全 文 ：　
第 29 卷 第 2 期 作　物　学　报 V ol. 29, N o. 2
2003 年 3 月　 295～ 299 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA pp. 295～ 299　M ar. , 2003
花生种子胰蛋白酶抑制剂与抗黄曲霉侵染的关系α
梁炫强1　潘瑞炽2　周桂元1
(1广东省农科院作物研究所, 广东广州 510640; 2 华南师范大学生物系, 广东广州 510631)
摘　要　通过丙酮分级沉淀和D EA E2Sephadex A 50 离子交换柱, 从花生种子醋酸提取液中分离纯化出具有胰蛋白酶
抑制剂活性的物质。SD S2PA GE 电泳图谱显示, 纯化的胰蛋白酶抑制剂是以二聚体形式存在, 分子量分别为 17. 1 和
10. 3 kD a, 纯化的胰蛋白酶抑制剂在体外能显著地抑制黄曲霉 (A sp erg illus f lavus)孢子的萌发和菌丝的生长, 表明胰蛋
白酶抑制剂是花生种子抗黄曲霉的有效成分。种子胰蛋白酶抑制剂含量的多少、活性的高低与品种抗黄曲霉侵染的能
力有关。5 个抗性品种胰蛋白酶抑制剂的含量和活性均高于感病品种, 且抗性品种胰蛋白酶抑制剂粗提液体外抑菌效
果也较感病品种显著, 表明花生种子胰蛋白酶抑制剂含量和活性可作为花生抗黄曲霉侵染的标记性状之一。
关键词　花生; 种子; 胰蛋白酶抑制剂; 黄曲霉; 侵染
中图分类号: S565　　　文献标识码: A
Rela tion sh ip of Trypsin Inh ibitor in Peanut Seed and Resistance to Asperg illus
f lavus Inva sion
L IAN G Xuan2Q iang1　PAN R ui2Ch i2　ZHOU Gui2Yuan1
(1 C rops R esearch Institu te, Guangd ong A cad em y of A g ricultural S ciences, Guangd ong Guangzhou 510640; 2B iology D epartm ent, S outh China
N orm al U niversity , Guangd ong Guangzhou 510631, China)
Abstract　A tryp sin inh ibito r in peanut seeds w as purified by acetone fractionation, fo llow ed by passing
th rough D EA E2Sephadex A 50 ion2exchange co lum n. T he purified inh ibito r consisted of two subun its w ith
molecular w eigh t of 10. 3 and 17 kD a respectively. T he inh ibition of germ ination and hypha grow th of
A sp erg illus f lavus w as observed in p ro tein concen tration 10 Λg on Czapek m edium. T he con ten t and activity of
tryp sin inh ibito r in peanut seedsw ere co rrelated w ith it′s resistance to A sp erg illus f lavus invasion and aflatox in
p roducing. T he con ten t and activity of tryp sin inh ibito r in resistan t geno types w ere sign ifican tly h igher than
that in suscep tible geno types.
