全 文 ：Vol. 30 , No. 2
pp. 126～130 　Feb. , 2004
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 30 卷 第 2 期
2004 年 2 月 　126～130 页
小麦 Glu2D3 和 Glu2B3 位点 LMW2GS 基因特异引物设计与 PCR扩增
赵惠贤1 　郭蔼光1 　胡胜武2 　范三红1 　张大鹏1 　任思霖1 　王瑞娟1 Ξ
(1 西北农林科技大学生命科学院 ,农业分子生物学重点实验室 ,陕西杨凌 712100 ;2 西北农林科技大学农学院 ,陕西杨凌 712100)
摘 　要 　用 CTAB 法提取小麦基因组 DNA ,根据 GenBank 中公布的已知 LMW2GS 基因序列 ,设计并合成染色体位点特异
PCR引物 1～7 ;利用特殊小麦材料 ———六倍体普通小麦阿勃二体、1A、1B 和 1D 缺体 ,四倍体小麦及二倍体的一粒小麦和
节节麦的基因组 DNA 为模板 ,在优化的 PCR 体系下进行特异性扩增和引物验证。结果表明 :引物 3 和引物 4 为小麦谷
蛋白 Glu2D3 位点 LMW2GS 基因特异 PCR 引物 ,用其进行扩增时 ,循环反应条件为 :94 ℃变性 1 min , 62 ℃退火 1 min ,72 ℃
延伸 2 min。扩增产物大小约 1. 60 kb ,包括了启动子和完整编码区。引物 5 和 7 为小麦谷蛋白 Glu2B3 位点 LMW2GS 基因
特异 PCR 引物 ,用其进行扩增时 ,循环条件为 :94 ℃变性 1 min ,64 ℃退火 1 min ,72 ℃延伸 2 min。扩增产物大小约 1. 45 kb
左右 ,包括了启动子和完整编码区。此外 ,用引物 3 和 4 通过 PCR 技术克隆到小偃 6 号小麦 Glu2D3 位点 LMW2GS 基因
(登录号为 AY263369) ;该基因编码的 LMW2GS 含 9 个 Cys 残基。这是首次发现含 9 个 Cys 残基的 LMW2GS 基因。它可能
是小偃 6 号加工品质优良的主要原因之一。
关键词 　普通小麦 ;特异染色体位点 ;低分子量麦谷蛋白基因 ;PCR
中图分类号 :S512
Development of Primers Specif ic for LMW2GS Genes at Glu2D3 and Glu2B3 Loci
and PCR Amplif ication
ZHAO Hui2Xian1 , GUO Ai2Guang1 , HU Sheng2Wu2 , FAN San2Hong1 , ZHANG Da2Peng1 ,REN Si2Lin1 , WANG Rui2Juan1
(1 Key Lab of Agricultural Molecule Biology , College of Life Sciences , Northwester Sci2Tech , University of Agriculture and Forestry , Yangling 712100 , Shaanxi ;
2 College of Agronomy , Northwester Sci2Tech , University of Agriculture and Forestry , Yangling 712100 , Shaanxi , China)
Abstract 　The genomic DNA was extracted from wheat cultivars using CTAB method. Based on the known LMW2GS gene
sequences reported in GenBank , the primer 1 - 7 for specific chromosome locus LMW2GS genes were designed and synthe2
tized. Using of the genomic DNA from special wheat germplasm , including hexapliod wheat Abbozanida disome ,1A , 1B
and 1D nullisomes of Abbozanida ,diploid and tetraploid wheat as template , amplified specific locus LMW2GS genes under
the optimal reaction system to test these primers. The results showed that , Primer 3 and 4 were the specific for LMW2GS
genes at Glu2D3 locus in wheat ,its cycling reaction profile was : 1 min at 94℃, 1 min at 62 ℃,2 min at 72 ℃. The size
of the PCR product was about 1. 60 kb , including promoter and the whole CDS. While primer 5 and 7 were the specific for
the LMW2GS genes at Glu2B3 locus in wheat ,its cycling reaction profile was : 1 min at 94℃ ,1 min at 64 ℃,2 min at
72 ℃. The size of the PCR product was about 1. 45 kb , including promoter and the whole CDS. Moreover ,LMW2GS coden
by cloned gene at Glu2D3 locus of Xiaoyan No. 6 contained 9 Cys residues. It was the first time to find a gene of LMW2GS
with 9 Cys residues. This may be one of the major reasons that Xiaoyan No. 6 has good processing quality.
