全 文 ：杜松烯合成酶作为转基因棉花
PCR检测的内参照基因
黄文胜　赵文军　陈红运　陈　颖　徐宝梁　朱水芳
(中国检验检疫科学研究院　北京　100025)
Validation of a cotton specific gene , (+)-d-cadinene synthase , used as the endogenous reference gene for real-
time PCR transgenic detection.Huang Wensheng , Zhao Wenjun , Chen Hongyun , Chen Ying , Xu Baoliang , Zhu
Shuifang(Chinese Academy of Inspection and Quarantine ,Beijing 100025 ,China)
Abstract　Many countries have issued regulations to label the genetically modified organisms(GMOs)and their derived
products.In this article ,we reported the development of specific primers and probe for the cotton(Gossypium hirsutum)
(+)-d-cadinene synthase gene and PCR cycling conditions suitalbe for which use as an endogenous reference gene in
PCR assays.Expect results were obtained when method was assayed with 7 different cotton varieties , and no amplification
were observed when other species , such as wheat , maize , tobecco , soybean , rice , tomato , pepper , eggplant were used as
templates ,which demonstrated the(+)-d-cadinene synthase gene was cotton specific , had low heterogeneity among the
tested cultivars.Therefore , this gene could be used as an endogenous reference gene of cotton in practial real time trans-
genic detection.
Key word　Genetically modified cotton , transgenic detection , real time florescent PCR
摘要　根据棉属植物中棉酚合成的关键酶之一杜松烯合成酶[ (+)-d-cadinene synthase]基因序列 ,设计
合成了该酶的实时荧光 PCR的引物和 TaqMan探针 ,经研究发现 ,此套引物探针能特异性检测海岛棉和陆地
棉 ,有较高的检测灵敏度 。同马铃薯 、大椒 、茄子 、烟草 、番茄 、玉米 、大豆 、小麦 、水稻和其它转基因作物无非
特异性反应 ,可以作为转基因棉花检测的内参照。
关键词　转基因棉花　转基因检测　实时荧光PCR
中图书分类号:Q789;S41
　　据国际农业生物技术应用咨询服务中心(www.
ISAAA.org)统计 ,在 2004 年 ,全球转基因棉花种植
面积 7400万 hm2 ,占全球棉花种植面积的 30%,其
中中国种植了 370万 hm2 的转基因棉花 ,比 2003年
提高了 32%, 占全球转基因棉花种植面积总额的
5%。转基因作物对生态环境和人类健康的影响 ,已
引起世界各国的高度重视 。为了加强对转基因农作
物的管理 ,中国于 2002年 3月开始实施《农业转基
因生物安全管理条例》 ,对转基因生物及其制品进行
标识管理 ,转基因生物及其制品从生产 、运输 、销售 、
进出口等环节都要实行检验监控。
棉花是锦葵科棉属(Gossypium)植物 ,陆地棉种
植最广 ,其产量占世界棉花总产量的 90%左右 ,海
岛棉纤维细长 ,又称长绒棉 ,其产量占世界棉花总产
量的 10%左右 。棉酚是棉属植物中的一种抗虫杀
菌物质 ,广泛分布在棉花的根 、茎 、叶和果实的表面
腺体中 。本文选取棉酚合成的 3个关键酶之一杜松
烯合成酶[ (+)-d-cadinene synthase]基因作为棉花转
基因检测的内参照基因[ 1 , 2] 。
1　材料和方法
1.1　材料和试剂
海岛棉品种海棉 15号和海棉 18号从中国农科院
棉花所棉花种质库购买 ,陆地棉品种鲁棉3号 、鲁棉 5
号 、冀棉、孟山都公司的保铃棉种子和中国农科院的抗
虫棉种子由河北植保所惠赠 ,马铃薯 、大椒 、茄子 、烟
草 、番茄、玉米 、大豆 、小麦和水稻种子从市场购买。Taq
酶体系(Takara)、dNTPS购自大连宝生物公司。
1.3　引物与探针
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2006 年第 1 期　　　　　　　　　　植物检疫　PLANT QUARANTINE　　　　　　　　　　Vol.20　No.1
收稿日期:2005-03-03