Key words　Peanut; Seed; T ryp sin Inh ibito r; A sp erg illus f lavus; Invasion
　　胰蛋白抑制剂 (T I) 是能够抑制蛋白质水解酶
活性的一类多肽或蛋白质, 普遍存在于植物中[ 1 ]。
种子含有丰富的 T I, 报道最多的是豆科、茄科、禾
本科及十字花科等植物[ 2, 3 ]。有关 T I对植物的抗虫
作用已有大量的研究报道, 并确认其在植物抗虫方
面的作用[ 3 ]。但对 T I 在植物抗病中的作用研究还
很少。Peng 等[ 4 ]发现致病疫霉可诱导番茄叶片 T I
含量的增加, 且抗性品种 T I 增加量是感病品种的
几倍。马铃薯的 T I 能抑制从病斑中分离的病原微
生物的生长。这些研究表明 T I 与植物的抗病性有
一定的关系。
近年来, T I 在抗黄曲霉侵染和产毒中的作用
引起人们的关注。Chen 等[ 1 ]分析 13 个玉米品种种
子的 T I时发现, 7 个抗黄曲霉侵染品种的 T I 含量
明显高于 6 个感病品种, 且从抗性种子中分离纯化
的 14 kD a T I 在体外能够抑制黄曲霉 (A sp erg illus
f lavus) 孢子萌发和菌丝生长, 并认为 14 kD a 的 T I
可作为玉米抗黄曲霉育种的分子标记。在随后的研
究认为 T I 的作用主要是抑制A . f lavus 分泌的 Α2
淀粉酶活性, 从而阻断 A . f lavus 生长所需的碳α 基金项目: 国家“863”计划 (2001AA 241153) , 广东省自然科学基金项目 (010113)资助项目
作者简介: 梁炫强 (19642) , 博士, 研究员, 从事花生遗传育种研究。
Received on (收稿日期) : 2002204203, A ccep ted on (接受日期) : 2002206215

源[ 5 ]。
有关花生 T I分离纯化及生物生化特征已有研
究报道[ 6 ] , 但花生种子的 T I 是否也与抗黄曲霉侵
染和产毒素有关, 迄今尚未见报道。
本节主要探讨花生种子的 T I 与抗黄曲霉侵染
的关系, 以及抗2感品种胰蛋白酶抑制剂含量和活
性与抗性的关系如何, 花生种子中的 T I 能否作为
花生抗黄曲霉育种的辅助育种工具。
1　材料与方法
1. 1　材料
共 9 个, 其中 5 个抗黄曲霉菌侵染的花生品种
为 J 211、V RR 245、P I337494、U F71513 和湛秋 48,
以及 4 个高感染侵染花生品种粤油 5、粤油 114、湛
油 30 和汕油 523。黄曲霉菌株A s. 2890 引自中国科
学院微生物研究所。
1. 2　花生胰蛋白酶抑制剂提取和纯化
参照杨晓泉[ 6 ]方法, 取花生干种子除去种皮,
用液氮冷冻干燥后研磨成粉, 按 10 mL ög 花生粉加
入正己烷, 在- 20℃中脱脂过夜, 离心后倾去正己
烷, 风干后备用。
脱脂花生粉用 50 mmolöL 醋酸提取过夜,
15000×g 离心 15 m in, 上清液用 6 molöL HC l 调至
pH 3. 0, 加等体积丙酮沉淀 (- 20℃) , 4℃ 10000×
g 离心 20 m in, 弃沉淀。上清液用 6 molöL N aOH
调 pH 7. 0, 滤纸过滤, 滤液加入- 30℃丙酮至 90%
(vöv) 终浓度, 于 10000×g 离心 15 m in。沉淀冰冻
干燥后按 10 göL 比例溶于 25 mmolöL T ri2HC l
(pH 8. 0)缓冲液。过D EA E2Sephadex A 50 柱 (50 cm
×25 cm ) , 用 200 mL 25 mmolöL T ri2HC l(pH 8. 0)
洗脱未结合蛋白, 流速为 0. 35 mL öm in。再用含
0. 2 molöL N aC l 的 25 mmolöL T ri2HC l(pH 8. 0) 洗
脱液作线性洗脱, 每管收集 5 mL , 用紫外分光光度
计测OD 280nm , 并采用方法 1. 3 测定胰蛋白酶抑制剂
的活性。合并有活性的试管, 并在双蒸水中透析过
夜 (4℃) , 加入 10 倍体积的冷丙酮, 离心收集即获
胰蛋白酶抑制剂纯品。
1. 3　胰蛋白酶抑制剂活性测定
参照 Sm ith 等[ 7 ]方法。胰蛋白酶活性测定采用