Key words 　Triticum aestivum L. ; Specific chromosome locus ; LMW2GS gene ; PCR
　　小麦种子麦谷蛋白是由高分子量麦谷蛋白亚
基 (HMW2GS) 和低分子量麦谷蛋白亚基 (LMW2GS)
组成。它们分别由第一同源群染色体长臂上 Glu21 位点 (即 Glu2A1、Glu2B1、Glu2D1 位点 ) 和短臂上Glu23 位点 (即 Glu2A3、Glu2B3、Glu2D3 位点) 基因编码 ,二者对小麦加工品质均有重要影响。有关小麦Ξ基金项目 :杨凌农业生物技术育种中心项目 (1994214)和国家转基因植物研究与产业化开发专项 (J Y2032A211201)资助。
作者简介 :赵惠贤 (1965 - ) ,女 ,陕西临潼人 ,副教授 ,博士 ,主要从事生化与分子生物学教学和研究。Tel : 02927082662. E2mail : Huix2
ianzhao212 @hotmail . com
Received(收稿日期) : 2002212231 ,Accepted (接受日期) : 2003206226.

HMW2GS结构及其编码基因的研究较为深入 ,已从
小麦中克隆出多个优质 HMW2GS 基因[1 ,2 ] ,并已开
始将这些优质基因用于改良小麦品质的研究[3 ,4 ] 。
近年来关于小麦LMW2GS结构及其与加工品质关系
的研究取得了一定进展[5 ,6 ] ,但是关于普通小麦特定
染色体位点 LMW2GS 基因的研究国内外报道很少。
本研究根据 GenBank、EMBL 等库中公布的已知
LMW2GS 基因序列 ,设计合成了小麦谷蛋白 Glu2B3
位点和 Glu2D3 位点特异 LMW2GS 基因的 PCR 引物 ,
用六倍体、四倍体和二倍体小麦的基因组 DNA 为模
板 ,在优化的 PCR 体系下进行特异性扩增 ,以验证
和筛选所设计的染色体位点特异的 LMW2GS 基因的
PCR 引物。旨在为小麦优质 LMW2GS 基因及其启动
子的克隆奠定基础 ,为利用基因工程进行小麦品质
改良提供参考资料。
1 　材料与方法
1. 1 　供试材料及来源
供试材料有六倍体小麦 (染色体组为 AABBDD)
阿勃二体 (Abb) 、阿勃 1A 缺体 (1AN) 、1B 缺体 (1BN)
和 1D 缺体 (1DN) ,四倍体小麦墨西黑卡 (染色体组
为 AABB) 及二倍体的一粒小麦 (染色体组为 AA) 和
节节麦 (染色体组为 DD) 。这些材料分别由西北农
林科技大学农学院薛秀庄研究员和中国农业科学院
品种资源研究所张学勇研究员提供。此外 ,供试材
料还有我国优异小麦品种小偃 6 号。
1. 2 　试验方法
1. 2. 1 　小麦基因组 DNA 的提取 　采用 CTAB 法[7 ] 。
1. 2. 2 　染色体位点特异的 LMW2GS 基因 PCR 引物
的设计 　根据 EMBL , GenBank 等库中公布的已知
LMW2GS 基因序列 ,设计了小麦谷蛋白 Glu2B3 位点
和 Glu2D3 位点特异的 LMW2GS 基因 PCR 引物共 7
个 (表 1) ,由上海 Sangon 公司合成。
表 1 设计合成的引物及其碱基序列
Table 1 Primers synthesized and their sequences
引物
Primer
碱基序列
Base Sequences(5′—3′)
1 CACCAATCCACCATGAAGAC
2 TATCAGTAGGCACCAACTCC
3 TTGTAGAAACTGCCATCCTT
4 GTCACCGCTGCATCGACATA
5 TCCTGAGAAGTGCATGACATG
6 CCAATCCACCATGAAGACCTTC
7 GTAGGCACCAACTCCGGTGC