根据陆地棉(G.hirsutum)、亚洲棉(G.arboreum)和海
岛棉(G.barbadense)的杜松烯合成酶基因(Genebank 序列
号分别为 AF270425.1、U23206.1和 AF45610.1)的基因组
DNA序列 ,采用 ClustralW软件对序列进行比对 ,选取保
守区序列 ,采用 Primer Premier 5.0进行引物 、探针的设
计。正向引物:5′CTGAAAAACGCCACCAACAA 3′;反向引
物:5′CTTTTGGGTTGAATTAGCCATTG 3′;TaqMan 探针:
Fam 5′TGAAAGAAGAAGTGAGGAAGATGATTGTGGCA 3′
Tamra ,引物与荧光素修饰的探针由大连宝生物技术有限
公司合成。
1.4　样品 DNA的提取
采用宝生物工程(大连)有限公司生产的 GMO
DNA提取试剂盒(贷号 D9093)并按其操作说明进
行。用紫外光分光光度计测定 DNA 的浓度和纯度
后 ,将样品 DNA保存于-20℃备用 ,并通过 0.7%的
琼脂糖凝胶电泳观察提取的 DNA的质量 。
1.5　样品 DNA的 PCR扩增
样品 DNA 提取后 ,稀释到 100ng/μL ,在 200μL
的PCR管中加入如下成分进行 PCR扩增。在 50μL
的反应 体系中 , dATP 、 dGTP 、 dTTP 和 dCTP 各
0.2mmol/L;引物浓度 0.2μmol/L;Taq 酶 1 U;样品
DNA 100ng;Taqman 探针 0.2μmol/L;1 ×PCRbuffer
(500mol/L KCl , 100 mmol/L Tris.HCl pH 8.3 , 15
mmol/L MgCl2 ,1 g/L BSA)。PCR循环条件是:95℃
变性 3min后 , 94℃30s;55℃30s共 40个循环 。PCR
反应在ABI 310型 DNA分析仪上进行。
2　结果
2.1　样品 DNA的提取
采用宝生物的 DNA纯化试剂盒提取的总 DNA ,
电泳检测结果表明提取的 DNA完整性很好 。经紫
外分光光度计检测 ,这种方法能够从50mg种子中分
离到约 20μg 的总 DNA ,其 A260/A280值约 1.70 ,纯
度符合实验的要求。
2.2　特异性实验
以大豆 、玉米 、保铃棉 、番茄 、马铃薯 、茄子 、甜
椒 、大米 、小麦 、烟草等的总 DNA为模板 ,进行实时
荧光 PCR反应 ,测试本文合成的荧光 PCR反应体系
的特异性 ,结果只有 7个棉花样品产生荧光信号 ,其
它粮食 、蔬菜转基因作物都没有荧光信号 ,证明本方
法对海岛棉和陆地棉都可以检测 ,同供试茄科及粮
食作物样品无非特异性反应(见图 1)。
图 1　实时荧光 PCR检测棉花内
标基因的特异性实验
基线上方:从左至右依次是冀棉 、保铃棉 、国抗棉、海棉 15号 、海
棉 18号 、鲁棉 3号 、鲁棉 5号
基线下方:从上到下依次是马铃薯、大椒 、茄子 、烟草、番茄 、玉米 、
大豆 、小麦和水稻
2.3　灵敏度实验
图 2　荧光 PCR检测棉花杜松烯
合成酶基因的灵敏度
　基线上方:含量分别为 100ng 、20ng 、5ng、500pg 、80pg 的棉花总 DNA
　基线上方:空白对照　B:阴性对照
为了确定本文的实时荧光检测体系的绝对灵敏
度 ,以转基因棉花“保铃棉”的种子为试材 ,提取总
DNA ,系列稀释为 100ng 、20ng、5ng 、500pg 和 50pg ,加
入本文合成的荧光 PCR反应体系进行测试 ,试验结
果见图 2 ,在模板量为 80pg 时还有明显可判别的荧
光信号 。假如每个细胞含 2个拷贝的杜松烯合成酶
基因 ,而棉花的单倍体基因组大小为 1.20 ～ 2.23pg
左右 (http://www.rbgkew.org.uk/cval/homepage.
html)[ 3] ,那么绝对检测限 80pg DNA ,等同于 PCR反
应中有 25 ～ 75个左右拷贝的目的基因。
3　讨论
转基因产品检测时 ,需要选择该植物的本身的
某个基因作为内源参照基因 。在对植物进行转基因
定性检测时 ,通过对内源基因进行 PCR检测 ,可以
判断样品核酸的质量 ,即如果内源基因的 PCR扩增
失败 ,说明所抽提的核酸中不含该植物的 DNA 或者
所抽提的核酸含有 PCR抑制物质 ,从而可以避免转
基因检测的假阴性结果。因而 ,转基因检测的内源
参照基因应具有物种特异性 ,即该基因存在于该植
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物的所有品种中 ,但在其它植物中检测不出来 ,并有
恒定的拷贝数。试验表明本文设计合成的杜松烯合
成酶基因的实时荧光 PCR方向可作为转基因棉花
PCR检测的内参照基因。
参考文献
1　Tan X P , Liang W Q , Liu C J , et al.Expression pattern of(+)-delta-
catdinene synthase genes and biosynthesis of sesquiterpente aldehydes in
plants of Gossypium arboreum L.Planta , 2000 , 210(4):644～ 651
2　Davis E M , Chen Y S , Essenberg M.Sequence of a(+)-delta-cadinene
synthase gene(Accession No.U88318)induced in Gossypiun hirsutum L.