苯甲酰2DL 2精氨酸2对硝基苯胺 (BA PNA ) 为底物。
牛胰蛋白酶 (250 U öm g) 500 Λg 溶于 200 ΛL 50
mmolöL T ris2HC l(pH 7. 5 含 20 mmolöL CaC l2)缓冲
液, 加入 1 mL 1 mmolöL BA PNA , 37℃水浴 10
m in, 加入 200 ΛL 30% (vöv) 醋酸中止反应, 410
nm 测定吸收值 (本试验中牛胰蛋白酶的活性为
0. 12 ∃A 410·m g- 1·m in - 1, ∃A 410为 410 nm 的吸收
差值)。花生胰蛋白酶抑制剂粗提物以适当的比例
溶于双蒸水 (以抑制 50%～ 60% 为宜)中, 与牛胰蛋
白酶溶液等量混合后于 37℃水浴 10 m in, 测定残留
胰蛋白酶活性。以未加花生胰蛋白酶抑制剂粗提物
的处理为对照。
1. 4　胰蛋白酶抑制剂纯度和分子量的检测
纯化效果采用 SD S2PA GE 方法分析, 分离胶
浓度为 12% , 浓缩胶为 4% , 100 mA 恒流电泳2. 5
h。低分子量标准蛋白 (上海丽珠东风生物技术公
司) 分子量为97. 4、66. 2、43. 0、31. 0、20. 1和14. 4
kD a。
1. 5　胰蛋白酶抑制剂对黄曲霉孢子萌发和菌丝生
长的抑制作用
纯化和 90% 丙酮沉淀的胰蛋白酶抑制剂粗提
物用 0. 5 molöL 磷酸缓冲液 (pH 7. 0) 配制成 0. 5
m gömL 蛋白液, 并与 A sp erg illus f lavus 孢子液 (1
×106ömL ) 等体积混合后, 取 20 ΛL 滴在预先配制
好的察氏培养基上, 一天后观察菌落生长情况。以
0. 5 molöL 磷酸缓冲液 (pH 7. 5)作对照。
配制察氏培养基, 高压灭菌后冷至 40℃时, 将
A . f lavus 孢子液加入培养基中并使孢子浓度达到 1
×104ömL , 在 25℃下黑暗培养过夜。将灭菌的圆状
层析纸 (直径为 7 mm ) 置于培养基表面, 在层析纸
上加 20 ΛL 部分纯化胰蛋白酶抑制剂 (0. 5 m gö
mL ) , 在 25 ℃下黑暗培养, 48 h 后观察抑菌情况。
磷酸缓冲液 (10 mmolöL , pH 7. 0)为对照。
2　结果与分析
2. 1　花生种子胰蛋白酶抑制剂的纯化和分子量测
定
花生种子 50 mmolöL 醋酸提取液具有较高的
胰蛋白酶抑制剂活性, 再用 50% 和 90% 丙酮分级
沉淀可使其纯度提高 15 和 26 倍。90% 丙酮沉淀所
获胰蛋白酶抑制剂粗提取物约占种子的 0. 2% (w ö
w )。粗提取物经D EA E2Sephadex A 50 柱后, 收集
的具有活性部分经 SD S2PA GE 电泳出现两条带,
这表明花生胰蛋白酶抑制剂以二聚体形式存在, 与
前人报道是一致[ 5 ] , 提取和纯化的胰蛋白酶抑制剂
达到电泳纯。纯化胰蛋白酶抑制剂二个组分的分子
量分别为 17. 1 和 10. 3 kD a (图 1)。
692　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　29 卷

图 1　　花生种子纯化的胰蛋白酶抑制剂 SDS2PA GE 图谱
M. 标准蛋白; A. 纯化的胰蛋白酶抑制剂;
B. 90% 丙酮沉淀蛋白
F ig. 1　　SDS2PA GE patterns of purified and crude
extracts of tryp sin inh ibito ry of peanut seeds
M. standard p ro teins; A. purified tryp sin inh ibito ry;
B. 90% (vöv) acetone fractionation
2. 2　胰蛋白酶抑制剂对黄曲霉孢子萌发和菌丝生
长的抑制作用
取纯化和 90% 丙酮沉淀的胰蛋白酶抑制剂, 用
0. 5 molöL 磷酸缓冲液 (pH 7. 0) 配制成 0. 5 m gömL
蛋白液, 并与A . f lavus 孢子液 (1×106ömL ) 等体
积混合后, 取 20 ΛL 滴在预先配制好的察氏培养基
上, 一天后观察菌落生长情况。从图 2 可见, 培养
一天后, 对照组的黄曲霉孢子迅速萌发, 并产生白
