全 文 ：Vol. 30 , No. 1
pp. 1～5 　Jan. , 2004
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 30 卷 第 1 期
2004 年 1 月 　1～5 页
用 in planta 方法转化甘蓝型油菜
徐光硕　饶勇强　陈　雁　张椿雨　孟金陵 Ξ
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 ,作物分子育种中心 ,湖北武汉 430070)
摘 　要 　用 in planta 方法进行遗传转化极大地促进了模式植物拟南芥的功能基因组研究 ,但在农作物中仍少有 in planta
的成功报道。我们采用 in planta 方法 ,用含有质粒 pSG529、pHTT613 和 ApSCO 的农杆菌菌株转化中油 821、湘油 13、宁 RS2
1、S250121、华双 3 号等甘蓝型油菜品种。在适宜的条件下 ,将根癌农杆菌菌液浸染甘蓝型油菜花序 10 d 至 15 d ,每天浸
染 1 至 2 次 ,共收获约 100 000 粒受处理的种子。将种子播撒在含有 270 mg·L - 1卡那霉素的选择培养基中选择转化植株。
卡那霉素抗性植株经 PCR 分析检测 ,结果在 5 个供试品种中均获得了转基因植株 ,平均转化效率 011 %左右 ,各甘蓝型油
菜品种间的转化效率无明显差异。这种方法方便、快速且无须经过组织培养阶段即可获得上百株转基因植株。该方法
的成功为建立更高效的甘蓝型油菜转基因方法以及开展甘蓝型油菜的功能基因组研究打下了基础。
关键词 　甘蓝型油菜 ;转基因 ;in planta ;农杆菌
中图分类号 : S565
Genetic Transformation of Brassica napus with in planta Method
XU Guang2Shuo , RAO Yong2Qiang , CHEN Yan , ZHANG Chun2Yu , MENGJin2Ling 3
( National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement , Center of Molecular Breeding , Huazhong Agricultural University , Wuhan 430070 , Hubei , China)
Abstract 　Genetic transformation with the in planta method has greatly promoted researches of functional genomics in
model plant , Arabidopsis . However few of crops was reported being transformed with the method. Via in planta method ,
genetic transformations of different Brassica napus cultivars , i . e. Zhongyou 821 , Xiangyou 13 , Ning RS21 , S250121 ,
Huashuang 3 were mediated by Agrobacterium containing plasmid pSG529 , pHTT613 and ApSCO separatively. Under the
suitable condition , the floral branches of Brassica napus were dipped in the suspension of Agrobacterium for 10 to 15 days.
The 100 000 seeds obtained by in planta method were selected on selective medium supplemented with Kanamycin 270
mg·L - 1 . The plants with Kanamycin resistance were analyzed by PCR. The result indicated that the alien genes were
transferred into all the five cultivars , and the transformation frequency near by 0. 1 % was very close among the cultivars.
Hundreds of transgenic plants were obtained by this simple , convenient , speedy and non2tissued cultural method. The suc2
cess of in planta method in B . napus showed that the foundation of the higher efficiency transformation method and the
genomics study of Brassica napus had been laid.