by bacterial infection(PGR98-040).Plant Physiol , 1998 , 116(3):1192
3　BennettM D , Leitch I J.Nuclear DNA amounts in angiosperms.Annals of
Botany , 1995 ,76:113～ 176
进境小麦中沙地牧草腥黑粉菌的鉴定
刘素萍1 , 2　易建平1　周国梁1　叶　军1　印丽萍1
(1.上海出入境检验检疫局　200135　2.华南农业大学)
Identification of Tilletia ehrhartae from imported Australian wheat.Liu Suping[ 1 ,2] , Yi Jianping1 ,Zhou Guoliang1 ,
Ye Jun1 ,Yin Liping1(1.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau ,Shanghai 200135;2.South China Agri-
cultural University ,Guangzhou 510642)
Abstract　Teliospores similar to Tilletia indica were found in imported wheat from Australia and identified as T .ehrhar-
tae based on the morphological characteristics and PCR analysis.This tuberculate teliospore was described.A nested PCR
method was developed to detect teliospore of T .ehrhartae with primers Eh2/Eh4 and Till/Til4 designed form ITS se-
quence of T .ehrhartae.
Key words　Tilletia ehrhartae ,nested PCR , identification
摘要　从上海口岸进境的澳大利亚小麦中发现一种类似小麦印度腥黑粉病菌的腥黑粉菌冬孢子 ,对该菌
冬孢子进行了形态学特征和 PCR检测 ,根据结果 ,将这种冬孢子鉴定为沙地牧草腥黑粉菌 Tilletia ehrhartae;本
研究设计了 T .ehrhartaea 的特异引物 Eh2/Eh4 ,结合引物 Till/Til4建立了 T .ehrhartae 的套式PCR检测方法 。
关键词　沙地牧草腥黑粉菌　套式 PCR　鉴定
中图分类号:S41;S432
　　小麦印度腥黑穗病菌 Tilletia indica Mitra 是世
界关注的检疫性有害生物 ,其冬孢子和黑麦草腥黑
粉菌 T.walkeri 、水稻腥黑粉菌 T.horrida 等病菌冬
孢子形态特征十分相似[ 1 ,2] 。自 1996年美国报道小
麦印度腥黑穗病菌以后[ 2～ 3] ,欧盟 、美国和澳大利亚
等加强 T .indica 鉴定方面的研究[ 4 ,5] ,国内外都建
立了分子生物学的检测方法用于区分 T.indica 及
T.walkeri 等近似种[ 4～ 8] 。
2004年 5月 ,上海出入境检验检疫局在澳大利
亚小麦中截获了一种与 T.indica 形态特征极为相
似的沙地牧草腥黑粉菌 T .ehrhartae 。目前 ,有关这
一病菌的研究很少 ,对此我们开展了形态学和分子
生物学检测方面的研究 ,本文报道有关研究结果。
1　材料与方法
1.1　供试病菌冬孢子
本研究用的8个不同腥黑粉病菌及来源详见表1。
表 1　试验用腥黑粉菌冬孢子
菌　株 编　号 来　源 年　份
T.walkeri CA21 美国 2001
T.indica FI02 印度(上海截获) 1997
T.ehrhartae TES01 澳大利亚(上海截获) 2004
TEA01 澳大利亚 1991
T.nigrifaciens TINA01 澳大利亚 2000
T.horrida D01 中国江苏 2001
T.controversa VC01 美国(上海繁殖) 2001
T.caries DL01 辽宁检验检疫局 2001
T.laevis HB01 中国河北 2001
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2006 年第 1 期　　　　　　　　　　植物检疫　PLANT QUARANTINE　　　　　　　　　　Vol.20　No.1
本研究得到上海市重大科技攻关项目(03DZ19315和 04DZ05002)及国家质检总局科技专项(2004IK046)的资助。
收稿日期:2005-03-07