全 文 ：Vol. 29 , No. 6
pp. 942～946 　Nov. , 2003
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 29 卷 第 6 期
2003 年 11 月 　942～946 页
水稻 PCD 相关基因的定位研究
李喜焕1 　刘国振1 　刘国庆1 ,2 　朱立煌2 　马峙英1
(1 河北农业大学 ,河北保定 071001 ;2 中国科学院遗传研究所 ,北京 100101)
摘 　要 　植物中的细胞程序化死亡 (PCD)在植物的发育、抗病及植物与环境互作等过程中发挥着极其重要的作用。本
研究以我国学者发现的特殊的水稻细胞死亡控制突变体 3037 (M) 为材料 , 采用微卫星 DNA 标记 (共计 159 个微卫星引
物) 技术对突变体性状进行基因定位研究。结果表明 , 该突变体 PCD 基因位于水稻的第 8 染色体和第 12 染色体 ,为下
一步精细定位突变体基因及基因克隆奠定了基础。Ξ
关键词 　水稻 ;细胞程序化死亡 (PCD)突变体 ;SSR
中图分类号 : S5111032 　　　文献标识码 : A
The Tag Analysis of Rice PCD2related Gene
LI Xi2Huan 1 　LIU Guo2Zhen 1 　LIU Guo2Qing 1 ,2 　ZHU Li2Huang 2 　MA Zhi2Ying 1
(1 Agricultural University of Hebei , Baoding , Hebei 071001 ;2 Institute of Genetics , Chinese Academy of Sciences , Beijing 100101 , China)
Abstract 　　Programmed cell death (PCD) is important for plant growth , disease resistance and its interactions with en2
vironment1 A special rice cell death mutant 3037(M) was analyzed using SSR technology to tag the mutant gene1 The results
indicated that the mutant gene was located on rice chromosomes 8 and 121 So they could be the reference to tag , clone the
mutant gene1
Key words 　　Rice ; Programmed cell death (PCD) mutant ; SSR
　　PCD ( Programmed Cell Death) ,是指由细胞内死
亡程序所控制的细胞死亡。生物在生长发育及形态
建成过程中 ,利用 PCD 来控制细胞数目 ,或作为一
种防御机制清除被感染、被诱变或被损伤的细胞[1 ] 。
因此 PCD 是生命活动不可缺少的组成部分。在植
物的生长发育过程中 ,自始至终都存在着细胞死亡 ,
如根系生长发育中表皮细胞的死亡、维管束分化过
程中导管细胞的死亡、花粉发育中绒毡层细胞的死
亡、植物叶片的衰老与死亡等[2～4 ] 。
植物中已报道了一些细胞死亡控制突变体。到
目前为止 ,玉米有 40 多种类似的突变体[5～7 ] ,拟南
芥中报道了 8 个类似突变体[8 ,9 ] ,Hu 等[10 ] 报道的大
