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第 28 卷 第 6 期 作　物　学　报 V ol. 28, N o. 6
2002 年 11 月　 734～ 737 页 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA pp. 734～ 737　N ov. , 2002
利用 PCR 技术鉴别普通小麦 Glu-1 位点的某些等位基因Ξ
孙　辉1, 2　刘志勇1　李保云1　刘广田1
(1中国农业大学作物遗传育种系, 北京 100094; 2 国家粮食局科学研究院, 北京 100094)
摘　要　Glu21 位点的等位基因变异与普通小麦的烘烤品质有密切的关系, 本文利用根据 Glu2D ly 位点的基因序列设
计的一对引物, 通过 PCR 技术, 可以准确鉴别等位基因的变异 Glu2D ly10 和 Glu2D ly12, 同时还可以初步鉴定 Glu2B 1
位点的等位基因变异 Glu2B lh (14+ 15) , 为分子标记辅助选择在小麦品质育种中的应用提供了基础。
关键词　普通小麦, Glu21 位点, PCR
中图分类号: S512　　　文献标识码: A
Iden tif ica tion of Some A lleles a t Glu-1 L oc i in Common W hea t with PCR Ap-
proach
SUN H ui1, 2　L IU Zh i2Yong1　L IBao2Yun1　L IU Guang2T ian
(D epartm ent of P lant Genetics and B reed ing , China A g ricultural U niversity , B eij ing 100094, China)
Abstract　PCR techn ich is used to detect allelic variation at Glu21 loci in common w heat. W ith a pair of syn2
thetic p rim ers, specific variation fo r Glu2D ly, Glu2D ly 10 and Glu2D ly 12 can be distinguished clearly. Besides,
Glu2B 1h (subun it pair 14+ 15) can also be iden tified w ith the sam e p rim ers. Compared w ith SD S2PA GE, PCR
app roach p rovides a more rap id and efficien t detection of som e alleles at Glu21 loci in the early generation of
w heat breeding p rogram.
Key words　Common w heat, Glu21 loci, PCR
　　在所有控制小麦谷蛋白亚基的基因位点中,
Glu2D 1 位点倍受青睐, 因为该位点控制着与小麦
烘烤品质密切相关的两个亚基对 5 + 10 和 2 +
12[ 1 ] , 与 Glu21 其它两个位点 Glu2A 1 和 Glu2B1 一
样, Glu2D 1 位点也由两个紧密连锁的基因 Glu2D 1x
和 Glu2D 1y 组成, 分别控制分子量较大的 x2型亚基
和分子量较小的 y2型亚基。在形成谷蛋白聚合体的
过程中, 1D y 亚基的作用尤其重要。传统的谷蛋白
亚基分类和鉴别方法是以小麦籽粒贮藏谷蛋白为研
究对象的 SD S—PA GE。本研究利用 PCR 技术对
Glu2D 1y 位点的等位基因进行鉴别, 以期为小麦品
质育种的分子标记辅助选择提供依据。
1　材料与方法
1. 1　材料
选用国内外普通小麦品种 21 个, 包括国内育
成品种 14 个, 农家品种 2 个, 国外品种 5 个, 阿勃
第一部分同源群的缺体材料由陕西省农业科学院小
麦研究中心吉万全研究员惠赠。
1. 2　试验方法
1. 2. 1　SD S2PA GE　　取单个籽粒敲碎后放入1. 5
mL 离心管中, 加入 1 mL 样品提取缓冲液 (0. 0625
molöL T ris2HC l, pH 6. 8, 5% (vöv) Β2巯基乙醇, 2%
(w öv) SD S, 10% (vöv) 丙三醇, 0. 002% (w öv) 溴酚
