全 文 ：　　
第 28 卷 第 5 期 作　物　学　报 V ol. 28, N o. 5
2002 年 9 月　 586～ 590 页 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA pp. 586～ 590　 Sep t. , 2002
蔗糖合酶基因启动子克隆及其转基因水稻植物中特异性表达Ξ
李永春1, 2　张宪银1　薛庆中1, 3
(1浙江大学农学系, 浙江杭州 310029; 2 山西农业大学, 山西太谷 030801)
摘　要　以水稻品种“明恢 63”基因组DNA 为模板, 用 PCR 方法克隆出水稻蔗糖合酶基因起始密码子以前 (包括第一
内含子) 的上游序列R SP1 及其不包括第一内含子的上游调控序列R SP2。测序结果显示, 在重要的功能区段上, 克隆
的序列与W ang (1992)等的报道基本一致。构建了由R SP1 和R SP2 驱动报告基因Gus 的植物表达载体, 并用于农杆菌
介导法水稻遗传转化。对水稻品种“秀水 11”转基因植株各部位的 GU S 组织化学分析表明: R SP1 和R SP2 都可以驱动
Gus 基因在根、茎、叶及颖壳中高效特异表达, 但在胚和胚乳中不表达。作者认为, 水稻蔗糖合酶基因启动子应用于水
稻分子育种有利于改善食用安全性。
关键词　水稻; 蔗糖合酶基因; 启动子; 组织特异性表达; 安全性
中图分类号: S511　　　文献标识码: A
Clon ing and Spec if ic Expression the R ice Sucrose Syn tha se Gene Promoter in
Tran sgen ic R ice Plan ts
L I Yong2Chun1, 2　ZHAN G X ian2Yin1　XU E Q ing2Zhong1
(1 Z hej iang U niversity , Z hej iang H angzhou 310029, China; 2 S hanx i A g ricultural U niversity , S hanx i T aigu 030801, China)
Abstract　A ccording to the pubilished 5′up stream sequence of the rice sucrose syn thase gene, two pairs of
specific p rim ers, w h ich invo lved R SP1 w ith an in tron and R SP2 w ithout in tron, w ere designed and amp lified
by using PCR techn ique from genom ic DNA temp late of an Indica rice variety‘M inghui 63’. T here w ere no
differences betw een the cloned sequences and the sequences published by W ang et al. 1992 in dom inan t
functional regions. Bo th R SP1 and R SP2 link up w ith Gus gene respectively in the A grobacterium binary
vecto rs fo r the A grobacterium 2m ediated transfo rm of a rice variety‘X iushui 11’. H istochem ical analysis of Gus
activity in various tissues show ed that the Gus gene driven by R SP1 or R SP2 gave strong exp ression in the
roo ts, stem s, leaves and seed coats, but did no t in the em bryo and endosperm tissues, based on w h ich w e
suggested that the specific exp ression of the sucrose syn thase gene is favo rable to imp roving the com estible safe
w hen using the p romoter to rice molccular breeding.