麦中的 4 个突变体 ,被定位在同一基因簇位点上 ,其
中 3 个突变体表现共显性 ,1 个表现隐性。在水稻
中 ,Singh[11 ]共报道了 12 个类似的突变体 ,这些突变
性状大多数被定位于水稻的传统遗传连锁图上 ,并
作为标志基因广泛应用。最近 ,我国的程祝宽等在
籼稻中发现了一种突变体 ,根据坏死斑的发生特征
初步判断 ,它可能是一个新的水稻细胞程序化死亡
突变体[12 ] 。本文研究的目的即在于对该突变体基
因进行初步定位研究。
1 　材料与方法
111 　材料
　　①3037 (突变体) ,简称 3037 (M) ,籼稻 ,亲本之
一 ,由扬州大学农学院提供。
②02428 ,粳稻 ,亲本之二 ,由中国科学院遗传
研究所提供。
③3037 (野生型) ,简称 3037 (W) ,籼稻 ,由扬州
大学农学院提供。
④F2 群体 ,3037 (M)与 02428 杂交后的 F1 自交
产生的后代群体。Ξ基金项目 :国家自然科学基金资助课题 (39880020) 。
作者简介 :李喜焕 (1974 - ) ,女 ,河北保定人 ,助教 ,硕士学位 ,细胞、分子遗传及育种应用。
Received(投稿日期) :2002203222 , Accepted (接受日期) :20022072281

112 　方法
试验采用 159 个水稻 SSR 引物 ,每个引物由一
对 20 核苷酸左右特异序列组成。25μL 的反应体系
中 ,模板 DNA 30 ng , 016μmolΠL SSR 引物 , 10 ×PCR
buffer 215μL ,012 mmolΠL dNTPs , 115 U Taq 酶。SSR
扩增程序 :94 ℃5 min ;94 ℃1 min ,58 ℃1 min ,72 ℃1
min 30 s ,35 个循环 ;72 ℃10 min。
2 　结果与分析
211 　杂交亲本( 3037( M)与 02428)间 SSR引物筛选
结果
　　试验采用水稻遗传连锁图上的 159 个 SSR 引
物 ,分别扩增 2 个杂交亲本〔3037 (M) 与 02428〕的
DNA 样品。结果表明 ,在 2 个材料间具有明显扩增
产物的 SSR 引物有 105 个 ,其余 54 个引物不能扩增
出产物 ,表明 SSR 技术揭示不同材料间多态性的可
行性。105 个具扩增谱带的 SSR 引物 ,经独立重复 3
次后 ,有 62 个引物在两个亲本间具有稳定可靠的多
态性谱带 ,揭示了双亲间 SSR 位点的多态性 (图 1) 。
表 1 列出了在双亲间表现多态性的 62 个 SSR 引物
的扩增结果。
表 1 中的 62 个多态性引物 ,揭示了双亲间的多
态性情况 ,它们在水稻染色体上的分布比较均匀 ,其
中以位于染色体 2 的引物数量最多 ,达 11 个 ,而且
大部分聚集于染色体长臂上 ,说明双亲在此处的多
态性较高 ,差异较大 ;其次 ,以分布在染色体 1、6、7、
9、10、11、12 的引物数量为多 (4～7 个) ,而且分布比
较接近 ;以分布于染色体 3、5、8 引物较少 (2～3
个) 。这些多态性引物在染色体上的分布情况说明 ,
它们能够作为一套多态性引物材料 ,用于 3037 (M)
表 1 62 个 SSR多态性引物对杂交亲本 3037( M) 、02428 的扩增结果
Table 1 Total and polymorphic SSR primers amplified with DNA of 3037( M) and 02428
