全 文 ：Vol. 30 , No. 1
pp. 60～65 　Jan. , 2004
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 30 卷 第 1 期
2004 年 1 月 　60～65 页
转抗虫基因三系优良保持系的获得
马炳田1 ,2 ,3 　王玲霞1 ,2 　李　平1 ,2 , 3 　朱　祯3 , 3 　周开达1
(1 四川农业大学水稻研究所 , 四川温江 611130 ; 2 四川省农业生物技术工程研究中心 , 四川温江 611130 ; 3 中国科学院遗传与发育生物学研究
所 , 北京 100101)
摘　要 　以质粒 pBUSCK2HPT作抗虫基因供体 ,优良籼型保持系 D62B 为受体 ,采用基因枪转化法 ,获得了转抗虫基因
sck 的植株。将转基因保持系与不育系 D62A 回交 ,获得转抗虫基因不育系。分子证据表明 ,外源基因能稳定转移到不育
系中。蛋白活性测定显示 ,转基因在不育系中得到表达。本文还讨论了转基因技术在水稻育种中的作用。Ξ
关键词 　水稻 ;籼稻 ;抗虫性 ;转基因 ;修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因
中图分类号 : S511
Obtaining Transgenic Elite Indica Maintainer Line Containing Modif ied CpTI( sck)
MA Bing2Tian 1 ,2 , WANGLing2Xia 1 ,2 , LI Ping 1 ,2 , 3 , ZHU Zhen 3 , 3 , ZHOU Kai2Da 1
(1 Rice Research Institute of Sichuan Agricultural University , Wenjiang 611130 , Sichuan ; 2 Sichuan Agricultural Biotechnology Engineering Research Center , Wen2
jiang 611130 , Sichuan ; 3 Institute of Genetics & Developmental Biology , Chinese Academy of Sciences , Beijing 100101 , China)
Abstract 　　The transgenic D62B , an elite indica maintainer line , containing modified CpTI ( sck) , was obtained by
bombardment1 With the transgenic D62B as donor , D62A containing sck was developed1 PCR and Southern blotting analy2
ses indicated that sck gene could be delivered to CMS line stably1 The field performance of transgenic plants was similar to
the non2transgenic control , but the resistance to insects was increased1 The use of genetic transformation in rice breeding
was also discussed1
Key words 　　Oryza sativa L1 ; Indica ; Resistance to insects ; Transgene ; Modified CpTI ( sck)
　　水稻 ( Oryza sativa L. ) 是最重要的粮食作物之
一 ,全世界有近半数的人口以稻米为主食。在我国 ,
水稻年播种面积在 3 000 万公顷以上 ,其中杂交稻
的播种面积占 50 %左右 ,达 1 600 多万公顷 ,部分省
市如四川、江西杂交稻占 90 %以上[1 ] 。杂交稻与常
规稻相比 ,具有产量优势 ,但易于受病虫的攻击 ,造
成严重减产、米质变劣 ,其中虫害尤为严重。常规采
用化学防治虫害 ,但防治效果不理想 ,长期使用后害
虫还产生抗药性、造成环境污染和人畜危害。农业