Key words 　Brassica napus ; Genetic transformation ; In planta ; Agrobacterium
　　在模式植物拟南芥中曾一直采用依赖于植物组
织培养的低效的遗传转化方法进行转基因实验。
1993 年 ,Bechtold 等发明了截然不同于离体方法的
in planta 转化法。他们将生成的花序剪掉 ,再用根
癌农杆菌通过真空渗入拟南芥花萼 ,几天后将新产
生的花序剪掉 ,重新用农杆菌浸泡 ,让之后的花正常
发育结实[1 ] 。每枝经过处理的植株可以获得 10 个
转基因种子 (占所有种子的 0. 4 %) 。Clough 和 Bent
简化了浸染液 ,并且使用了表面活性物质 ( Silwet
L77)使得转化效率略有提高 (收获的转基因种子占
所有种子的 0. 5 %) [2 ] 。Chung 等用农杆菌菌液对拟
南芥花序浸染或喷雾代替了真空浸染 ,获得了与真
空浸染的 in planta 方法相当的转化效率[3 ] 。由于 in
planta 方法避免了植物组织培养 ,使得操作变得简
单 ,并且防止了组织再生过程中细胞的突变 ,减小了Ξ基金项目 :国家转基因专项 (J00A200821)和武汉市重点科技攻关项目 (20002001006) 。
作者简介 :徐光硕 (1978 - ) ,男 ,植物分子生物学与生物化学专业硕士研究生 ; 3 通讯作者 (Corresponding author) :孟金陵 (1948 - ) ,男 ,农学
博士、教授 ,主要从事油菜生物技术和植物发育生物学研究。E2mail : jmeng @mail . hzau. edu. cn
Received(收稿日期) :2002208219 ,Accepted (接受日期) : 2003201213.

转基因的副作用 ,同时降低了对宿主植物依赖性 ,因
而被广泛应用于拟南芥的研究中[4 ] 。目前 ,in planta
方法已经成功应用在拟南芥转基因、拟南芥功能基
因组研究、基因定位、T2DNA 插入突变体的获得等方
面 ,这不仅成为 2000～2010 国际拟南芥基因组计划
中的基因功能鉴定的技术基础 ,同时也成为植物遗
传转化技术的一次重大进步。
Liu 等在白菜 ( Brassica campestris L. ssp . chinen2
sis) 中应用 in planta 方法获得了转基因后代[5 ] 。
Trieu 等使用根癌农杆菌浸泡蒺藜状苜蓿 ( Medicago
truncatula)的花或种子获得了转基因植株[6 ] 。这表
明 in planta 转化方法在其他植物品种中也有可能获
得成功。甘蓝型油菜与拟南芥同属十字花科 ,亲缘
关系很近 ,可以期望将已经在拟南芥中成功的 in
planta 方法应用于油菜。本实验室曾于 1999 年利用
根癌农杆菌介导的离体子叶法在一个甘蓝型油菜品
种中获得转基因植株 ;在此基础上用含有外源目的
基因的农杆菌悬浮液浸泡甘蓝型油菜花序 ,在不同
品种中均成功地获得了转基因后代。本文详细地报
道了用 in planta 转化甘蓝型油菜的方法。
1 　材料与方法
1. 1 　实验材料
农杆菌菌株 :农杆菌菌株 EHA105 分别含有质
粒 pSG529 和质粒 ApSCO ;农杆菌菌株 C58Ci 含有质
粒 pHTT613。
质粒 :pSG529 含有由拟南芥叶片中与衰老相关
基因启动子 SAG12启动的细胞激动素基因 ipt ,由华
中农业大学张启发教授提供 ,转化甘蓝型油菜品种
华双 3 号 ;pHTT613 含有拟南芥的无花瓣基因 ga2
ga1 ,由南京农业大学喻德跃教授提供 ,转化甘蓝型
油菜品种中油 821 ;ApSCO 含有由拟南芥叶片中与
衰老相关基因启动子 SAG12启动的草酸氧化酶基因
和几丁质酶基因 ,由本实验室构建 ,转化中油 821、
湘油 13、宁 RS21 和 S250121 四个甘蓝型油菜品种
(图 1) 。
供转化的甘蓝型油菜品种有 :华双 3 号、中油
821、湘油 13、宁 RS21 和 S250121。其中湘油 13 号由