Key words　O ry za sativa; Sucrose Syn thase gene; P romoter; T issue specific exp ression; Safety
　　蔗糖合酶是植物淀粉合成途径中的关键酶, 在
水稻中至少有 3 种同功酶 R SuS1、R SuS2 和
R SuS3[ 1, 2 ]。其中, 与糖分运输有关的 R SuS1 基因
已被克隆[ 3 ] , 由该基因启动子驱动的 Gus 基因在转
基因烟草的韧皮部获得了高效特异的表达[ 4 ]。本文
报道由 R SuS1 基因上游调控序列驱动的 Gus 基因
在转基因水稻各器官 (特别是种子) 中的表达特性,
并探讨了该启动子应用于水稻转基因育种的有效性
和安全性。
1　材料与方法
1. 1　植物材料
以水稻品种“明恢 63”基因组DNA 为模板克隆
启动子, 水稻品种“秀水 11”为转基因受体材料。Ξ 基金项目: 国家 863 计划 (10120120123)、国家自然科学基金 (3987042)和浙江省 8812 计划资助
作者简介: 李永春 (19712 ) , 男, 讲师, 博士研究生, 研究方向: 水稻分子育种
　 3 通讯作者: E2m ail: qzhxue@hotm ail. com
Received on (收稿日期) : 2002201224, A ccep ted on (接受日期) : 2002202219

1. 2　试剂、质粒和菌株
常用试剂为国产分析纯试剂; 内切酶、修饰酶
和DNA 聚合酶购自上海生工公司; 质粒 pBS SK
(
-
) 购自 Strategene 生物工程技术服务有限公司
(以下简称生工公司) , 双元载体 pCAM B IA 13201
由澳大利亚 CAM B IA 研究中心提供; 大肠杆菌菌
株为DH 5a。
1. 3　启动子的克隆
参照李德葆等[ 5 ]的方法提取水稻幼叶基因组
DNA 作为 PCR 模板, 据W ang 等[ 3 ]报道的水稻蔗
糖合酶基因 5′端序列, 设计两对 (3 条) 特异引物,
由上海生工公司合成:
　引物 1 (上游) :
　5′2CTCCT TCA T T T TCA GT GCAAA T GT G23′
　引物 2 (下游) :
　5′2GA CTCAA T T TCA GGAA CT GCAAA GAA23′
　引物 3 (下游) :
　5′2CCAA T GGT GGTCA GA GA CGA G23′。
设计引物组合 1 和 2 旨在扩增出蔗糖合酶
(R SuS1) 基因起始密码子之前 (包括第一内含子) 的
序列 (R SP1, 2897bp) , 引物 1 和 3 则扩增该基因不
包括第一个内含子的上游序列 (R SP2, 1715bp )。
PCR 反应按标准体系进行, 采用 T aKar 公司
pyrobest DNA 聚合酶, 反应参数为: 94℃预变性 5
m in; 94℃1 m in, 58℃1 m in, 72℃4 m in, 循环 30
次; 72℃后延伸 10 m in。PCR 产物 R SP1 和 R SP2
用低熔点琼脂糖胶回收纯化, 经酶切鉴定后平末端
克隆于 pBS SK (- ) 质粒 Sm aÉ 位点得到质粒 pBS2
R SP1 和 pBS2R SP2, 送生工公司测序。
1. 4　表达载体的构建
农杆菌双元载体 pCAM B IA 1301 经 H indË 和
N coÉ 酶切, 分离大片段, 并用 K lenow 酶补平后自
连得到去除 Gus 基因 35S 启动子的载体 pCAM 2
Gus; 用 K p nÉ 和B am H É 双酶切质粒 pBS2R SP1、
pBS2R SP2 和 pCAM 2Gus 经琼脂糖凝胶电泳分离得
到两个启动子片段 R SP1 和 R SP2 及表达载体片
段, 启动子片段与载体连接得到两个植物表达载体
pCAM 2R SP12Gus 和 pCAM 2R SP22Gus(图 1)。
1. 5　水稻遗传转化
将质粒 pCAM 2R SP12Gus、pCAM 2R SP22Gus
和 pCAM 235S2Gus 分别导入农杆菌 EHA 105 感受
态细胞, 用于水稻品种“秀水 11”的遗传转化。转基
因方法参照H iei等[ 6 ] , 稍作修改。
图 1　植物表达载体 pCAM 2RSP12Gus 和 pCAM 2RSP22Gus 示意图
F ig. 1　　D iagram of p lant exp ression vectors pCAM 2RSP12Gus
and pCAM 2RSP22Gus
1. 6　转基因植株的 PCR 鉴定
提取再生植株叶片DNA 作为Gus 基因 PCR 检
测的模板。反应参数为: 94℃预变性 5 m in; 94℃
1m in, 61℃1m in, 72℃1m in, 30 个循环; 72℃后延
伸 10m in。预期扩增到片段为 563 bp , 引物序列如