技术措施及生物防治也不能有效控制水稻虫害的发
生。抗虫品种的应用是最为经济有效的办法。在杂
交稻的选育过程中 ,不育系 (保持系) 的抗性是最难
解决的 ,还受种质资源稀少和生殖隔离的限制。基
因工程技术的出现和成熟 ,为我们解决这个问题提
供了一种全新的手段。1986 年 Uchimiya 等首先通
过基因工程技术获得了转基因水稻细胞组织[2 ] 、
1989 年 Shimamoto 等获得可育的转基因粳稻[3 ] 、1990
年 Datta 等获得可育转基因籼稻植株[4 ]以来 ,水稻转
基因已从实验室走向田间。
豇豆胰蛋白酶抑制剂 (Cowpea Trypsin Inhibitor ,
CpTI)基因是植物抗虫基因工程中运用最为广泛抗
虫基因之一。早在 1993 年 ,美国康奈尔大学就采用
直接转化法将 CpTI 导入水稻并获得转基因植株 ,经
虫试发现转基因植株对水稻二化螟、三化螟具有一
定的抗性[5 ] 。中国科学院遗传与发育生物学研究所
遗传操作实验室通过 3 引物 PCR ( TP2PCR) 对 CpTI
基因进行了修饰。修饰的 CpTI 基因 ( signal2CpTI2
KEDL , sck)表达产物在内质网定位信号的引导而富
集于内质网及其衍生的蛋白体上 ,转基因水稻表现
出抗虫能力的提高) 。我们通过转基因技术将 sckΞ基金项目 :国家“863”计划、国家转基因植物研究与产业化专项 (J20002B2011) 、四川省“九五”生物技术攻关等项目资助。
作者简介 :马炳田 (1971 - ) ,男 ,博士 ,研究方向 :植物基因工程。3 通讯作者 (Corresponding author) :李平、朱祯。
Received(收稿日期) :2002207222 , Accepted(接受时期) :20022102151

基因转入三系杂交稻保持系 ,并实现向不育系转移 ,
测定其田间表现 ,试图为杂交稻抗虫育种提供一条
有效的途径。
11 材料与方法
111 　供试材料
　　转基因受体水稻材料为优良籼型三系保持系
D62B ,由四川农业大学水稻研究所选育。
转基因供体质粒为 pBUSCK2HPT:由中国科学
院遗传与发育生物学研究所遗传操作实验室构建 ,
主要结构为 Ubi2Signal2CpTI2KDEL2Tnos。含豇豆胰
蛋白酶抑制剂基因 ( CpTI) ,并在 5′端添加信号肽
SKTI、3’端连接内质网滞留信号 KDEL 进行修饰
( sck) ,赋予转基因水稻抗鳞翅目害虫的能力。Ubi
为玉米泛素启动子 ,筛选标记基因为 hpt ,编码潮霉
素磷酸转移酶 (hygromycine phosphotransferase) 。
112 　培养基
基本培养基为 NMB :N6 大量元素、MS 微量元
素、B5 有机成分、附加水解酪蛋白 250 mgΠL、脯氨酸
500 mgΠL、蔗糖 30 gΠL、凝固剂 gelrite 213 gΠL ,pH 518。
诱导和继代培养基为 NMB + 2 ,42D (2 mgΠL) 。高渗
培养基为继代培养基附加 016 molΠL 甘露醇。筛选
培养基为继代培养基附加 20 或 30 mgΠL 潮霉素 B。
分化培养基为 NMB + 62BA (3 mgΠL) + NAA (013 mgΠ
L)附加 20 mgΠL 潮霉素 B。生根培养基为 1Π2 MS 固
体培养基。
113 　水稻胚性愈伤组织的诱导及培养
水稻胚性愈伤组织的诱导和继代按文献[6 ] 进
行。将开花后 12～15 d 未成熟种子或成熟种子去
壳后 ,先用 75 %的乙醇表面消毒 ,再用 30 %的次氯
酸钠灭菌 30 min ,无菌水清洗后无菌滤纸吸干表面
水 ,放于诱导培养基中诱导胚性愈伤组织。愈伤组
织培养成功后 ,可在继代培养基上扩大繁殖 ,增加胚
性愈伤组织块的数量 ,用作基因枪转化的受体。
114 　转化方法
采用 PDS21000ΠHe 基因枪法按文献[7 ] 进行。将
D62B 胚性愈伤组织块在高渗培养基中培养 4 h 后
进行枪击。枪击后继续在高渗培养基上过夜后 ,将
受体愈伤组织块移到筛选培养基中筛选转化子。经
过 2～3 次的筛选后 ,将抗性愈伤组织块转移到分化
培养基中进行绿苗再生。当分化的绿苗长到 3 cm
以上时 ,移到生根培养基中进行生根壮苗培养。然
后进行开放炼苗培养并移栽到大田中。田间管理同
常规。
115 　转基因的纯合及向不育系的转移
