全 文 ：第26卷 第5期 作 物 学 报 V ol. 26, N o. 5
2000 年9月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA Sep. , 2000
应用自动荧光测序系统分析不同水稻基因型 SSLPsX
李 莉1 杨剑波1 D. J. M ack ill2 P. M. Colow it2
(1安徽省农业科学院水稻遗传育种农业部重点开放实验室, 安徽合肥, 230031; 2 美国加州大学戴维斯分校水稻遗传实验
室, CA 95616, U SA )
提 要 本研究使用30对微卫星引物, 对14个不同类型及来源的水稻基因型材料进行 SSR 片段长度的
多态性分析, 并运用自动荧光测序系统精确检测 SSL P 片段的长度, 结合 GeneScan2. 1和 Geno type2. 0
分析软件进行数据输出和图象处理, 得到了多态性丰富的微卫星标记。可以利用这些标记区别和鉴定
不同类型和来源的水稻种质材料, 并进行亲源关系的比较和遗传距离的估计。
关键词 自动荧光测序; 水稻; 简单序列重复; 多态性分析
Appl ica tion of Automa ted Fluorescen t- labelled System for SSL Ps
Ana lysis of D ifferen t R ice Genotypes
L IL i1 YAN G J ian2Bo1 D. J. M ack ill2 P. M. Co low it2
(1 K ey L aboratory of R ice Genetics and B reed ing f or A g ricultural M inistry , A nhui A cad em y of A g ricultural S ciences, H ef ei,
230031; 2 R ice Genetics L aboratory , U niversity of Calif ornia2D av is, CA 95616, U SA )
Abstract By using 30 pairs of m icrosatellite DNA p rim ers, SSL P s ( simp le sequence length
po lymorph ism s) of 14 rice geno types w ere analyzed w ith the autom ated fluo rescen t2labelled
system supported by GeneScan2. 1 and Geno type 2. 0 softw are. M icrosatellite DNA m arkers
w ith aboudan t po lymorph ism w ere gained, w h ich could be used fo r geno type iden tification and
genetics distance analysis.
Key words A utom ated fluo rescen t2labelled; R ice; Simp le Sequence R epeats; Po lymorph ism
准确、快速地对不同类型和来源的水稻基因型材料进行有效地区别、鉴定和遗传多样性
分析, 无论是对水稻种质资源的管理和利用, 还是对水稻种子纯度质量的控制乃至水稻分子
育种工作都具有十分重要的意义。借助对植株营养和生殖器官的形态学描述以及农艺学评
价, 一直是种质鉴定评价和亲缘关系分析的主要方法和依据。近十年来, 随着分子遗传学技
术和方法的不断创新, 从DNA 分子水平上直接检测和分析不同基因型材料的遗传差异和多
样性已经成为可能。微卫星 (M icrosatellite)DNA 分析技术, 又称之为简单序列重复 (Simp le
Sequence R epeats, 缩写为 SSR ) , 是依据真核生物基因组中普遍存在的2～ 4个核苷酸的简单
重复的特点, 利用同一生物不同基因型材料 SSR 的高度变异性和其两端序列的高度保守性,
从而设计合成互补性引物, 通过 PCR 扩增和有效的检测, 达到多态性分析之目的[ 1～ 3 ]。1993
年W u 等[ 4 ]率先对水稻基因组进行 SSR 分析, 其后的一些试验表明不同水稻基因型存在着丰
X 该研究受安徽省自然科学基金资助, 在美国加州大学戴维斯分校完成。
收稿日期: 1999209214, 接受日期: 1999212205
富的 SSL P s(Simp le Sequence L ength Po lymorph ism s) 变异, 并能够用于水稻遗传作图和种质
的区别与鉴定[ 5～ 8 ]。由于 SSR 主要表现为2～ 4个核苷酸重复次数的变化, 多态性片段长度的
差异可以小到2～ 4个 bp 之差, 这就需要灵敏有效的检测方法。我们先前的研究[ 9 ]比较了高密
度琼脂糖凝胶 (3% M etaphor A garose) 电泳、放射性[ 32P ]标记的聚丙烯酰胺凝胶电泳以及自
动荧光测序系统结合专门的软件分析, 发现后者非常适合水稻 SSL P s 分析, 能够区别仅为2
个 bp 之差的 SSL P s; 而且还能借助于不同的荧光染料标记 (红、蓝、黄、绿等) 在同一点样孔
内分析多个样品, 并自动给出 SSL P s 的片段大小和进行产物的数量分析; 同时也避免了放射
性污染, 具有快速、高效、精确、方便的优点。本文我们利用该方法对14个不同类型与来源的
水稻基因型材料进行 SSR 分析。
1 材料与方法
1. 1 供试品种
实验所使用的14个不同类型及来源的水稻基因型材料, 其中8个为 T emperate japon ica (温
带粳稻)、4个为 T rop ical japon ica (热带粳稻)和2个为 Indica (籼稻) , 其品名编号及来源见表1。
表1 用于微卫星分析的供试品种
Table 1 Cultivars used in study of m icrosatell ite DNA analysis
品种
Cultivars
编号
A ccession No.