色菌落, 而含 90% 丙酮沉淀蛋白的菌落较小, 含纯
化胰蛋白酶抑制剂的菌落最小, 这表明花生胰蛋白
酶抑制剂能明显地抑制A . f lavus 孢子的萌发。
将 20 ΛL 纯化的胰蛋白酶抑制剂 (0. 5 m gömL )
滴在已灭菌圆状层析纸 (直径为 7 mm ) 上, 培养两
天可观察清晰抑菌圈的产生 (图 3A ) , 而蒸馏水和
缓冲液对照组没有产生抑菌圈, 表明花生胰蛋白酶
抑制剂能抑制A . f lavus 菌丝的生长。
2. 3　抗2感花生品种种子胰蛋白酶抑制剂剂含量的
差异
为了探讨花生种子胰蛋白酶抑制剂与抗侵染和
产毒素的关系, 采用 50 mmolöL 醋酸提取液提取抗2感9个品种种子蛋白 , 并进行SD S 2PA GE电泳 ,
图 2　　花生胰蛋白酶抑制剂对A . f lavus
孢子萌发的抑制效果
A. 纯化的胰蛋白酶抑制剂; B. 90% 丙酮沉淀;
CK. 0. 5 mmolöL 磷酸缓冲液
F ig. 2　　 Inh ibition of tryp sin inh ibito ry from peanut
seeds to A . f lavus spores germ ination
A. Purified tryp sin inh ibito ry; B. 90% (vöv) acetone
fractionation; CK. Buffer contro l
图 3　　花生胰蛋白酶抑制剂对A . f lavus
菌丝生长的抑制效果
A. 纯化的胰蛋白酶抑制剂; B. 0. 5 mmolöL 磷酸
缓冲液 (CK1) ; C. 蒸馏水 (CK2)
F ig. 3　　 Inh ibition of tryp sin inh ibito ry from
peanut seeds to A . f lavus hypha grow th
A. Purified tryp sin inh ibito ry; B. Buffer
contro l (CK1) ; C. D istilled w ater (CK2)
7922 期　　　　　　　　　　　　梁炫强等: 花生种子胰蛋白酶抑制剂与抗黄曲霉侵染的关系　　　　　　　　　　　　　　

蛋白图谱采用B io21D + + V ersion99 软件对其在各
自品种中的含量百分比 (% ) 进行分析, 结果所有抗
性品种种子胰蛋白酶抑制剂的含量均比感病品种高
(表 1) , 且达显著水平。除了U F71513 外, 4 个抗
性品种胰蛋白酶抑制剂的相对含量高出 10 个百分
点, 其中湛秋 48 和V RR 245 种子的胰蛋白酶抑制
剂相对含量最高, 达 18. 88% 和 18. 51%。
表 1　　抗-感花生品种种子胰蛋白酶抑制剂的相对含量
Table 1　　The quantitation of the relative content trypsin
inh ibitory band in the tota l prote in extracts of 50 mmolöL
acetic ac id from 9 genotypes based on analysis of
15% SDS-PAGE prof iles af ter sta in ing with
Coomassie br il l iant blue R-250
品种
V ariety
对黄曲霉反应
Response to
A . f lavus
含量
Content
(% )
湛秋 48　Zhanqiu 感病 (S) 18. 88 a3
VRR245 感病 (S) 18. 51 a
P I337494 感病 (S) 15. 47 ab
J211 感病 (S) 12. 33 ab
U F71513 抗 (R ) 10. 67 b
粤油 5　Yueyou 5 抗 (R ) 7. 18 b
汕油 523　Shanyou 523 抗 (R ) 6. 42 b
粤油 114　Yueyou 114 抗 (R ) 6. 42 b
湛油 30　Zhanyou 30 抗 (R ) 6. 2 b
　　3 a= 0. 05。
2. 4　抗2感花生品种种子胰蛋白抑制剂剂活性的比
较
采用 90% 丙酮沉淀所获的胰蛋白抑制剂粗提
取物比较抗性和感病品种胰蛋白抑制剂活性的差
异。结果表明从所有抗性品种种子中提取的胰蛋白