采用含潮霉素 B (40 mgΠL) 的 1Π2 MS 培养基进
行转化植株的潮霉素 B 抗性种子筛选 ,并推测转基
因的纯合与否。将潮霉素 B 抗性植株种植到田间 ,
选取转基因 D62B 作父本 ,不育系 D62A 作母本回
交。
116 　分子检测
基因组 DNA 提取采用 CTAB 法[8 ] :将 215 g 水
稻叶片用液氮研磨成细粉 ,加入 10 mL 65 ℃预热的
CTAB 提取液 ,摇匀保温 (65 ℃) 30 min。加入等体积
的氯仿、异戊醇 (24∶1 ,012 %β2巯基乙醇) ,充分混匀
后 10 000 ×g 离心 10 min ,上清液用预冷的异丙醇
沉淀 DNA。将 DNA 吸出用 70 %乙醇洗 2 遍 ,再用无
水乙醇洗 2 遍 ,超净台上吹干后溶于超纯水中 ,电泳
或分光光度法定量 ,用作 PCR 或 Southern blotting 模
板。
多聚酶链反应 ( PCR) :采用 25μL 体系。sck 引
物为 :P1 :5′2 AAA ATG AAG AGC ACC ATC TTC2 3′;
P2 : 5′2 TCT AGA GTT CAT CTT TCT CAT C 23′,扩增
的目的片段为 415 bp。hpt 引物为 : P3 : 5′2TAC ACA
GCC ATC GGT CCA GA23′;P4 : 5′2TAG GAG GGC GTG
GAT ATG TC23′,扩增的目的片段为 832 bp。反应条
件为 :94 ℃变性 1 min ,56 ℃复性 1 min ,72 ℃延伸 1
min ,35 个循环 ,循环开始前 94 ℃预变性 4 min ,循环
结束后 72 ℃延伸 10 min。PCR 产物于 018 %的琼脂
糖凝胶 90 V 电压电泳分离后 ,紫外光下观察并拍
照。
Southern blotting 分析 :20μg 基因组 DNA 充分酶
切 ,用 018 %的琼脂糖凝胶 40 V 电泳过夜后 ,碱法转
移到 Hybond N + 尼龙膜 (Amersham) 上[8 ] ,80 ℃烘干。
预杂交、杂交均用 7 % SDS磷酸缓冲液于 65 ℃反应。
探针标记依随机引物标记试剂盒进行 ( Promega) ,在
37 ℃反应 1 h ,热变性后加入到杂交液内。杂交膜用
011 ×SSC + 011 % SDS洗去背景后 ,压 X2光片 (Fuji)
放射自显影后观察结果。
117 　转基因植株的豇豆胰蛋白酶抑制剂活性测定
取 013 g 水稻新鲜叶片 ,液氮研磨后加入 600μL
提取液 (50 mmolΠL Tris2HCl ,含 DDT 110 mmolΠL , pH
915)充分混匀 ,以 11 000 rΠmin 4 ℃离心 10 min ,将上
清液作为待测样品。将 50 mmolΠL Tris2HCl 缓冲液
(含 10 mmolΠL Ca2 + ,pH 810) 200μL、蒸馏水 720μL、
牛胰蛋白酶 (011μgΠμL) 50μL、样品 30μL 充分混匀
16　1 期 马炳田等 : 转抗虫基因三系优良保持系的获得 　　　

后 ,置于 27 ℃温箱保温 60 min。保温后上述反应管
各取 100μL 分别与 1 mL BAEE (N2苯甲酰2L2精氨酸
乙酯)底物反应液混匀 ,置于 27 ℃保温 15 min。保温
完成后 ,立即于λ= 254 nm 处测定各反应管吸光值
(OD254 ) 。以大豆来源的胰蛋白酶抑制剂 ( TRYPSIN
INHIBITOR from SOYBEAN TYPE 12S) 为标准品作标
准曲线。
118 　转抗虫基因保持系农艺性状的测定
将获得的转基因后代植株种植在试验田中 ,按
17 cm ×26 cm 规格栽插。管理同常规 ,但不施杀虫
剂。按常规进行农艺性状考察。
119 　转基因植株的室内抗虫性测定
于分蘖盛期取 10 g 转基因水稻叶片液氮研磨 ,
加入 20 mL PBS(pH 915) 蛋白提取液 ,4 ℃浸提 4 h ,
10 000 rΠmin 离心 10 min ,获得上清液。将虫试饲料
用上清液充分浸泡后凉干表面水 ,放于平皿中。然
后接种 20～30 头一龄末玉米螟幼虫 ,27 ℃培养 (饲
料过剩) 。12 d 后统计死亡率和虫体重。
2 　结果与分析
211 　转基因 D62B的获得及外源基因的纯合