下:
　　Gus1 5′2GGGA TCCA TCGCA GCGTAA T G23′
Gus2 5′2GCCGA CA GCA GCA GT T TCA TC23′
1. 7　转基因水稻植株不同部位的 GUS 活性检测
经 PCR 鉴定的阳性转基因植株移栽于大田,
共 3 个处理: X 112R SP12Gus、X112R SP22Gus 和X 112
35S2Gus (X 11为“秀水 11”, Gus 基因分别由 R SP1、
R SP2 和 35S 启动子驱动)。开花后第 20 天, 每个
处理选 15 株不同愈伤来源的植株进行 Gus 组织化
学分析。
采用半粒种法分析种子中 Gus 活性: 剪取经叶
片 Gus 活性鉴定为阳性的稻穗, 每穗取 20 粒种子,
用 70% 的乙醇 (5 m in) 和 0. 1% 的升汞 (12 m in) 杀
菌; 无菌条件下, 横、纵切各 10 粒种子, 种子的一
半做 Gus 活性分析, 另一半 (横切种子为含胚的部
分) 在含 2 ΛmolöL KT 和 0. 5 ΛmolöL NAA 的N 6
培养基上 28℃光照培养至得到 T 1 代幼芽和根系,
并对其进行 Gus 活性检测; 比较两半种子的鉴定结
果, 综合分析 T 0 代种子中的 Gus 活性, 以未转基
因“秀水 11”为阴性对照。
2　结果与分析
2. 1　克隆的启动子序列分析
测序结果表明, 本研究克隆的启动子在 TA TA
盒、CAA T 盒及转录起始位点等重要功能区与
W ang 等[ 3 ] 报道的序列一致; 在 - 375、- 348、
- 290、- 267、+ 571、+ 604 和+ 689 的位置有 7
个碱基变异 (用黑框标出) ; 在- 1218、- 276、-
185 和+ 657 四个位置相应碱基之前各有一个碱基
插入 (用三角框标出) ; 在+ 587 和+ 588 的位置缺
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失两个碱基 (图 2)。
2. 2　转基因植株的获得及其 PCR 鉴定
通过农杆菌介导转化水稻品种“秀水 11”的愈
伤组织, 最后得到 157 株再生植株。其中 132 株经
PCR 检测可扩增出约 563 bp 的特异带 (图 3) , 表明
Gus 基因已整合到相应植株的基因组中。
图 2　　水稻蔗糖合酶基因启动子的克隆序列与W ang 等报道[3 ]序列比较
F ig. 2　　Comparing the cloned rice sucrose synthase p romoter sequence w ith that of reported [3 ]
方框中为有差异碱基, 无对应碱基的为碱基缺失; 三角中为插入碱基; 虚线标出部分为第一内含子。
推断的转录起始位点和起始密码字位点都用着重号“. ”标出。
Bases boxed are those different to the reported sequence, if the substitutes are not show , it rep resents
that the bases are lost; bases in the triages are those inserted; the sequence underlined by‘2222’
is the first intron of the R S uS 1 gene; the putative transcrip tion and the exp ression
initiation sites are indicated by the m arkers‘. ’under corresponding bases.
2. 3　转基因植株的 Gus 组织化学分析
Gus 活性检测表明: 启动子序列R SP1 和R SP2
都可以驱动Gus 基因在“秀水 11”的根、茎、叶、叶
鞘和颖壳中有效表达 (图 4) ; 质粒 pCAM 2R SP12
Gus 与 pCAM 2R SP22Gus 的转基因植株间, Gus 活
性无明显差异; 启动子序列R SP1ö2 驱动 Gus 基因 的表达强度, 以茎杆和根系中最强 (达到了与 35S启动子相当的水平) , 叶片中次之, 颖壳中较弱。对转基因水稻种子中 Gus 活性的分析表明: 所有被检测的 pCAM 2R SP12Gus 和 pCAM 2R SP22Gus转基因种子在胚和胚乳组织中均未被染色, 种皮层只在胚的对侧有极小范围染色, 而大部分 pCAM 2
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图 3　　转基因植株中 Gus 基因的 PCR 检测
F Ig. 3　　PCR analysis of Gus in putative transgenic p lantlets