　　其中 ,引物 1～4 为 Glu2D3 位点 LMW2GS 基因
设计。引物 1 位于基因上游 - 12～8 bp 处 ,引物 2
位于编码区末端 ;引物 3 大致位于基因上游 - 600
bp 处 ;引物 4 大致位于终止密码子下游 73 bp 处。
引物 5～7 为 Glu2B3 位点 LMW2GS 基因设计。引物
5 位于基因上游 - 400～ - 380 bp 处 ,引物 6 位于
- 10～8 bp处 ,引物 7 位于编码区末端。
1. 2. 3 　目的基因扩增的 PCR 条件 　参考 D’ovidio
等[8 ]的方法 ,并对其 PCR 体系进行了优化。各引物
对 PCR 扩增反应条件如下 (引物 1 和 2 ,3 和 4 用反
应条件 1 ;引物 5 和 7 ,6 和 7 用反应条件 2) 。
反应条件 1 : 95 ℃预变性 1 min ;循环反应条件
为 94 ℃1 min ,62 ℃1 min ,72 ℃2 min ,反应 30 循环
后 ,再 72 ℃延伸 7 min。
反应条件 2 : 95 ℃预变性 1 min ;循环反应条件
为 94 ℃1 min ,64 ℃1 min ,72 ℃2 min ,反应 30 循环
反应后 ,再 72 ℃延伸 7 min。
1. 2. 4 　PCR 产物的回收 　PCR 反应完成后 ,经琼脂
糖凝胶电泳检测扩增片段的大小和特异性。用北京
鼎国公司的 DNA 回收试剂盒按操作指南纯化目的
片段。
1. 2. 5 　目的片段的克隆及重组子的筛选 　将回收
的目的片段克隆到 Promega 公司的 p GEM2T easy 载
体上。按照试剂盒说明书操作。用α2互补法初步筛
选重组子 ;质粒 DNA 的提取纯化用北京鼎国公司试
剂盒。质粒酶切反应参照限制性内切酶 EcoR Ⅰ试
剂盒说明书及基因工程实验指导 (郭蔼光等编写的
学生实验指导手册) 。
1. 2. 6 　PCR 产物的测序 　由上海 Sangon 公司完成。
1. 2. 7 　DNA 及氨基酸序列分析 　DNA 及推测出的
氨基酸序列的同源性分析用 NCBI 网上的 Blast 和
DNA man 软件进行。
2 　结果与讨论
2. 1 　LMW2GS 基因 PCR优化体系的建立
　　为利用设计的引物 (表 1)对小麦基因组DNA 进
行稳定的 PCR 扩增 ,对 LMW2GS 基因的 PCR 反应条
件进行了优化。确定出本实验条件下小麦 LMW2GS
基因稳定的 PCR 反应体系为 : 20μL 反应体积中 ,
Mg2 + 浓度 2. 5 mmolΠL , dNTP 浓度 200μmolΠL ,模板
DNA 量 30～60 ng ,各引物量均 50 ng , Taq 酶 0. 5 U。
2. 2 　引物的 PCR验证和筛选
根据所设计引物 1～7 的位置可预测出 ,用引物
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1 和 2 扩增出的产物将是 1D 染色体短臂 Glu2D3 位
点上 LMW2GS 基因编码区 ,用引物 3 和 4 扩增出的
产物应包括启动子和完整编码区 ;用引物 5 和 7 扩
增的产物为 1B 染色体短臂 Glu2B3 位点上 LMW2GS
基因 ,应包括启动子和完整编码区 ,用引物 6 和 7 扩
增将得到的产物只包含完整的编码区[6 ,8 ,9 ] 。
利用六倍体小麦特殊遗传材料 (阿勃二体 Abb、
1AN、1BN 和 1DN) 、四倍体小麦和二倍体一粒小麦
和节节麦的基因组 DNA 为模板 ,用不同的引物对在
上述优化的 PCR 体系下进行扩增 ,以验证我们设计
的 LMW2GS 基因的 PCR 引物是否为染色体位点特
异的。
实验结果表明 ,引物 1 和 2、引物 6 和 7 扩增产
物特异性不强 ,有 2～3 条非特异性扩增条带出现