蓝) , 室温下振荡提取 2～ 3 小时, 80～ 90℃水浴提
取 5 分钟, 冷却至常温后, 10000 röm in 离心 5 分
钟, 取上清 20～ 30 ΛL 用于点样。凝胶浓度为 10%
(交联度为 2. 6% , 胶厚 0. 75 mmolöL ) , 每块胶 15
mA 稳流电泳过夜。凝胶用含有 12. 5% 三氯乙酸,
0. 05% 考马斯亮蓝染色液染色过夜, 用蒸馏水脱色
至背景清晰, 照相或做干胶长期保存。
1. 2. 2　DNA 提取　　基因组DNA 按照CTAB 方Ξ 基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (39370440)
作者简介: 孙辉, 女, 博士, 1971 年生, 现工作单位为国家粮食局科学研究院, 主要从事与食品品质有关的科学研究及开发工作。
Received on (收稿日期) : 2001210212, A ccep ted on (接受日期) : 2002202221

法[ 2 ]提取并稍加改动。2g 小麦叶片用液氮研磨并迅
速移至 1. 5 mL 管中, 加入 0. 75 mL CTAB 提
取缓冲液 (含 有 100 mmolöL T ris2HC l pH 8. 0,
50 mmolöL ED TA pH 8. 0, 700 mmolöL N aC l, 1%
CTAB ) , 轻轻混匀, 65℃水浴 1 h, 加入等体积氯仿ö
异丙醇 (24∶1) 混合液, 轻轻摇动 10 m in, 12000 rö
m in 离心 10 m in, 上清液移入新管中, 用 2 倍体积
预冷乙醇沉淀DNA , 将沉淀物用预冷乙醇清洗 2
次, 溶解在双蒸水中, 稀释至工作浓度 20 ngöΛL。
1. 2. 3　PCR 分析　　根据 Sm ith [ 3 ]的引物序列设
计的一对 Glu2D 1y 位点的特异性引物, 由北京赛百
盛公司合成。引物序列为:
5′2GT T GGCCGGTCGGCT GCCA T G23′,
5′2T GGA GAA GT T GGA TA GTA CC23′。
所有扩增反应均在 Perk in E lym er DNA T heo2
m al cycler 480 上进行。PCR 反应体系: 总体积 25ΛL , 其中, M gC l2 (25 mmolöL ) 1. 5 ΛL 10×PCR
Buffer 2. 5 ΛL , dN T P (25 mmolöL ) 2. 0 ΛL , 引物
1+ 2 (20 ngöΛL ) 2. 5 ΛL , 模板DNA (20 ngöΛL ) 2. 0ΛL , d. d. H 2O 14 ΛL , T aq 酶 (2. 5 U öΛL ) 0. 5 ΛL。
PCR 反应条件 94℃预变性 3 m in; 94℃变性 1
m in, 60℃退火 1 m in, 72℃延伸 2 m in, 40 个循环;
最后, 72℃延伸 5 m in。4℃保存。
PCR 产物检测: 在 PCR 扩增产物中, 加入 1ΛL 加样缓冲液 (0. 25% 溴酚蓝, 0. 25% 二甲苯青
FF, 40% (w öv) 甘油水溶液)。1. 5% 琼脂糖凝胶电
泳, 100V 稳压 3 h。凝胶用溴化乙锭染色半小时,
蒸馏水脱色 20 m in。紫外下观察并照相。
2　结果与分析
2. 1　PCR 引物特异性的鉴定
对阿勃 1A 缺体 (N 1A )、1B 缺体 (N 1B ) 和 1D
缺体 (N 1D ) , 以及中国春 (CS)和 Gabo (G)的基因组
DNA 进行 PCR 分析, 结果见图 1。
　　本研究用的 PCR 引物对 Glu2D 1y 位点等位基
因主要变异扩增出的片段大小不同, 1D y10 扩增的
片段较小。据 Sm ith 的结果[ 3 ] , 1D y10 (Gabo) 扩增
的片断应为 576 bp , 而 1D y12 (中国春) 扩增出的片
断为 612 bp。图 1 中, 阿勃 1A 缺体和 1B 缺体均能
扩增出约 600 bp 大小的目标片断, 而 1D 缺体不能
扩增出这个目标片断。因此, 认为 600 bp 左右的片
断是 Glu2D 1y 位点的特异性扩增产物。
除了目标片断以外, 还扩增出另外一些DNA
片断, 350 bp 左右的片断可能位于 1A 染色体, 约
700 bp 的片断则有可能位于 1B 染色体上。
图 1　　阿勃缺体和中国春、Gabo 的 PCR 扩增结果
F ig. 1　　PCR p roducts of glutenin genes of