湖南农业大学官春云教授提供 ,宁 RS21 由江苏省农
业科学院陈玉卿研究员提供 ,其余来自本实验室。
1. 2 　根癌农杆菌的培养
吸取甘油冷冻保存的含有目的基因的农杆菌
100μL ,接种于 10 mL 新鲜的 LB (1 %蛋白胨 ,0. 5 %
酵母提取物 ,1 % NaCl ,pH 7. 0) 培养基中 ,在 28 ℃左
右 150 rΠmin 振荡培养过夜。吸取上述培养物 10 mL
接种于 1 L 含有 50 mg·L - 1的卡那霉素的 5 %蔗糖培
养液中 ,在 28 ℃左右 150 rΠmin 振荡培养 24 h 以上 ,
直至 OD660 = 1～1. 5。
1. 3 　DNA微量提取液配方
每 10 mL DNA 微量提取液含 1 mL Tris2HCl (1
molΠL , pH 8. 0) ,1 mL EDTA (0. 5 molΠL , pH 8. 0) ,5
mL NaCl (2 molΠL) ,69. 44μL 巯基乙醇 (β2ME) 。
1. 4 　PCR检测转基因植株中外源 DNA片段
以提取的植株叶片总 DNA 为模板 ,根据 npt Ⅱ
基因的表达序列设计并合成引物 5′2CGTAAAG2
CACGAGGAAGC23′和 5′2AATGAACTCCAGGACGAGG2
3′。设计 PCR 反应的总体积为 20μL ,其中模板 500
ng ,dNTP 0. 2 mmol·L - 1 ,引物浓度 0. 5μmol·L - 1 。将
各组分均匀混合在 9 600 热循环仪上进行 PCR 反
应 :94 ℃3 min ;94 ℃1 min ,68 ℃1 min ,72 ℃2 min ,
35 个循环 ;72 ℃延伸 10 min ;4 ℃保存 ,通过凝胶电泳
检测 PCR 扩增片段。
2. 实验结果
2. 1 　根癌农杆菌菌液浸染油菜花序
将上述 OD660 = 1～1. 5 的农杆菌悬浮液在 8000
×g 下离心 8 min ,沉淀后的农杆菌用 1 L 新鲜的LB
培养基重新悬浮。用农杆菌悬浮液直接浸染油菜花
序。在油菜大田中选择花上没有露水和泥土的植
株 ,然后选择那些有花即将开放的分枝 ,剪去分枝上
LB tnos npt Ⅱ pnos pSAG12 ipt tnos RB
pSG529
LB tnos npt Ⅱ pnos p35S gaga1 tnos RB
pHTT613
LB tnos npt Ⅱ pnos pSAG12 chintinase tnos pSAG12 pr16 oxalic oxidase tnos RB
ApSCO
图 1 质粒 pSG529、pHTT613、ApSCO 中插入序列结构图谱
Fig. 1 The construction maps of insertion sequences in plasmid pSG529 , pHTT613 and ApSCO respectively
2 　　　作 　　物 　　学 　　报 30 卷 　

表 1 in planta 转化方法在各油菜品种中的转化效率
Table 1 The frequence of transformants in different cultivars of rapeseed by in planta method
用作转化的
农杆菌菌株
Agrobacterium
strain used
农杆菌中
所含质粒
Plasmid in the
Agrobacterium
甘蓝型油
菜品种
Cultivars of
B . napus
处理分枝
(个)
Branches
diped
收获种子
数 (粒)
Seeds
harvested
Km 抗性植
株 (个)
Plants with
Kanamycin
resistance
移栽至营养
钵存活植株
(个)
Alive plants
after transplanted
进行外源
DNA 检测的
植株 (个)
Plants
identified
DNA 检测
阳性植株
(个)
Plants with
the foreign
DNA
最终获得成
熟转基因植
株数 (个)
Adult
transgenic
plants