　　通过基因枪法 ,将供体质粒 pBUSCK2HPT(含抗
虫基因 sck) 转入 D62B 的胚性愈伤组织 ,然后用含
抗生素潮霉素 B 的筛选培养基进行转化子的筛选。
供体质粒中含有筛选标记基因 hpt ,编码潮霉素磷
酸转移酶。当 hpt 基因整合到水稻基因组中并正确
表达时 ,能够将磷酸共价结合到潮霉素 B 上 ,使培
养基中的潮霉素 B 失活 ;而非转化细胞中不含 hpt
基因 ,不能合成潮霉素磷酸转移酶 ,当潮霉素 B 进
入非转化细胞后 ,就与 30 S 核糖体结合而阻止细胞
蛋白的合成 ,使非转化细胞因缺乏蛋白而变褐死亡。
因此 ,转化子能够在筛选培养基上正常生长 ,而非转
化细胞逐渐变褐死亡。
我们共转化 617 块胚性愈伤组织 ,经 2～3 次
筛选 ,获得 26 个克隆的潮霉素抗性愈伤组织 ,抗性
愈伤获得率为 4121 %。将抗性愈伤进行分化、再生
等处理后 ,获得 11 个无性系的绿苗植株 ( T0 ) ,占受
体愈伤的 1178 %。将 T0 植株栽培到田间 ,自交结
实 ,选取结实率高的单株 ,待种子成熟后收获 ,去壳、
表面灭菌后放到含 40 mgΠL 潮霉素B 的 1Π2 MS培养
基上进行抗性筛选。所测试 17 个单株中 ,有 15 个
单株种子的潮霉素抗性符合 3∶1 ,说明外源基因是
以单位点方式整合到受体基因组中 ,并按孟德尔单
基因显性方式在后代中遗传 ;另 2 个不符合 3∶1。
将符合 3∶1 植株的转基因二代 ( T1 ) 种子按同样方法
进行潮霉素 B 抗性筛选 ,发现有 3 个株系的外源基
因纯合 (测试单株种子全部抗潮霉素 B) ,并且农艺
性状与未转基因的对照一致 ,即获得了纯合株系。
将转基因 D62B 植株作父本 ,不育系 D62A 作母本回
交 ,得到转基因不育系。不育系的育性没有发生变
化。因此 ,转基因 D62B 的保持力没有因外源基因
的插入而发生变化。
212 　转基因的表达情况
通过测定豇豆胰蛋白酶抑制剂 (CpTI) 活性 ,发
现 sck 基因在 D62B 或经杂交转移到不育系中仍然
能正常表达并具有生物活性。转基因 D 62B 的 23
个 T2 代单株平均 CpTI 含量为占可溶性总蛋白的
3131 % ,而对照为 1199 % ;转育的 D62A 中 ,平均 Cp2
TI含量占可溶性总蛋白的 3146 % ,而对照为 1194 %
(见表 1、图 1) 。很显然 ,转基因在受体或转育植株
中均得到表达。
图 1 转 sck 基因水稻的 CpTI含量
Fig. 1 Expression of sck in transgenic rice lines
表 1 转基因植株的 CpTI含量测定
Table 1 Expression of sck in transgenic rice lines
材料名称
Line
检测单株数
Number of
plants tested
总蛋白含量
Total protein
(mgΠmL) 剩余活力Residual activityof CpTI( %) CpTI 含量Amount ofCpTI(mgΠmL) CpTIΠ总蛋白CpTIΠTotalprotein( %)
D62B2sck2B2T2 23 37199 24105 1125 3131 ±0188
D62B2CK 12 30127 61107 0163 1199 ±0186
D62A2sck2B 12 37195 22157 1127 3146 ±0176
D62A2CK 12 35139 59173 0165 1194 ±0196
26 　　　作 　　物 　　学 　　报 30 卷 　

213 　转基因水稻的抗虫性
采用植物蛋白粗提物浸泡昆虫饲料的方法 ,我
们测定了转基因水稻 T2 代植株在室内对玉米螟的
抗性。转基因植株的蛋白粗提物浸泡的饲料饲喂玉
米螟 12 d 后 , 3 个不同单株处理的平均每头虫重在
20 mg 左右 ;未转基因植株蛋白粗提物处理的饲料
喂虫后的虫重达 30121 mg ,不用蛋白粗提物处理的
饲料喂虫的虫重达 37160 mg。转基因水稻与对照相
比 ,对玉米螟有显著抗性 ,抑制了玉米螟的生长发育
进程 ,但致死率没有明显提高 (见表 2) 。
2001 年四川农业大学海南育种站水稻田中螟
虫为害严重。不施杀虫剂的情况下 ,未转基因的水
稻发虫率为 100 % ,转基因植株也受到螟虫的严重