M , DNA m arker; P, 以 PCAM 2RSP12Gus 质粒为阳性对照; CK1,
以水为模板的阴性对照; CK2, 以未转基因植株为
阴性对照; 126, 转基因植株。
M , DNA m arker; P, PCAM 2RSP12Gus p lasm id as positive
contro l; CK1, the temp late is w ater as negative contro l;
CK2, non2transform ed p lantlet as negative contro l;
126, putative transgenic p lantlets. 35S2Gus 转基因种子的各部位均被染成蓝色 (图 42D )。　　半粒种法对 T 1 代幼苗和根系中 Gus 活性的进一步分析显示: pCAM 2R SP12Gus 和 pCAM 2R SP22Gus 转基因 T 0 代种子的胚和胚乳均未被染色, 但其对应的 T 1 代幼苗和根系大部分都能被染色; 而pCAM 235S2Gus 转基因植株中, T 1 代幼苗和根系的与其相应 T 0 代种子胚乳和胚的染色结果一致。可见, 启动子序列 R SP1 和 R SP2 驱动的 Gus 基因在转基因水稻种子的胚和胚乳中确实没有表达。3　讨论本研究中克隆的启动子序列和W ang 等[ 3 ]报道的序列间有一定差异, 包括 7 个变异碱基、4 个插入碱基和2个缺失碱基。其变异原因可能有二: 一
图 4　　转基因植株不同器官的 GU S 组织化学分析
F ig. 4　　H istochem ical analysis of GU S in different organs of transgenic rice p lants
A , 根系; B, 茎杆; C, 叶片; D , 种子。a, Gus 基因由 35S 启动子驱动; b, Gus 基因
由蔗糖合酶基因 R S uS 1 的启动子驱动; c, 未转基因水稻植株。
A , roots; B, stem s; C, leaves; D , seeds. a and b rep resent the Gus gene is driven by 35S and
R S uS 1 p romoter respectively; c, no2transform ed p lants as negative contro l.
是水稻亚种间基因组DNA 可能存在差异, W ang
等[ 3 ]报道的是粳稻的序列, 而本研究所用的是籼
稻; 二是启动子克隆和测序过程中也可能产生极小
的误差。比如, 在- 1219 到- 1230 区段 12 个连续
的腺嘌呤间多了一个碱基, 而在+ 576 到+ 587 区
段 12 个连续的胸腺嘧啶间缺失了两个碱基。
在分析水稻种子中Gus 基因的表达特性时采用
了半粒法, 综合了 T 0 代种子胚及胚乳与每粒种子
对应 T 1 代幼芽及根系中 GU S 组织化学分析的结
果, 排除了 T 0 代种子胚和胚乳中由于 Gus 基因的
分离而导致的假阴性。
植物转基因育种所用的启动子可分为组成型和
特异型两大类。组成型启动子驱动的外源基因在转
基因植物的所有时期和组织中都表达, 这不仅造成
了能量的浪费, 而且会带来转基因植物的安全性问
题[ 7～ 10 ]。因此, 特异性启动子的研究和应用日益受
到育种工作者的重视[ 11～ 16 ]。本研究用转基因的方
法证明水稻蔗糖合酶基因启动子可驱动Gus 基因在
转基因水稻的根、茎和叶中高效特异表达, 这与
Sh i等[ 4 ]在转基因烟草中的研究结果一致。
随着各种转基因作物的相继问世和种植面积的
不断扩大, 转基因食品安全性已成为公众关心的焦
点之一[ 7～ 9 ]。一般认为, 转基因食品可能存在的不
安全因素主要有两方面: 一是标记基因 (如抗生素
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抗性基因) 的水平转移可能导致病原微生物产生抗
药性; 二是转基因 (包括标记基因) 本身的编码蛋白
可能使食用者产生过敏性 (或毒性) 反应[ 7, 8 ]。从食
用安全性角度考虑, 转基因育种要尽量避免外源基
因在作物食用部分的表达。本研究表明, 水稻蔗糖
合酶 (R SuS1) 基因启动子驱动的Gus 基因在转基因
水稻种子胚乳和胚中都不表达, 在种皮中也只有极
小范围的表达, 该部位在精制过程中可被去除。可
见, 水稻蔗糖合酶 (R SuS1) 基因启动子用于水稻转
基因育种具有较高的食用安全性。我们已将由该启
动子驱动的B t 基因 (C ry IA c) 用农杆菌介导法导入
“秀水 11”等水稻品种, 并获得大量的转基因植株,
目前正在进行转基因植株的抗虫性评价。
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