A bbondanza nullisom ics ( lane N 1A , N 1B, N 1D ) ,
Chinese Sp ring ( lane CS) and Gabo ( lane G)
2. 2　Glu-1 位点等位基因的鉴别
对 21 份国内外的普通小麦品种, 分别进行
SD S—PA GE 和 PCR 分析, 研究其亚基组成和等位
基因变异, 结果见表 1 和图 2。
　　从亚基组成可以看出, 参试品种在所有的 Glu2
1 位点均存在一定程度的变异, 基本上包括了我国
小麦品种的主要变异, 如 Glu2A 1 位点为 a、b 和 c,
Glu2B1 位点为 a、b、c、h、i和 f 等, Glu2D 1 位点为
a 和 d (表 1)。参试品种 Glu21D y 的 PCR 扩增带谱
与表 1 中的几乎完全相符 (图 2) , 即具有 Glu2D 1a
的品种 (序号为 7, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19,
20, 21) 能够扩增出 612 bp 的片断, 而具有 Glu2
D 1d 的品种 (序号为 126, 8, 9, 18) 能够扩增出 576
bp 的片断。值得注意的是, 2 个农家品种大头秋和
白芒糙 (图 2 中的 11 和 12) 在 Glu2D 1 位点都只有
x2型亚基 (见图 3) , 没有 y2型亚基, 但是其染色体
DNA 经过 PCR 扩增之后, 都能扩增出相应的 612
bp 大小的片段, 即 Glu21D y12 的特异性扩增片段,
其原因尚需进一步研究。除了 Glu2D 1y 的扩增片断
以外, 还有另外两条染色体基因位点的特异性片
断, 其中 Glu2A 1 的扩增片断大小为 350 bp, Glu2
B1 的则为 700 bp 左右。在 Glu2B1 位点, 所有具有
亚基对 14+ 15 (即等位基因的变异为 h)的品种都不
能扩增出 700 bp 的片断, 而具有 Glu2B1 位点其他
变异类型的材料如 Glu2B1a (亚基 7)、Glu2B 1b (亚
基 7+ 8)、Glu2B 1c (亚基 7+ 9)、Glu2B1i(亚基 17+
5376 期　　　　　　　　　　孙　辉等: 利用 PCR 技术鉴别普通小麦 Glu21 位点的某些等位基因　　　　　　　　　　　　　

图 2　　小麦品种的 PCR 扩增结果
F ig. 2　　Amp lication results of 21 common w heat varieties
表 1　　参试品种 HMW -GS 组成和 PCR 扩增结果
Table 1　　The compositions of HMW -GS and PCR products l ist
序号
No.
品种
V ariety
Glu2A 1
亚基
Subunit
基因
Gene
Glu2B1
亚基
Subunit
基因
Gene
PCR 扩增
PCR p roduct
Glu2D 1
亚基
Subunit
基因
Gene
PCR 扩增
PCR p roduct
1 Gabo 1 a 17+ 18 i 700 bp 5+ 10 d 576 bp
2 CNN 23 b 7+ 9 c 700 bp 5+ 10 d 576 bp
3 Roblin 23 b 7+ 8 b 700 bp 5+ 10 d 576 bp
4 郑州 941 1 a 7+ 9 c 700 bp 5+ 10 d 576 bp
5 安农 2192 1 a 7+ 8 b 700 bp 5+ 10 d 576 bp
6 冀 5099 1 a 17+ 18 i 700 bp 5+ 10 d 576 bp
7 豫麦 2 号 1 a 7+ 9 c 700 bp 2+ 12 a 612 bp
8 N E7060 23 b 7+ 9 c 700 bp 5+ 10 d 576 bp
9 # 409 1 a 17+ 18 i 700 bp 5+ 10 d 576 bp
10 中国春 0 c 7+ 8 b 700 bp 2+ 12 a 612 bp
11 大头秋 0 c 7 a 700 bp 2 612 bp
12 白芒糙 0 c 7+ 8 b 700 bp 2 612 bp
13 陕优 225 1 b 14+ 15 h - 2+ 12 a 612 bp
14 小冰 33 0 b 7+ 8 b 700 bp 2+ 12 a 612 bp
15 高优 503 1 a 13+ 16 700 bp 2+ 12 a 612 bp
16 京冬 8 号 0 c 7+ 9 c 700 bp 2+ 12 a 612 bp