转化效率 3
Transformation
frequency 3
( %)
EHA105 ApSCO 宁 RS21 120 25 ,000 380 170 120 33 31 0. 124
中油 821 105 25 ,000 496 210 150 35 29 0. 116
湘油 13 130 20 ,000 254 98 68 22 22 0. 110
S250121 95 20 ,000 337 131 90 18 17 0. 085
华双 3 号 30 5 ,000 66 22 22 0 0 0
EHA105 pSG529 华双 3 号 30 1 ,800 70 67 42 12 12 0. 067
C58Ci pHTT613 湘油 13 30 3 ,300 68 68 2 2 2 2
总计 Total 540 100 ,100 1 ,671 766 492 112 111 0. 100
　　3 转化效率 = 最终收获的成熟转基因植株数收获的种子数 　3 Transformation frequency = Number of adult transgenic plantsNumber of harvested seeds
已经开放的花。将枝条弯曲 ,使整个花序浸泡在盛
有菌液的烧杯中 ,上下摇动 1 min 左右。在确保所
有花都已被浸染后 ,用硫酸钠纸袋将处理过的花序
套住。
整个过程自第一次浸染后每天或隔天进行一
次 ,共 10～15 次。每次浸染选择清晨和傍晚进行 ,
以避免太阳紫外线过强使农杆菌活性降低。雨天暂
停浸染。用含不同质粒的根癌农杆菌菌液分别处理
了 5 个甘蓝型油菜品种的数百个分枝。
于终花期将花序上的纸袋取下 ,管理好植株。
待种子成熟时 ,将经过 in planta 处理过的分枝剪下
单独收获种子 ,晒干后脱粒储藏。其中含有质粒
ApSCO 的菌液进行 in planta 处理 ,平均每个分枝收
获种子 198 粒。含有质粒 pSG529 的菌液进行 in
planta 处理 ,平均每个分枝收获种子 60 粒。含有质
粒 pHTT613 的菌液进行 in planta 处理 ,平均每个分
枝收获种子 110 粒 (表 1) 。
另外 ,在采用农杆菌悬浮液直接浸染油菜花序
法的同时也实验了 Clough 的方法 ,将培养好的农杆
菌悬浮液离心后重新悬浮于浸染液 (5 %蔗糖 ,200
μL·L - 1 Silwet277) 中 ,用浸染液浸泡花序 ,发现结荚
率很低 ,在最终收获的种子中也未获得转基因植株 ,
推测可能是 Silwet277 对花有损害。
2. 2 　转基因植株的筛选
在经过 in planta 处理的种子中选择较饱满者 ,
用 0. 1 %的升汞浸泡 12～15 min ,然后经无菌水清洗
3 次后 ,均匀播撒于含有卡那霉素的 MS固体培养基
上。卡那霉素设置 120 mg·L - 1到 370 mg·L - 1的浓度
梯度 ,最终选择的浓度为 270 mg·L - 1 。四到五天后 ,
图 2 经 in planta 方法获得的种子在含
卡那霉素( 270 mg·L - 1)的 MS 培养基上萌发出幼苗
Fig. 2 The seeds obtained by in planta method were cultured
on the solid MS medium with 270 mg ·L - 1 Kanamycin and
germinated into seedlings
左 :卡那霉素阳性幼苗 ,叶片嫩绿 ,发育正常 ;
右 :卡那霉素阴性幼苗 ,叶片叶柄已经白化。
Left : The plant with Kanamycin resistance showed no bleach
spots , keeping green and alive
Right :The plant without Kanamycin resistance exhibited bleached
spots throughout
萌发的幼苗中转入外源基因者具有卡那霉素抗性 ,
可以正常存活 ;未转入外源基因的幼苗不具有卡那