侵犯。转 sck 基因 D62B、D62A 及对照感虫株率均
为 100 % ,但感虫分蘖率却分别为 28113 %、27197 %
和 43170 %。很明显 ,这种表达量的 CpTI 仅影响害
虫的发育进度 ,而不能杀死害虫 ,导致感虫株率与对
照相当而感虫分蘖率下降的现象。这与上述室内结
果一致。
214 　转抗虫基因水稻的农艺性状
将转基因 T2 经筛选后栽插于苗床 ,然后移栽到
大田中 ,栽培管理同常规 ,但不施杀虫剂。从田间表
型上看 ,转基因水稻植株长势良好 ,整齐一致 ,与对
照相当。考种结果发现转基因水稻与相应对照在株
高、单株平均分蘖数、平均穗长、结实率、千粒重等主
要农艺性状无明显差异 (见表 4) 。这些结果表明外
源基因的插入没有改变 B62B 的优良农艺性状。因
此 ,可通过转基因技术定点改良优良杂交稻保持系
的某些不良性状。
215 　外源基因的分子检测
用 CTAB 法提取转基因植株及其回交的不育系
基因组 DNA 作为模板 ,以 P1、P2 或 P3、P4 为引物进
行 sck 或 hpt 基因的 PCR 反应。结果表明 ,从转基因
D62B 和相应的 D62A 植株中都能扩增到外源基因
与阳性对照 (质粒 DNA 作模板)一致的 415 bp 的 sck
和 832 bp 的 hpt 目的扩增特异带 ,而未转基因的阴
性对照植株中却没有相应的片段 (见图 2、图 3) ,说
明转基因 D62B 及其回交的不育系中都含有外源基
因。另外 ,外源基因是整合到 D62B 的核染色体上
的 ,因为不育系中也扩增到了同样的片段 ,它只能从
作为父本的转基因 D62B 的核染色体中才能得到。
表 2 转基因水稻的室内抗虫性测定结果
Table 2 Effect of the total protein extracts from transgenic lines on the growth of corn borer larvae
材料
Line
田间编号
Code in field
0 d 虫头数
Number of
larvae tested
12 d 虫头数
Number of larvae
after 12 days
死亡率
Percentage of
dead larvae
( %)
12 d 虫总重
Weight of Total larvae
after 12days
(mg)
12d 虫重
Average weight of one
larva after 12 days
(mg)
10325 2010 1810 10100 407133 22163 ±0113Cc
D62B2sck2B2T2 10525 2010 1710 15100 359167 21113 ±2101Cc
11123 2010 1910 5100 344100 18113 ±1173Dd
D62B2CK 2010 1813 8133 554167 30121 ±1111Bb
CK2 2010 1813 8133 689100 37160 ±0143Aa
　　注 :表中数据为 3 次重复的平均值 ;0 d 虫重为 0104 mgΠ头。12 d 虫重 (mgΠ头)栏中字母不同代表差异显著 (大写 : P = 0101 ;小写 : P = 0105) 。
CK:相应未转基因水稻蛋白提取液处理饲料 ;CK2 :饲料不经水稻蛋白提取液处理。
Notes :Data in table were the averages of three replicates ;Average weight of one larva in 0 days was 0104 mg. Within the coloum of average weight of one larva
after 12 days ,means followed by the same (capitalΠsmall) letter indicated no significant difference at 0101Π0105 level . CK:the forage treated with the
total protein extracts from the nontransgenic rice plants ;CK2 :the forage untreated with the total protein extracts from rice plants.