抑制剂的活性都比感病品种高。其中以 P I337494
和湛秋 48 的活性最高。
2. 5　抗-感花生品种种子胰蛋白酶抑制剂体外抑制
A. f lavus 效果的比较
取抗2感 9 个品种胰蛋白酶抑制剂粗提取物各
20 ΛL (0. 5 m gömL ) 进行体外抑菌试验, 结果表明
从抗性品种提取的胰蛋白抑制剂粗提取物所产生的
抑菌圈均比感病品种的大 (见表 2) , 这与抗性品种
胰蛋白抑制剂的含量和活性均比感病品种高有关。
3　讨论
本试验结果显示, 从花生种子分离纯化的胰蛋
白酶抑制剂是以二聚体形式存在, 二个组分的分子
量分别为 17. 1 和 10. 3 kD a, 与杨晓泉[ 6 ]的报道有
一些差异。纯化的胰蛋白酶抑制剂在体外能显著地
抑制A . f lavus 孢子的萌发和菌丝的生长, 表明花
生种子中的胰蛋白抑制剂是抗黄曲霉的有效成分,
与玉米的研究报道相符[ 1 ]。
花生种子中 T I 含量的多少、活性的高低与品
种抗黄曲霉侵染的能力有关。试验结果显示, 5 个
抗性品种 T I 的含量和活性均高于感病品种, 且抗
性品种 T I 粗提液体外抑菌效果较感病显著。表明
种子 T I 含量可作为花生抗黄曲霉侵染的标记性状
之一。
花生种子中T I抑制黄曲霉的机制目前尚未清
图 4　　抗2感品种种子胰蛋白抑制剂活性比较图
1. P I337494; 2. 湛秋 48; 3. VRR245; 4. U F71513; 5. J211;
6. 汕油 523; 7. 湛油 30; 8. 粤油 114; 9. 粤油 5
F ig. 4　　The comparison of tryp sin inh ibito r activities
among resistant and suscep tible genotypes
1. P I337494; 2. J211; 3. VRR 245; 4. U F71513; 5. Zhanqui 48;
6. Shanyou 523; 7. Zhanyou 30; 8. Yueyou 114; 9. Yueyou 5
表 2　　抗-感品种胰蛋白酶抑制剂粗提物体外抑菌效果的比较
Table 2　　Antifungal bioassay of crude trypsin inh ibitor preparations of kernel form resistantösusceptible
var ieties aga inst A. f lavus at 48h af ter incubation
品种
V ariety
湛油
30
粤油
114
汕油
523
粤油
5 U F71513 J211 P I337494 VRR245 湛秋48 W ater(ck1) Buffer(ck2)
抑菌圈直径
(mm ) 7. 4 7. 2 7. 4 7. 3 7. 7 7. 8 7. 9 7. 9 8. 2 7. 0 7. 0
892　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　29 卷

楚。黄曲霉在侵染花生过程中, 要依赖分泌胞外角
质酶来降解表皮的角质[ 8 ] , 分泌弹性蛋白酶来降解
花生组织的弹性蛋白[ 9 ] , 和分泌 Α2淀粉酶来水解碳
水化合物[ 5 ] , 才能获得其生长和增殖所需的碳源和
氨基酸。而花生种子体内蛋白酶抑制剂的作用是抑
制这些酶活性, 阻止黄曲霉蛋白酶对花生组织的降
解, 使黄曲霉营养不足, 生长和增殖受限, 侵染与
扩展受阻, 从而达到抗病的目的。
References
[ 1 ]　Chen Z Y, B row n R L , L ax A R et al. Resistance to A sperg illus
f lavus in corn kernels is associated w ith a 142kDa p ro tein,
P hy topathology , 1998, 88: 276～ 281
[ 2 ]　W en F2D (文方德) , Fu J2R (傅家瑞). P ro teinaceous p ro tease
inh ibito rs and their physio logical functions in p lant seed. P lant