(未附图) 。其原因可能有二 :一是 PCR 反应条件不
合适 ,有待进一步研究 ;二是这 2 对引物设计不合
理 ,它们是在 LMW2GS 基因的保守区内 ,并不是结合
在特定位点 LMW2GS 基因上 ,无法扩增出特异产物。
引物 3 和 4、引物 5 和 7 的 PCR 扩增产物电泳
结果分别如图 1 和 2 所示。
图 1 用引物 3 和 4 扩增时产物的琼脂糖凝胶
Fig. 1 Agarose gel of amplification products
obtained with primer 3 and 4
泳道 1～7 分别为 Abb、1AN、1BN、1DN、
一粒小麦、墨西黑卡和节节麦
Lane 1 —7 indicating Abbozanida disome , 1A nullisome , 1B
nullisome , 1D nullisome ,
T. urartu , Moxiheika and Ae. squarrosa , respectively
由图 1 可以看出 ,用引物 3 和 4 进行 PCR 扩增
时 ,含 1D 基因组的 Abb、1AN、1BN 和节节麦均扩增
出一条带 ,该产物约为 1 600 bp ,而不含 1D 染色体
组的 1DN、墨西黑卡和一粒小麦都未扩增出条带 ,从
而证明了引物 3 和 4 的确为 Glu2D3 位点 LMW2GS
基因特异引物。
由图 2 可以看出 ,用引物 5 和 7 进行 PCR 扩增
时 ,含 1B 基因组的阿勃二体 ,1AN、1DN 和墨西黑卡
均扩增出一条带 ,约为 1 450 bp ;而不含 1B 染色体组
的 1BN 和一粒小麦均未扩增出条带 ,从而证明了引
物 5 和 7 的确为 Glu2B3 位点 LMW2GS 基因特异
引物。
这些实验结果与我们预测的结果相吻合。这充
图 2 用引物 5 和 7 扩增时产物的琼脂糖凝胶
Fig. 2 Agarose gel of amplification products
obtained with primer 5 and 7
泳道 1 —6 分别为 Abb、1AN、1BN、1DN、墨西黑卡和一粒小麦
Lane 1 —6 indicating Abbozanida disome , 1A nullisome , 1B
nullisome , 1D nullisome , Moxiheika and T. urartu
分证明了引物 3 和 4 是小麦谷蛋白 Glu2D3 位点
LMW2GS 基因特异引物 ;引物 5 和 7 为小麦谷蛋白
Glu2B3 位点 LMW2GS 基因特异引物。该结果可以
被用于小麦优质低分子量麦谷蛋白基因及其启动子
克隆的研究。
2. 3 　PCR扩增产物的克隆
以我国优异小麦种质小偃 6 号基因组 DNA 为
模板 ,用筛选出的 Glu2D3 位点 LMW2GS 基因特异引
物 3 和 4 进行 PCR 扩增。经 1. 5 %琼脂糖凝胶电泳
及 DNA marker 标准分子量分析 ,表明为一条约 1 600
bp 的扩增单带 (图 3) 。将扩增片段回收纯化后 ,插
入 p GEM2T easy 载体上 ,得到重组质粒 ,并用 EcoR Ⅰ
酶切验证 ,获得插入片段大小正确的阳性克隆 ,将其
中一个重组质粒命名为 p GEM2XYGluD32LMWGS1。
图 3 纯化的 PCR产物电泳图谱
Fig. 3 Electrophoresis of purified PCR products
1 ,纯化的 PCR 产物 ;2 , PCR 产物 ;M ,DNA 标准分子量
Lane 1 , Purified PCR products ; Lane 2 , PCR
products ; M , DNA marker
2. 4 　克隆 DNA片段的序列分析
对 p GEM2XYGluD32LMWGS1 中 的 插 入 片 段