霉素抗性 ,子叶叶片边缘褐化 ,在子叶及第一片真叶
表面出现白斑 ,叶柄变紫变红 ,最终死掉 (图 2) 。将
存活下来的幼苗移栽至营养钵 ,经 DNA 检测确信外
源基因的存在后移至土壤中。其中质粒 ApSCO 转
化获得卡那霉素抗性幼苗 1533 棵 ,转移至营养钵后
存活植株 631 棵 ,其中 450 棵经 PCR 检测 ,阳性植株
为 108 棵 ,移栽大田后成活 99 棵。幼苗由培养基移
3　1 期 徐光硕等 :用 in planta 方法转化甘蓝型油菜 　　　

栽至营养钵的过程中 ,由于移栽技术问题损失幼苗
58. 7 %。质粒 pSG529 转化获得卡那霉素抗性幼苗
70 棵 ,其中 42 棵进行了 PCR 检测 ,筛选出 12 个阳
性植株。质粒 pHTT613 转化获得卡那霉素抗性幼苗
68 棵 ,尚未进行 PCR 扩增检测外源 DNA。
2. 3 　转基因植株的 DNA检测
为了在油菜苗期快速有效的检测转基因植株中
是否含有外源 DNA ,采用微量法提取植株总 DNA。
取转基因植株的幼嫩叶片 ,放在 1. 5 mL 的 Eppendorf
管中 ,加入 0. 2 mL 微量提取液。用电钻将 Eppendorf
管中叶片捣碎。再加入 0. 7 mL 微量提取液剧烈振
荡 ,然后在冰上静置 30 min。在 Eppendorf 管中加入
0. 5 mL 苯酚 , 上下颠倒混合后在 12 000 rΠmin 下离
心 5 min ,吸取 2Π3 体积上清移置新的 1. 5 mL Eppen2
dorf 管中 ,再加入 0. 6 倍体积的异丙醇 ,在 12 000 rΠ
min 下离心 6 min ,倒掉上清 ,待沉淀吹干后用 30μL
TE 溶解。用此方法可在较少的叶片内提取 1 份
DNA 样品。
以提取的叶片总 DNA 为模板 ,根据 npt Ⅱ基因
的表达序列设计引物 ,扩增 npt Ⅱ基因中 562 bp 的
片段。电泳检测扩增片段 ,可以看到各转基因植株
有与质粒对照相同的 562 bp 的条带 (图 3) 。
转化质粒 ApSCO 的植株共检测 450 棵 ,其中
PCR 阳性植株 108 棵 ,占检测植株的 24 %。转化质
粒 pSG529 的植株共检测 42 棵 ,其中 PCR 阳性植株
12 棵 ,占检测植株的 29 %。用含质粒 pSG529 的农
杆菌菌液进行 in planta 处理获得的卡那霉素阳性植
株也检测出 npt Ⅱ特异性 DNA 片段。
2. 4 　in planta 方法的转化效率
本实验室已经通过上述 in planta 方法将质粒
pSG529、pHTT613、ApSCO 中的外源 DNA 插入片段转
入中油 821 等 5 个甘蓝型油菜品种 ,并经过 PCR 检
测获得了转基因后代 ,转基因后代也表现出预期的
表型。其中转化质粒 ApSCO 时 ,通过此方法浸染了
480 个油菜分枝 ,共收获约 95 000 粒种子 ,除华双 3
号因收获种子数太少未获得转化植株外 ,其余 4 个
品种均获得了转基因植株。最终获得转基因植株
99 株 ,平均转化效率 0. 1 %左右。转化质粒 pSG529
时 ,通过此方法浸染了 30 个分枝 ,共收获 1 800 粒种
子 ,最终获得华双 3 号转基因植株 12 株 ,转化效率
约为 0. 07 %(表 1) 。
3 　讨论
随着植物基因工程的发展 ,植物基因转化研究
进展迅速 ,但仍然存在一些无法回避的问题 ,如操作
技术复杂 ,对宿主植物要求严格 ,转基因的稳定性以
及副作用等无法解决[7 ] 。in planta 转化由于不需要
组织培养使得操作变得简单 ,同时也缩短了转化周
期 ,可在短时间内一次性地获得大量转基因植株 ,从
而大大提高了转化效率[3 ] 。简单高效的 in planta 方
法可以更方便地从事基因定位、插入突变体的获得
以及其他转基因研究[8～10 ] 。随着功能基因组研究的
深入 ,对于基因功能、基因与基因间的相互作用的研
究都必须以获得大量的突变体为基础 ,这也使得 in
planta 方法得到最有效的应用[11 ] 。目前 in planta 方