P hy siology Comm unications (植物生理学通讯) , 1997, 33 (1) :
1～ 9
[ 3 ]　W ang J2S (王金生). P hy siolog ical and M olecular P lant
P athology (分子植物病理学 ). Beijing: China A gricultural
P ress, 1998
[ 4 ]　Peng J H , B lack L L. Increased p ro teinase inh ibito r activity in
response to infection of resistance tom ato p lants by P hy toph thora
inf estans. P hy topathology , 1976, 66: 958～ 963
[ 5 ]　Chen Z Y, B row n R L , Russin J S. A corn tryp sin inh ibito r
w ith antifungal activity inh ibits A sperg illus f lavus Α2am ylase.
P hy topathology. 1999, 89: 902～ 907
[ 6 ]　Yang X2Q (杨晓泉) , W en F2D (文方德) , Zhang S2H (张水华)
et al. Purification and inactivation of tryp sin inh ibito r from
peanut (A rach is hy pogaea L. ). A cta N utrim enta S cinica (营养学
报) , 1998, 20 (3) : 337～ 342
[ 7 ]　Sm ith C, M egen W V , H itchcock. C. The determ ination of
tryp sin inh ibito r levels in foodstuffs. J S ci Food A g ric, 1992,
33: 165
[ 8 ]　Guo B Z, Russin J S, C leveland T E. Evidence for cutinase
p roduction by A sperg illus f lavus and its possible ro le in infection
of corn kernels. P hy topathology , 1996, 86 (8) : 824～ 829
[ 9 ]　M ellon J E, Cotty P J. Purification and partial characterization
of an elastino lytic p ro teinase from A sperg illus f lavus culture
filtrates. A pp lied M icrobiology and B iotechnology , 1996, 46
(2) : 138～ 142
《植物遗传资源学报》征订启事
《植物遗传资源学报》是中国农业科学院作物品种资源研究所和中国农学会遗传资源分会联合主办的专
业性学术期刊, 由中国工程院院士董玉琛研究员担任主编, 2000 年创刊, 2003 年始向国内外公开发行。报道
内容: 大田、园艺作物, 观赏、药用植物、林用植物、草类植物及其一切经济植物的有关植物遗传资源研究
成果和高水平综述或评论。诸如: 种质资源的考察、收集、保存、评价、利用、创新、信息学、管理学等; 以
及起源、演化、分类等系统学; 基因发掘、鉴定、克隆、基因文库建立、遗传多样性研究等。
读者对象: 从事植物遗传资源科学研究工作的人员, 各有关大专院校的师生, 农业行政和推广人员。
季刊, 大 16 开本, 96 页。定价 10 元, 全年 40 元。自办发行, 可直接向编辑部办理订阅手续, 如需邮
挂每期另加 2 元。
地址: 100081 北京市中关村南大街 12 号
《植物遗传资源学报》编辑部
电话: 010262186657　　62180257
传真: 010262180279
9922 期　　　　　　　　　　　　梁炫强等: 花生种子胰蛋白酶抑制剂与抗黄曲霉侵染的关系