来源
O rigin
T em perate japonica
M 2103 P I 527566 Califo rnia, U SA
M 2201 C I 9980 Califo rnia, U SA
M 2202 P I 494105 Califo rnia, U SA
M 2203 P I 54276 Califo rnia, U SA
M 2204 P I 559472 Califo rnia, U SA
M 2401 C I 9975 Califo rnia, U SA
Italica L inorno P I 291475 Italy
W C1403 P I 162254 Korea
T rop ical japonica
L 2202 P I 483097 Califo rnia, U SA
L 2203 P I 547249 Califo rnia, U SA
L abelle C I 9780 Southern U SA
87Y550 P I 566666 Califo rnia, U SA
Ind ica
B lack Gora India
IR 40931 Philipp ines
1. 2 D NA 的制备
分别取每一供试品种若干叶片, 参
照M cCouch (1988) 的方法[ 10 ] , 用液氮
研磨后, 加入抽提液 (100 mmolö L T ris2
HC l, 20 mmolö L ED TA , 500 mmolö L
N aC l, 1. 5% SD S) 60℃保温1小时, 再
加入等体积Ch lopheno l: isoam yl alcoho l
( 25 ÷ 24) , 轻轻摇匀, 离心 15 m in,
11000 r ö m in, 上清用异丙醇沉淀, 70%
乙醇洗涤, RNA 酶解后, 溶于 T E 中备
用。
1. 3 SSL P 分析
取上述不同基因型材料的DNA 作
为模板, 用 30 对微卫星引物 (RM 1,
RM 2, RM 3, RM 4, RM 5, RM 6, RM 7,
RM 8, RM 9, RM 10, RM 21, RM 41, RM 50, RM 83, RM 122, RM 148, RM 167, RM 168,
RM 204, RM 206, RM 209, RM 212, RM 217, RM 227, RM 238, RM 241, RM 253, RM 254,
RM 255, RM 263) 进行 PCR 扩增。PCR 反应条件为15 LL 的反应体积, 其中20 ng 基因组
DNA , 0. 1 Lmolö L p rim er, 1U T aq 酶, 200 Lmolö L dN T P, 50 mmolö L KC l, 10 mmolö L T ris
(pH 8. 0) , 0. 01% gelatin, 1. 5 mmolö L M gC l2, 33 nmolö L 荧光标记的 dCT P, 反应程序为
94℃ 1 m in, 55℃ 2 m in, 72℃ 1. 5 m in, 共30个循环, 最后在72℃延伸5 m in。反应产物在
DNA Sequencer (美国 Perk in2E lm er 377型)上经聚丙烯酰氨凝胶电泳, 结果使用 GeneScan2. 1
和 Geno type2. 0进行数据及图象处理。亲源关系及遗传距离的聚类分析使用 U PGM A
(unw eigh ted pair group m ethod w ith arithm etic m eans)方法。
665 作 物 学 报 26卷
图1 引物RM 7对14个水稻基因型 (从上到下: M 2103, M 2201, M 2202, M 2203, M 2204, M 2401, Italica, L 2202,
L 2203, L abell, Gora, IR 40931, 87Y550, W C1403) SSL P s 的荧光自动测序结合软件 Genotype 2. 0分析结果
F ig. 1 M icrosatellite p rofiles using p rim er RM 7 of 14 genotypes (F rom up to dowm: M 2103, M 2201,