表 3 　 转基因水稻的田间抗虫性
Table 3 The resistance of transgenic rice plants to rice borers in field
材料
Line
调查株数 (株)
Number of plants tested
分蘖数 (个)
Number of total tillers
感虫株率
Plants affected ( %)
感虫分蘖率
Damaged tillersΠplant ( %)
D62B2sck2B2T1 154 1984 100100 28113
D62A2sck 46 556 100100 27197
D62B2CK 20 254 100100 43170
36　1 期 马炳田等 : 转抗虫基因三系优良保持系的获得 　　　

表 4 转基因植株的农艺性状
Table 4 The agronomic traits of transgenic rice lines
材料
Line
调查株数
Number of
plants tested
株高
Plant
height (cm)
分蘖数
TillersΠplant 穗长Paniclelength(cm) 穗着粒密度(粒Πcm)GrainsΠcm 结实率Seed2settingΠpanicle ( %) 千粒重10002grainweight (g)
3 8413 ±016 1513 ±115 1817 ±111 912 ±015 77180 ±7153 2415 ±015
9 7814 ±316 1612 ±214 1816 ±118 911 ±016 80111 ±2129 2413 ±014
7 7816 ±318 1613 ±211 1814 ±016 815 ±013 82196 ±3185 2414 ±015
6 7816 ±318 1412 ±117 1718 ±116 813 ±014 83122 ±4176 2318 ±013
D62B2sck2T2 5 8218 ±119 1518 ±214 1714 ±017 813 ±013 79160 ±2182 2413 ±016
5 8012 ±219 1518 ±212 1715 ±112 810 ±015 82147 ±4149 2412 ±014
5 7714 ±419 1416 ±115 1717 ±111 812 ±016 83124 ±2157 2415 ±013
8 7911 ±314 1610 ±214 1719 ±114 810 ±014 83165 ±4180 2414 ±014
6 7213 ±314 1617 ±219 1618 ±115 719 ±013 84104 ±4143 2413 ±014
D62B2CK 14 8213 ±511 1514 ±211 1813 ±018 815 ±013 83170 ±2113 2415 ±012
图 2 PCR检测 D62B2sck2hpt
Fig. 2 PCR analysis of D62B2sck2hpt plants
sck 和 hpt PCR 产物等量混匀电泳 ;M:DL2000 marker (2000 ,1000 ,
750 ,500 ,250 ,100 bp) ; + :阳性对照 ; - :阴性对照 :832 bp :
hpt ; 415 bp : sck ;1 —10 ;T2 植株。
Electrophoresis of mixture of equivalent respective sck2product and hpt2
product of PCR. M: DL2000 marker ( 2000 , 1000 , 750 , 500 , 250 , 100
bp) . + :positive control ; - :negative control ;832 bp : hpt ;415
bp : sck . 1 —10 ;T2 plants.