法已经成功地应用于拟南芥大规模突变体库的建立
等功能基因组研究中[12 ] 。与我们先前在油菜中采
用的根癌农杆菌介导的子叶转化法相比较 ,用 in
planta 法转化油菜呈现明显的优越性 :1)不受宿主植
物基因型的影响 ,可以将外源基因导入子叶法转化
困难的油菜优良品种中 ;2)操作简单 ,无需经过烦琐
的组织培养阶段 ,大大减少了产生体细胞无性系变
异的可能性 ;3)对精密仪器和昂贵药品的依赖较小 ,
所投入的人力、物力、财力很少 ; 4) 可以在短时间内
获得大量的转基因植株。
拟南芥的 in planta 实验发现 ,如果转化发生得
比较早 ,在花粉和胚囊细胞中都将发现相同的纯合
的 T2DNA 插入 ,并且在转基因植株的不同组织细胞
中都发现了外源基因[1 ,13 ] ,说明转化发生在受精卵
有丝分裂以前。第一代的转基因植株中的 T2DNA
插入是杂合的 ,这表明转化发生在花发育的后期 ,雌
雄配子分化之后。因此用根癌农杆菌浸染是在花要
开未开的时候开始 ,在花谢之前结束。但目前尚不
清楚转化最初是发生在花粉、胚珠还是受精卵中 ,抑
或三者中都有可能发生。有关 in planta 转化的遗传
机制尚需进一步研究。
由于再生能力受基因型影响 ,许多油菜品种通
过传统的农杆菌介导法很难获得转基因植株。本研
究试验用分别含有三种质粒的两个农杆菌菌株转化
5 个甘蓝型油菜品种均获得了卡那霉素抗性植株 ,
除用菌株 C58Ci 转化的湘油 13 抗性植株尚未进行
外源 DNA 检测外 ,其余 4 个均获得了转基因植株 ,
这充分说明 in planta 方法对供试品种的基因型依赖
不大 ,可以广泛地应用于甘蓝型油菜品种。在早期
的转化方法研究中 ,曾尝试将农杆菌通过显微注射
或高压空气枪注射进植物子房中 ,成功地获得棉花
等转基因植株 ,这暗示着inplanta方法有可能应用
4 　　　作 　　物 　　学 　　报 30 卷 　

图 3 用 npt Ⅱ特异性引物 PCR扩增 DNA模板后的电泳图
Fig. 3 The electrophoretogram of PCR products amplified from DNA templates with npt Ⅱspecific primers
1～5. 中油 821 转基因植株 ;6～13. 湘油 13 转基因植株 ;14～15. 宁 RS21 转基因植株 ;
16. 质粒 ApSCO ;17. DNA marker。所有转基因植株均用含质粒 ApSCO 的农杆菌转化。
1～5. Zhongyou 821 transgenic plants ; 6～13. Xiangyou 13 transgenic plants ; 14～15. Ning RS21 transgenic plants ; 16. plasmid ApSCO ;
17. DNA marker. All the transgenic plants were transformed with Agrobacteria containing plasmid ApSCO.
于很多重要植物。
本试验虽然通过 in planta 方法获得了较多的转
基因油菜植株 ,但是转化效率仅达 0. 1 % ,比拟南芥
中的频率低 4～5 倍。这一方面是与我们对转基因
植株的筛选方法还不够完善有关。许多转基因植株
在经卡那霉素筛选移栽营养钵后 ,由于仍然有大量
卡那霉素残留在植株体内而死掉。适当降低选择培
养基中的卡那霉素浓度或建立新的筛选体系 ,可能
有助于提高转基因植株的转化频率。另一方面 ,我
们在将抗卡那霉素的幼苗从培养基中移栽至土壤中
时 ,由于技术操作问题造成较多的死苗 ,这也是导致
转基因植株数偏少的另一主要原因。改进幼苗移栽
和筛选技术 ,将有可能成倍地提高使用 in planta 方
法转化甘蓝型油菜的效率。
致 　谢 　华中农业大学张启发教授和南京农业大学
喻德跃教授提供了有关质粒 ,特致谢意。
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5　1 期 徐光硕等 :用 in planta 方法转化甘蓝型油菜