M 2202, M 2203, M 2204, M 2401, Italica, L 2202, L 2203, L abelle, Gora, IR 40931,
87Y550, W C1403) Generated by DNA Sequencer w ith Genotype 2. 0
7655期 李 莉等: 应用自动荧光测序系统分析不同水稻基因型 SSL P s
2 结果与讨论
实验使用的30对微卫星引物, 其中18对没能在供试品种中找到 SSR 片段长度的多态性,
另外12对 (占供试引物的40% ) 则显示出 SSL P 的差异, 这中间7对引物 (RM 1, RM 2, RM 3,
RM 4, RM 5, RM 122, RM 164) 能够分别在供试品种中揭示6个以上的等位的多态性片段 (即
来自同一位点的 SSL P s) , 其余5对 (RM 6, RM 7, RM 9, RM 148, RM 167) 可揭示2～ 5个等位
的多态性片段, 整个实验一共发现68个不同的 SSL P s, 长度变化从86 bp～ 348 bp 之间, 平均
图2 引物RM 4, RM 5, RM 7对14个水稻基因型 (从左
到右: M 2103, M 2201, M 2202, M 2203, M 2204, M 2401,
Italica, L 2202, L 2203, L abelle, Gora, IR 40931,
87Y550, W C1403) SSL P 的荧光自动测序结合软件
GeneScan 2. 1分析结果
F ig. 2 M icrosatellite p rofiles using p rim er RM 4, RM 5,
RM 7 of 14 genotypes (F rom left To righ t: M 2103, M 2201,
M 2202, M 2203, M 2204, M 2401, Italica, L 2202, L 2203,
L abelle, Gora, IR40931, 87Y550, W C1403) generated
by DNA Sequener w ith GeneScan 2. 1
每对供试引物可产生2. 3个 SSL P s, 这反映
出 SSR 分析能够揭示丰富的遗传多态性。
实验结果表明: 利用DNA 荧光自动测序
系统进行的 SSR 分析能够精确地揭示仅有
几个 bp 之差的 SSL P s, 图1显示了 RM 7引
物对供试基因型的 SSR 分析结果, 通过精
确的分子量内标和有效的软件分析
(Geno type 2. 0) , 一共揭示了175 bp , 173
bp, 169 bp 三个不同的 SSL P s 片段, 其长
度虽然只相差几个 bp , 却能实现清晰的峰
型数字化显示。这也是自动测序系统结合
Geno type 软件进行 SSL P s 分析的优越之
处。不同的品种对应于同一微卫星引物,
可以产生不同的 SSL P s 片段 (图1) , 据此,
可以用作不同基因型材料的区别和鉴定工
作, 但使用一对引物要同时区别多个品种
尤其是遗传差异不大的品种往往是难以奏
效的, 这就需要在大量的微卫星引物实验
和筛选的基础上, 选择那些多态性丰富、
特异性强的 SSR 标记, 才能有效地进行不
同基因型的区别和鉴定。一般来说, 每个
供试品种对应于一对微卫星引物, 大多只
产生一个 SSL P 片段, 即一个品种只具有
等位性 SSL P s 中的一个, 也有个别引物能
够在同一基因型 (遗传纯合) 材料上产生两
个或两个以上的 SSL P s, 这可能是由于该
引物在同一基因组上有多个扩增位点, 如
图2中的 RM 4引物就在同一基因型材料中
产生了两个不同的 SSL P s 片段, 这是由于
RM 4引物分别在11染色体和12染色体上具有相同的扩增起始位点[ 6 ]。当然, 由于遗传不纯合
或本身就是杂交种或样品的混杂所产生的多个等位性 SSL P s 的情况另当别论。由于 SSR 标
记通常表现为共显性, 所以杂交种一般表现出双亲 SSL P s 的互补型, 利用这一点可以实现对
865 作 物 学 报 26卷
杂交种子真实性和纯度的快速鉴定 (资料未出示)。图2给出了三对微卫星引物 (RM 4, RM 5,