序号
Number
引物
Primer
谱带数
Bands
number
多态性谱带数
Polymorphic
bands number
染色体
Chromosome
序号
Number
引物
Primer
谱带数
Bands
number
多态性谱带数
Polymorphic
bands number
染色体
Chromosome
1 RM23b 2 2 1 82 RM250 2 2 2
6 RM29 3 2 2 84 RM253 2 2 6
7 RM30 3 2 6 87 RM256 2 2 8
17 RM47 4 1 7 88 RM257 2 2 9
18 RM48 2 1 2 89 RM258 2 2 10
26 RM80 4 2 8 92 RM261 2 2 4
32 RM201 2 2 9 93 RM262 2 2 2
33 RM202 2 2 11 102 OSR2 2 2 1
35 RM204 3 3 6 106 OSR6 2 2 11
36 RM205 2 2 9 107 OSR7 3 1 8
37 RM206 2 2 11 115 OSR15 2 2 4
38 RM207 2 2 2 120 OSR20 2 2 12
39 RM208 2 2 2 126 OSR26 2 2 2
40 RM209 4 2 11 127 OSR27 2 2 1
43 RM212 2 2 1 128 OSR28 2 2 9
44 RM213 2 2 2 129 OSR29 2 2 9
51 RM220 2 2 1 131 OSR31 3 3 3
52 RM221 5 3 2 132 OSR32 2 2 12
53 RM222 2 2 10 133 OSR33 2 2 10
54 RM223 2 2 8 202 RM2 2 2 7
55 RM224 2 2 11 203 RM3 3 2 6
57 RM226 3 3 4 206 RM6 3 3 2
59 RM228 2 2 10 211 RM11 2 2 7
65 RM233B 2 2 5 211’ RM13 2 2 5
66 RM234 2 2 7 212 RM14 4 4 1
67 RM235 2 2 12 213 RM16 2 2 3
72 RM240 2 2 2 217 RM20A 3 3 12
74 RM242 2 2 9 217’ RM20B 2 1 11
78 RM246 2 2 1 218 RM21 2 1 11
79 RM247 2 2 12 223 RM123 2 2 ?
80 RM248 2 2 7 228 RM168 2 2 3
　　注 : ?表示目前尚未定位于染色体的引物。
349　6 期 李喜焕等 : 水稻 PCD 相关基因的定位研究 　　　

与 02428 杂交后代分离群体 ,筛选与突变基因连锁
的标记 ,并将目标基因定位。因此 ,这些在双亲间具
有多态性的引物 ,为以后基因精细定位打下了良好
的基础。图 2 表示多态性引物在水稻 12 条染色体
上的分布情况。
图 1 部分多态性 SSR 引物对 3037(M)与 02428 的扩增结果
Fig11 Results of polymorphic SSR primers amplified with 3037 (M) and 02428
1～15 是部分多态性 SSR 引物 ,引物序号从右至左分别为 32、33、35、37、39、44、52、55、57、66、67、74、79、82、88。
1 —15 are polymorphic SSR primers1 The primer number from right to left is 32 ,33 ,35 ,37 ,39 ,44 ,52 ,55 ,57 ,66 ,67 ,74 ,79 ,82 ,881
图 2 SSR 多态性引物在水稻染色体上的分布示意图
Fig12 Distribution of SSR polymorphic primers on rice chromosomes
注 : # 表示 OSR 系列引物 ,图中只标明 OSR 引物所在染色体 ,并不表示在染色体上的准确位置。
212 　突变体与野生型间 SSR引物筛选结果
突变体与野生型材料之间 ,除突变性状以外 ,其
余基因基本一致 ,因此 ,在突变体与野生型间具有多
态性的引物 ,可能就是与突变基因连锁的标记。对
于在突变体与野生型间表现多态性的引物 ,采用突
变体亲本单株 DNA [记作 3037 (M1) ～3037 (M6) ] ,
以及 F2 [3037 (M) ×02428 杂交 F1 自交后代 ]4 株突
变体单株 DNA 分别来检验。结果表明 ,在 159 个
SSR 引物中 ,独立重复 3 次后 ,只有引物 26 (RM80) 、
54 (RM223) 、87 ( RM256) 、132 (OSR32) 表现稳定可靠
的多态性谱带 (图 3 ,图 4 ,图 5) ,表明这 4 个 SSR 引
物是与突变基因连锁的标记。由于这 4 个多态性引
物分别位于水稻染色体 8 和 12 ,因此 ,将目标基因
定位于水稻第 8 染色体和第 12 染色体。图 6 表示
引物 26 ( RM80 ) 、54 ( RM223 ) 、87 ( RM256 ) 、132