17 京 411 0 c 7+ 8 b 700 bp 2+ 12 a 612 bp
18 矮原 3 号 1 a 7+ 9 c 700 bp 5+ 10 d 576 bp
19 安农 9339 1 a 7+ 9 c 700 bp 2+ 12 a 612 bp
20 陕麦 8003 0 b 14+ 5 h - 2+ 12 a 612 bp
21 农大 95 1 b 14+ 15 h - 2+ 12 a 612 bp
18) 以及 Glu2B1f (亚基 13+ 16) 等却都能够扩增这
个片断, 说明该片断的有无可能是等位基因变异
Glu2B 1h (即亚基对 14+ 15) 是否存在的标记, 这需
要进一步的验证。
2. 3　杂种 F1 表现
谷蛋白亚基在杂种 F 1 呈共显性遗传, 图 4 为 3
个杂交组合正反交 F 1 及其相应亲本的 PCR 扩增结
果。所用亲本在 Glu2D 1 位点具有不同的等位基因
变异, 其杂种 F 1 都能同时扩增出 Glu2D 1y10 和
Glu2D 1y12 的目标片断, 表现出明显的共显性遗
传, 与 SD S2PA GE 结果一致。因此, 在小麦育种和 杂种优势利用中, 可用 PCR 技术来鉴别真假杂种。3　讨论Glu21 位点的某些基因与烘烤品质性状的优劣密切相关[ 4, 5 ] , 在育种过程中需要有简便而快速鉴别这些亚基或基因的技术和方法。SD S—PA GE 的优点是成本低, 一次可以分析大量品种, 样品准备程序比较简单, 结果容易分析, 并且能够同时得到三个位点的基因或亚基的分析结果; 它的缺点是所需时间比较长, 操作也相对复杂一些, 无法实现自动化操作。同时亚基的迁移率也会受到凝胶的浓
637　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　28 卷

图 3　　大头秋、白芒糙和中国春的 SDS2PA GE 图谱
F ig. 3　　SDS2PA GE patterns of Da2tou2qiu,
Bai2m ang2cao and Chinese Sp ring
图 4　　杂种 F1 的 PCR 扩增结果
从左至右分别为亲本农大 95 和N E7060, F1
农大 95×N E7060 和N E7060×农大 95, 京 411×
# 409 和# 409×京 411, 亲本京 411 和# 409
F ig. 4　　PCR p roducts of hybrids and their parents
F rom left to righ t: the parents Nongda 95 and N E7060
( lane 1 and 2) , Nongda 95×N E7060 and N E7060×Nongda
95 ( lane 3 and 4) , J ing411×# 409 and # 409×J ing411
( lane 5 and 6) , Parents J ing 411 and # 409 ( lane 7 and 8)
度、pH 值等电泳因素的影响, 一方面容易混淆那
些分子量不同而迁移率相似的亚基, 另一方面电泳
方法的不同也会造成谱带迁移率的差异。通过
HMW 2GS 的序列分析可知, 各亚基分子大小的差
异主要是由中部重复区长度的不同造成的, PCR 技
术就是以此为基础, 对 HMW 2GS 控制基因的结构
和遗传多态性进行快速、精确地研究[ 6 ]。本试验所
用的引物能够快速而准确地鉴别出 Glu2D 1y 位点的
优质等位基因 Glu21D y10。此外, Glu2B 1 位点的等
位基因变异 h 编码的亚基对 14+ 15 在国外的小麦
品种中属于比较罕见的变异类型[ 7 ] , 但在我国小麦
品种中却占有一定的比例, 王瑞等[ 8 ]的研究表明,
该亚基对与 Glu2D 1d 编码的优质亚基对 5+ 10 一
样, 对面包品质有重要的贡献。本文用Glue2D 1y 位
点的特异性引物能够扩增出非 Glu2B 1h 等位基因变
异的片断 (约 700 bp ) , 因此可以从 Glu2B1 位点的
其他等位基因变异 (Glu2B 1b, c, i, f 等) 中特异性
地鉴别出 Glu2B1h (即亚基对 14+ 15)。配之以简单
而快捷的DNA 提取方法, PCR 技术就为等位基因
变异的鉴别提供了一种更为简单、精确而快速的方
法, 较之 SD S—PA GE 技术更具有优越性。
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