图 3 PCR检测 D62A2sck2 hpt
Fig. 3 PCR analysis of D62A2sck2hpt plants
M:DL2000 marker (2000 ,1000 ,750 ,500 ,250 ,100 bp ) ; + :阳性对
照 ; - :阴性对照 ;832 bp : hpt ;415 bp : sck ;1 —5 :D62AΠD62B2sck2
hpt (T2 纯合) 。
M:DL2000 marker (2000 ,1000 ,750 ,500 ,250 ,100 bp) ; + :positive
control ; - :negative control ;832 bp : hpt ;415 bp : sck ; 1 —5 :
D62AΠD62B2sck2hpt .
　　用转基因 D62B 两个单株基因组 DNA 作模板 ,
采取 4 种方法处理模板 (1 :不用限制性内切酶处理
基因组 DNA ;2 :用在供体质粒中没有酶切位点的限
制性内切酶 Pst Ⅰ处理基因组 DNA ;3 :用在供体质
粒中有一个酶切位点的限制性内切酶 Sma Ⅰ处理基
因组 DNA ;4 :用在目的基因两端都有酶切位点的限
制性内切酶 Kpn Ⅰ处理基因组 DNA) ,然后进行电
泳、转膜、用酶切供体质粒回收的 sck 片段为探针作
Southern blotting 分析。结果表明 , 在两个转基因
D62B 植株都得到一条杂交带 ,而非转基因对照没有
出现杂交任何信号 (见图 4) ,说明外源基因在受体
植株核染色体上呈单拷贝单位点整合。
3 　讨论
由于复种指数较高 ,杂交稻易受害虫、特别是螟
虫的危害 ,严重制约着它的高产稳产。改良保持系
的抗虫性是改善杂交稻抗虫性极其重要的一环。利
用转基因技术 ,可将来源于其他植物或物种 ,如微生
物、动物等的抗虫基因转入杂交稻亲本 ,打破生殖隔
离 ,从而提高杂交稻的抗虫性 ,稳定水稻的生产。目
前已有多种抗虫基因转入杂交稻亲本 ,并获得抗虫
性改良的株系 ,有的还进入了田间试验[9 ] 。我们将
修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂 (CpTI) 基因 ( sck) 采用
基因枪转化法转入杂交稻优良保持系 D62B 中 ,通
过回交传递到不育系 ,从而提高所配杂交稻的抗虫
性。分子证据表明外源基因在受体植株中的遗传是
稳定的 ;蛋白活性检测结果证明外源基因在保持系和
46 　　　作 　　物 　　学 　　报 30 卷 　

图 4 转基因植株 Southern blotting 分析
Fig. 4 Southern blotting analysis of transgenic plants
+ : sck 片段 ,415 bp ; - :阴性对照 ;1 :基因组 DNA ;
2 :DNAΠPst Ⅰ;3 :DNAΠSma Ⅰ;4 :DNAΠKpn Ⅰ。
+ : sck fragment ,415 bp ; - :negative control ;1 :genomic DNA ;
2 :DNAΠPst Ⅰ;3 :DNAΠSma Ⅰ;4 :DNAΠKpn Ⅰ。
不育系中都能正确表达 ;田间农艺性状测定表明外源
基因的转入没有改变受体的优良性状 ;室内田间试验
发现抗虫性得到提高。这与前人报道的结果相
似[10] 。
豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 ( CpTI)是目前植物抗
虫基因工程中使用较为广泛的外源基因。CpTI 属
于丝氨酸蛋白酶抑制剂 ,在水稻等粮食作物抗虫基
因工程中占有突出的地位。这是因为蛋白酶抑制剂
作用于昆虫消化酶的活性中心 ,昆虫不易产生耐受
性 ,抗虫性稳定 ;抗虫谱广 ,对几个目的害虫都有抗
性 ; CpTI 来源于植物 ,转基因产品更易被公众接受 ,
而且业已证明对人畜无害[11 ] 。但是 , CpTI 也存在抗
虫能力不足的缺点。为此 ,中国科学院遗传与发育
生物学研究所遗传操作实验室采用 3 引物 PCR 方
法 ,对 CpTI 基因进行了修饰。修饰的 CpTI ( sck) 表
达产物富集在细胞的内质网及其衍生的蛋白体上 ,
处于一种代谢相对不活跃的环境中 ,提高了抗虫蛋
白的稳定性和含量 ,使转 sck 植物表现出抗虫能力
的加强。我们获得的转 sck 杂交稻抗虫能力虽得到
了提高 ,但要达到生产要求还有一定的差距 ,这可能
是因为我们获得的转基因群体过小 ,未能筛选到外
源基因高效表达的株系。外源基因在受体细胞中的
表达水平由许多因素决定 ,如外源基因整合的拷贝
数 (本试验为单拷贝) 、插入位点、甲基化、基因重排
等。为此 ,我们加大了转基因群体 ,进一步的高抗虫
株系筛选正在进行中。