XYGluD32LMWGS1 进行测序 ,结果表明该片段长度
为 1 594 bp ,与 GenBank 中 Colot 等报道的小麦 Glu2
D3 位点 LMW glutenin21 D1 基因序列 (登录号为
X13306)比较同源性为 98 % ;与 Ikeda 等[10 ,11 ] 报道的
小麦 LMW2GS 基因 ( group 10 ) 序列 (登录号为
AB062876)比较同源性为 99 %。可以肯定克隆到的
序列就是 Glu2D3 位点 LMW2GS 基因。
用 DNA man 软件对测定序列进行翻译 ,结果表
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明其读码框为 606 ⋯1520 bp ; XYGluD32LMWGS1 核苷
酸序列及推测的编码氨基酸序列见图 4。该片段包
括了完整的编码区及其上游 605 bp 序列。据报道
单子叶植物谷类种子醇溶谷蛋白基因上游约 300 bp
序列即包括了胚乳特异性表达所必需的顺式元
件[9 ,12 ] 。因 此 p GEM2XYGluD32LMWGS 中 克 隆 的
DNA 片段包括了 LMW2GS 基因完整编码区及其胚
乳特异性表达启动子。已将其在 GenBank 登录 (登
录号 AY263369) 。
图 4 克隆的小偃 6 号 XYGluD32LMWGS1 基因及推测蛋白的序列
Fig. 4 The sequence of nucleotide and deduced amino acids of cloned XYGluD32LMWGS1
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　　同样 ,认为用引物 5 和 7 扩增的产物为 Glu2B3
位点上包括启动子和完整编码区的 LMW2GS 基因。
此外 ,很值得一提的是 ,迄今 GenBank 中报道的
所有已知 LMW2GS 都只含有 8 个保守的 Cys 残
基[10 ] ;而本研究克隆的我国优异种质小偃 6 号 Glu2
D3 位点 LMW2GS 基因编码的 LMW2GS 含有 9 个 Cys
残基 ,即除了 8 个保守的 Cys 残基外 ,还多一个 Cys
残基 (见图 3 画线处) (这不是 PCR 扩增时碱基错配
所致 ,因为扩增时用了高保真酶 pfu) ;这就增加了小
偃 6 号种子中该LMW2GS形成分子间二硫键的机会
(即能形成更大分子谷蛋白聚合体) 。这可能是小偃
6 号加工品质优良的主要原因之一。
3 　结论
通过上述试验可得出如下结论 :
(1) 引物 3 和 4 为小麦谷蛋白 Glu2D3 位点
LMW2GS 基因特异引物。用其进行 PCR 扩增时 ,反
应条件为 :95 ℃预变性 1 min ;循环反应条件为 94 ℃
1 min ,62 ℃ 1 min ,72 ℃ 2 min ,反应 30 循环后 ,再
72 ℃延伸 7 min。其扩增产物包括了启动子和完整
编码区。
(2) 引物 5 和 7 为小麦谷蛋白 Glu2B3 位点
LMW2GS 基因特异 PCR 引物。用其进行 PCR 扩增
时 ,循环反应条件为 :95 ℃预变性 1 min ;循环反应条
件为 94 ℃1 min ,64 ℃1 min ,72 ℃2 min ,反应 30 循
环反应后 ,再 72 ℃延伸 7 min。其扩增产物包括了
启动子和完整编码区。
(3)通过 PCR 技术克隆到的小偃 6 号 Glu2D3 位
点 LMW2GS 基因 (登录号 AY263369)所编码的 LMW2
GS含有 9 个 Cys 残基 ,这是首次发现。这可能是该
品种加工品质优良的主要原因之一。
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