %) [ 9 ] 。
213 13 个弱秋眠性紫花苜蓿品种间的遗传距离和
聚类分析
13 个弱秋眠性紫花苜蓿品种间的遗传距离见
表 4。从表 4 中可以看出 ,射手与 GT13R 之间的遗
传距离最大 (7168) ,路宝与GT13R之间的遗传距离 最小 ( 5100 ) 。其次为德福与德宝、牧歌 701 与GT13R 之间遗传距离较小 (均为 5157) 。13 个品种之间的平均遗传距离为 6159。从图 2 可以直接反映出这 13 种弱秋眠性紫花苜蓿品种的亲缘关系 ,GT13R 与路宝的亲缘关系最近 ,首先聚为一类 ;其次是德宝和德福聚为一类 ;优克21465 和射手 2 号 ,爱博和射手 ,猎人河和三得利依次聚为一类。当以欧氏距离为 615 来划分时 ,可将 13 份材料聚成 3 个复合组 ,第一组为优克21465、射手 2 号、GT13R、路宝、牧歌 701、牧歌 702 ;第二组为猎人河、三得利、德宝、德福、爱库勒 ;第三组为爱博和射手。这 3 个组是彼此相异的类元 ,每一类元中汇集了彼此相似的小群。
表 3 引物对每份供试材料扩增出的条带数及特有带数
Table 3 Number of Bands of RAPD with 12 primers among thirteen alfalfa samples
引物
Primer
条带数 Number of bands
7 40 34 41 35 36 16 21 10 42 15 39 20
变幅
Range
S192 7 6 2 1 4 2 5 8 9 8 3 3 4 1 - 9
S208 4 6 5 7 7 5 8 9 9 7 7 8 8 4 - 9
S226 3 2 2 2 4 2 2 3 1 2 3 2 2 1 - 4
S311 4 4 2 2 3 5 9 8 10 8 6 10 4 2 - 10
S407 7 7 6 4 7 7 7 6 7 6 4 7 4 4 - 7
S485 5 7 4 5 8 6 3 6 3 5 4 1 3 1 - 8
S1222 1 1 2 2 5 4 5 3 6 2 7 6 4 1 - 7
S1394 4 9 9 7 7 9 6 5 5 7 5 7 3 3 - 9
S1404 6 4 2 5 3 1 2 1 1 5 6 7 8 1 - 8
S1407 7 7 4 4 7 6 6 2 7 6 5 6 3 2 - 7
S1439 3 5 4 3 1 3 3 2 1 2 4 4 1 1 - 5
S1474 4 8 6 5 5 7 4 4 4 5 4 4 3 3 - 8
总数 Total 55 66 48 47 61 57 60 57 63 63 58 65 47 47 - 66
特有带
Peculiar fragment 1 2 1 3 2 3 0 0 0 1 0 2 1 1 - 3
特有带百分数
% of peculiar fragment 1182 3103 2108 6138 3128 5126 0 0 0 1159 0 3108 2113 0 - 5126
056 作 物 学 报 第 31 卷
表 4 13 个弱秋眠性紫花苜蓿品种间的欧氏遗传距离
Table 4 Genetic distances ( Euclidean distances) among thirteen alfalfa samples
UC21465 Hunter Derby Acrora Sanditi DEFI 13RSupreme AmeriGraze 701 Lobo Archer Ⅱ AmeriGraze 702 Arriba Archer
UC21465 0100
Hunter 6108 0100
Derby 5192 6100 0100
Acrora 7100 6163 6100 0100
Sanditi 6163 6125 6125 7114 0100
DEFI 6116 6156 5157 6156 6132 0100
13R Supreme 5192 6178 6132 6163 6171 5192 0100
Ameri Graze 701 6148 6186 6108 6171 6132 6132 5157 0100
Lobo 6132 7128 7100 7128 6193 6148 5100 5166 0100
Archer Ⅱ 5183 6156 6140 7114 7107 6148 5192 5166 6132 0100
Ameri Graze 702 6140 6178 6163 6163 6156 6186 5183 6171 6186 6171 0100
Arriba 6193 7100 6171 7128 7121 6193 6171 7107 6148 6163 6140 0100
Archer 7121 7114 7100 7100 6193 7148 7168 7135 7121 7121 7114 6100 0100
3 讨论
311 品种的遗传多样性水平或遗传变异程度 ,可以
通过 RAPD 扩增片段的多态百分比来衡量。本试
验对 13 个弱秋眠性紫花苜蓿进行了 RAPD 分析 ,
从 30 个引物中筛选出扩增效果良好的 S192、S208、
S226、S311、S407、S485、S1222、S1394、S1404、
S1407、S1439 和 S1474 共 12 个引物 ,可直接用于苜
蓿种质资源的 RAPD 研究。12 个引物在 13 份材料
中共产生分子量不同的 126 个 RAPD 标记 ,其中单
态性条带 10 条 ,占 7194 % ,多态性条带 116 条 ,占
92106 %。RAPD 的分析结果表明弱秋眠性紫花苜
蓿的多态性高达 92106 % ,远高于中国紫花苜蓿地
方品种 (70168 %) 。从 DNA 分子水平证明了弱秋
眠性紫花苜蓿种质资源具有较高的遗传多样性和较
复杂的遗传背景 ,是一类具有较大开发潜力的苜蓿
基因类群。弱秋眠性苜蓿如此高的多态性 ,说明其
品种具有丰富的遗传基础 ,其遗传保守性可能较差 ,
或具有更广泛的适应潜力和开发价值。另外 ,本试
验所选用的 13 份苜蓿品种来自不同国家 ,其丰富的
遗传背景可能与选育国家生态环境的差异有关。另
一方面 ,共有带的存在也说明弱秋眠性紫花苜蓿之
间的共同性。通过遗传距离及非加权组平均法聚类
的结果表明 ,弱秋眠性紫花苜蓿在遗传上即具有一
定的一致性 ,又具有各自独立的遗传性 ,遗传背景丰
富。本试验对 13 份供试材料的 RAPD 分析、遗传
距离和聚类结果 ,为云南省今后进一步引进、利用优
质弱秋眠性紫花苜蓿种质资源 ,丰富种质资源信息
库 ,培育新良种提供了分子生物学依据。
图 2 13 份弱秋眠性紫花苜蓿 RAPD 分析聚类图
Fig12 Dendrogram of thirteen alfalfa samples UPGMA
156 第 5 期 毕玉芬等 :利用 RAPD 技术研究弱秋眠性紫花苜蓿遗传多样性
312 本试验利用筛选到的 12 条引物在 13 个 DNA
模板中共检测到 126 条扩增片段 ,公共带 10 条 ,多
态率为 92106 % ,并出现了特有带。说明 RAPD 技
术可以产生大量的多态 DNA 标记 ,通过这些标记
可对弱秋眠性紫花苜蓿品种的遗传结构差异进行分
析。
313 由于 RAPD 反应体系很小 ,所以对实验的精
确程度要求很高 ,对各项成分浓度要求十分严格 ,稍
有差错 ,便不能进行扩增。因此 ,在试验操作中 ,在
各模板浓度一致的前提下 ,各反应成分的混合成为
关键。在初步接触 RAPD 技术时 ,会使试验者感到
其不稳定性 ,但随着对该项技术不断熟练的掌握和
对实验条件的严格控制 , RAPD 技术能够获得较好
的重复结果。
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