References
[1 ] 　Zeng Q2C(曾千春) , Zhou K2D (周开达) , Zhu Z(朱祯) , Luo Q
(罗琼) 1 Current status in the use of hybrid rice heterosis in China1
China J Rice Sci (中国水稻科学) , 2000 ,14 (4) : 243 —246
[2 ] 　Uchimiya H , Fushimi T , Hashimoto H , Harada H , Syono K, Sug2
awara Y1 Expression of a foreign gene in callus derived from DNA2
treated protoplasts of rice ( Oryza sativa L1) 1 Mol Gen Genet , 1986 ,
204 :204 —207
[3 ] 　Shimamoto K, Terada R , Izawa T , Fujimoto H1 Fertile transgenic rice
plants regenerated from transformed protoplasts1 Nature , 1989 , 338 :
274 —276
[4 ] 　Datta S K, Peterhans A , Datta K, Potrykus I1 Genetically engineered
fertile indica2rice recovered from protoplasts1 BioΠTechnology , 1990 ,
8 :736 —740
[5 ] 　Wang Z2H(王忠华) , Shu Q2Y(舒庆尧) , Xia Y2W(夏英武) 1 Ad2
vances in the study on the improvement of rice through gene engineer2
ing1 Biotechnol Information (生物技术通报) , 1999 , (2) : 5 —8
[6 ] 　An H2B (安韩冰) , Zhu Z(朱祯) , Li H2F (李慧芬) , Wu Q (吴
茜) , Zhou Z2L (周兆澜) , Xu H2L (徐鸿林) , Xu J2W(徐军望) ,
An L2J (安利佳) , Li X2H (李向辉) 1 Obtaining fertile transgenic
plants of resistant2insect rice ( Oryza sativa L1) via particle bombard2
ment1 High Technol Letters (高技术通讯) , 2001 , 11 (2) :12 —16
[7 ] 　Kikkert J R1 The Biolistc PDS21000ΠHe device1 Tissue and Organ
Culture , 1993 , 33 :221 —226
[ 8 ] 　Sambrook J , Fritsch E F , Maniatis T1 Molecular cloning : A Laborato2
ry Manual (2nd edn) 1 Cold Spring Harbor Laboratory Press , 1989
[9 ] 　Tyagi A K, Mohanty A , Bajaj S , Chaudhury A , Maheshwari S C1
Transgenic rice : a valuable monocot system for crop improvement and
gene research1 Critical Rev in Biotechnol , 1999 , 19 (1) :41 —79
[10 ] 　Tu J , Zhang G A , Datta K, Xu C , He Y, Zhang Q , Khush G S ,
Datta K S1 Field performance of transgenic elite commercial hybrid
rice expression Bacillus thuringiensisδ2endotoxin1 Nature Biotechnol ,
2000 , 18 :1101 —1104
[11 ] 　Hilder V A , Gatehouse A M R , Sheerman S E1 A novel mechanism
of insect resistance engineered into tobacco1 Nature , 1987 , 330 :
160 —163
56　1 期 马炳田等 : 转抗虫基因三系优良保持系的获得