(OSR32)在水稻染色体上的详细位置。表 2 列出了
具有稳定可靠多态性谱带的SSR引物扩增情况。其
中引物 26 (RM80) 、54 (RM223) 、87 (RM256) 位于染色
体 8 ;引物 132 (OSR32)位于染色体 12。
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图 4 引物 RM223 对 3037(M) 、3037(W) 、3037(M1)～3037(M6)
亲本单株及 F2 突变体单株同时扩增结果
Fig14 Results of RM223 amplified with 3037 (M) ,3037 (W) ,
3037(M1)～3037(M6) ,F2 mutant DNA
1、5、9、13 为 3037(W) ;2 为 3037(M) ;3、4、6、7、8、10 为 3037
(M1) —3037(M6) ;11、12、14、15 为 F2 突变体。
1 ,5 ,9 ,13 :3037 (W) ;2 :3037(M) ;3 ,4 ,6 ,7 ,8 ,10 :3037 (M1) —
3037(M6) ;11 ,12 ,14 ,15 :F2 mutant DNA1图 3 多态性 SSR 引物对 3037(M)与 3037(W)扩增结果Fig13 Results of polymorphic SSR primers amplifiedwith 3037 (M) and 3037(W)M为分子量标记 ;引物序号从右至左分别为 87(RM256) ,54(RM223) ,132(OSR32) ,26(RM80) ;[DNA模板 :右 3037(M) ,左3037(W) ]。M is DNA marker ; the primer number from right to left is 87(RM256) ,54 (RM223) ,132 (OSR32) ,26 (RM80) ; [DNA :right 3037 (M) ,left3037(W) ]1
图 6 4 个 SSR 多态性引物在
水稻染色体上的详细分布图
Fig16 Distribution of four polymorphic SSR
primers on rice chromoromes
图 5 引物 RM256 对 3037(M) 、3037(W) 、3037(M1)～3037(M6)
亲本单株及 F2 突变体单株同时扩增结果
Fig15 Results of RM256 amplified with 3037 (M) ,3037 (W) ,
3037(M1)～3037(M6) ,F2 mutant DNA
1 为 3037(M) ;2 为 3037(W) ;3～8 为 3037(M1)～3037(M6) ;
9～12 为 F2 突变体。
1 :3037 (M) ; 2 :3037(W) ;3 —8 :3037 (M1) —3037(M6) ;9 —12 :
F2 mutant DNA1
表 2 4 个多态性 SSR引物在 3037( M)与 3037( W)间的扩增结果
Table 2 Total and polymorphic SSR primers amplified with DNA of 3037( M) and 3037( W)
序号
Number
引物
Primer
序　　列
Sequence (5’23’) SSR 谱带数Bands number 多态性谱带数Polymorphic bands number 染色体Chromosome
26 RM80 TTGAAGGCGCTGAAGGAG 4 2 8
CATCAACCTCGTCTTCACCG
54 RM223 GAGTGAGCTTGGGCTGAAAC 3 2 8
GAAGGCAAGTCTTGGCACTG
87 RM256 GACAGGGAGTGATTGAAGGC 2 2 8
GTTGATTTCGCCAAGGGC
132 OSR32 CTCCAGCTTCGGCAACGTCA 3 2 12
CTTCTTGATTCCATAAATCGT
549　6 期 李喜焕等 : 水稻 PCD 相关基因的定位研究 　　　

3 　讨论
PCD 是生物体内一种主动的、为了自身发育及
抵抗不良环境需要而按照一定的程序结束生命的过
程。由于植物 PCD 与发育及抗病等过程有密切关
系 ,因此已成为生物学研究的热点[1 ] 。本研究初步
筛选到 4 个与 PCD 相关基因有关的 SSR 引物 ,并将
基因定位于水稻染色体 8 和 12。染色体 12 上的标
记只有一个而且在染色体的末端 ,染色体 8 上的标
记共有 3 个而且彼此距离较近。
本研究利用 159 个 SSR 引物 ,在双亲间得到 62
个稳定可靠的多态性引物。这些引物同形态学标记
一样 ,可以作为一个位点在杂交分离群体中表现分
离 ,并具有一定的分离比例。因此依据这些多态性
标记和突变体性状 ,在分离群体中是否共分离或共
分离的程度 ,可以找到与突变体基因紧密连锁的多
态性标记 ,并将突变体基因精细定位。
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