RM 7) 对不同供试品种 SSR 片段长度的多态性指纹 (GeneScan 2. 1分析) , RM 4引物在多数供
试品种上的同一位点均扩增出两个不同的 SSL P s 条带, 而RM 5、RM 7引物在供试品种上则
分别表现单一的 SSR 扩增带, 不同品种间只在扩增条带的分子量上即电泳迁移位置上表现
微小差异, 肉眼分辨比较容易混淆 (如图1的RM 7的扩增条带) , 为增强单一条带位置差异的
显著性, 图2中的RM 5, RM 7已用 GeneScan2. 1电脑分析软件对带型差异做了智能化处理, 使
之表现出不同的几何形状指纹图象, 从而体现了自动测序系统结合电脑软件分析揭示 SSR
片段长度多态性指纹的优越性和先进性。从图2中不难看出亲源关系较为接近的品种如M 2
103, M 2201, M 2202, M 2203, M 2204, 其指纹特征非常接近, 亲源关系较远的品种, 其 SSR
指纹特征变化也较大, 如籼型材料与粳性材料 (L abell 与 Gora)、T emperate japon ica 与
T rop ical japon ica (M 2202与L 2202)指纹差异都比较大, 这样通过使用多对引物, 对不同类型及
来源基因型材料进行 SSR 分析, 结合统计学方法, 就能对不同品种间的遗传距离和亲源关系
进行分析和估计, 图3就是根据微卫星引物对供试品种 SSR 片段多态性资料制成的聚类分析
图3 微卫星分析14个水稻基因型的聚类树状图
F ig. 3 Cluster dendrogram of 14 rice
cultivars by SSR analysis
树状图。图中反映的不同品种的遗传距离和
亲源差异和我们先前用RA PD 资料分析结果
基本一致[ 11 ]。我们曾用21个RA PD 引物对供
试水稻品种进行扩增片段多态性分析, 共扩
增出103个条带, 其中43个在供试材料中表现
多态性差异, 平均每个引物约产生2个多态性
条带; 本研究我们使用30对微卫星引物, 共
扩增出96个条带, 其中68个表现多态性差异,
平均每对引物约产生2. 3个多态性条带。微卫
星分析在热带粳稻和温带粳稻间所揭示的多
态性频率 (frequen t of po lymorph ism ) 为48% ,
而 RA PD 分析仅为33% ; 在温带粳稻内, 微
卫星分析所揭示的多态性频率为34% , 而
RA PD 分析仅为15%。这说明借助于自动荧
光测序系统所进行的微卫星分析较之 RA PD
分析更能有效地揭示不同基因型间的DNA
差异。
参 考 文 献
1 L itt M , J A L uty. A m J H um Genet, 1989, 44: 397～ 401
2 Tautz D. N ucleic R es, 1989, 17: 6463～ 6471
3 W eber J , P E M ay. A m J H um Genet, 1989, 44: 388～ 396
4 W u K, S D Tanksley. M ol Gen Genet, 1993, 24: 225～ 235
5 A kagi H , Y Yokozeki, A Inagaki. T heor A pp l Genet, 1997, 94: 61～ 67
6 Chen X, S Tem nykh, Y Xu. T heor A pp l Genet, 1997, 95: 558～ 567
7 O lufowote J, Y Xu, X Chen. Genom e, 1997, 40: 370～ 378
8 Panaud O , X Chen, S R M cCouch. M ol Gen Genet, 1996, 252: 597～ 607
9 李莉, 杨剑波, D J M ackill等. 中国水稻科学, 2000, 14 (3) : 129～ 133
10 M cCouch S R. T heor A pp l Genet, 1988, 76: 815～ 829
11 M ackillD J , Z Zheng, Genom e, 1996, 39: 969～ 977
9655期 李 莉等: 应用自动荧光测序系统分析不同水稻基因型 SSL P s