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第 28 卷 第 3 期 作　物　学　报 V ol. 28, N o. 3
2002 年 5 月　 294～ 300 页 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA pp. 294～ 300　M ay, 2002
农杆菌介导的牡丹江 8 号高效转基因体系的建立Ξ
林拥军3 　陈　浩　曹应龙　吴昌银　文　静　李亚芳　华红霞
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室分子生物学分室, 湖北武汉, 430070)
摘　要　粳稻品种牡丹江 8 号具有繁殖周期短、对多个白叶枯病和稻瘟病生理小种感病或高度感病的优点, 因此, 是
水稻抗白叶枯病和抗稻瘟病基因克隆研究中候选基因功能验证的一个理想受体。本试验通过对农杆菌侵染参数的优
化, 建立了农杆菌介导的牡丹江 8 号高效转基因操作体系。在 3 次重复试验中, 该转基因操作体系抗性愈伤转化率分
别为 67. 5%、75. 8% 和 70. 0% , 抗性植株转化率分别为 36. 2%、42. 1% 和 37. 9% , 具有较高的转基因效率和转基因稳
定性; 并作为标准化操作程序应用于多个粳稻品种的农杆菌介导的转基因研究。
关键词　水稻; 农杆菌介导的遗传转化; 程序化操作体系
中图分类号: S511　　　文献标识码: A
Establ ishmen t of H igh-eff ic iency Ag robacter ium -media ted Genetic Tran sforma tion
System of M udan jiang 8
L IN Yong2Jun3 　CH EN H ao　CAO Ying2L ong　WU Chang2Yin　W EN J ing　L I Ya2Fang
HUA Hong2X ia
(N ational K ey L aboratory of C rop Genetic Im p rovem ent, H uazhong A g ricultural U niversity , W uhan 430070, China)
Abstract　M udan jiang 8, a jap onica rice cultivar w ith desirable characteristics of sho rt life2span and relatively
h igh sensibility to m any bacterial bligh t races and blast races, is an ideal transfo rm ation accep to r fo r function
iden tification of putative resistan t2genes. By op tim izing the param eters affecting A g robacterium strain infection,
th is study has established a h igh2efficiency A g robacterium 2m ediated genetic transfo rm ation system. In th ree
rep licate experim en ts, transfo rm ation efficiency of resistan t calli is 67. 5% , 75. 8% , 70. 0% and of resistan t
p lan ts is 36. 2% , 42. 1, 37. 9% respectively. Because of its h igh transfo rm ation efficiency and stability, th is
transfo rm ation system has been used in m any jap onica rice varieties as a routine p ro toco l.
Key words　R ice; A g robacterium 2m ediated genetic transfo rm ation; Routine p ro toco l
　　1994 年 H iei 等[ 1 ]建立了农杆菌介导的粳稻转
基因体系。随后, 大量的粳稻品种的遗传转化取得
了成功[ 2～ 5 ]。尽管如此, 粳稻中仍然存在一些品种
(基因型) 转化效率低, 甚至少数品种不能被转化的
问题[ 6～ 8 ]。究其原因有二: (1) 不同水稻品种、及同
一品种的不同外植体的组织培养体系有一定差异,
直接关系到转基因的成败; (2) 不同品种及不同外
植体对农杆菌侵染的参数不完全一致的, 而这些参
数直接影响转化效率的高低。因此, 在建立某一特
定品种的转基因体系时, 对各种影响因素进行优化
仍是非常必要的; 这已是大家的共识[ 9 ]。
粳稻品种牡丹江 8 号具有下列优点: (1) 早熟、
繁殖周期短 (在武汉的生育期为 90 天左右, 一年可
种植三季) ; (2) 对许多水稻白叶枯病和稻瘟病的生
理小种感病或高度感病 (用 11 个代表性的白叶枯病
病菌和 6 个稻瘟病病菌的接种试验, 结果均表现感
病或高度感病)。因此, 它是水稻抗白叶枯病和抗
稻瘟病基因克隆研究中候选基因功能验证的一个理
想受体。本研究拟通过筛选试验建立牡丹江 8 号高
效的愈伤组织诱导、继代和植株再生的组织培养体Ξ 致谢　张启发教授不仅在研究过程中给予了大力支持, 并对论文的写作提出了许多修改意见, 在此表示衷心的感谢!
作者简介: 林拥军, 1963 年 9 月出生, 男, 祖籍江西景德镇, 副教授, 博士生; 主要研究方向: 水稻基因工程。
基金项目: 农业部 948 项目 961032　　　3 联系作者
Received on (收稿日期) : 2001204216, A ccep ted on (接受日期) : 2001207207

系; 然后对愈伤组织状态、预培养和共培养培养
基、根癌农杆菌的接种浓度、共培养温度、共培养
时间以及潮霉素有效选择浓度等影响转化效率的参
数进行较系统研究。旨在建立一个高效的农杆菌 T i
质粒介导的牡丹江 8 号程序化转基因体系, 应用于
抗病基因克隆的研究, 并对建立农杆菌介导的其它
水稻品种转基因体系的建立提供借鉴。
1　材料与方法
1. 1　植物材料、农杆菌菌株和转化载体
粳稻栽培品种牡丹江 8 号 (O ry za sativa L. ssp.
jap onica) 的成熟种子, 由本研究室徐才国副教授提
供。
试验菌株 EH A 105, 为携带卸甲 pT iBo542 的
农杆碱型菌株; 转化载体 pCAM B IA 1301, 该双元
载体序列总长度为 13. 1 kb, 其 T 2DNA 区结构图
见上 (图)。均由澳大利亚 CAM B IA (Cen ter fo r the
A pp lication of M olecular B io logy to In ternational
A griculture)实验室提供。
1. 2　牡丹江 8 号组培体系的建立
设置激素配比和有机物添加试验, 筛选牡丹江
8 号成熟胚的高效愈伤组织诱导、继代和分化培养
基; 规范组培操作方法, 建立模式化的牡丹江 8 号
组培体系。
1. 3　农杆菌介导的转化体系的建立
1. 3. 1　试验所用的培养基 (见表 1)
1. 3. 2　潮霉素有效筛选浓度试验　　设置35 m gö
L、50 m göL 和 65 m göL 3 个潮霉素浓度处理, 培
养基为O c。每个处理接入 100 个左右胚性愈伤组
织。26. 0℃暗培养 10 d 后, 观察愈伤组织生长情
况。选择合适的潮霉素筛选浓度。
表 1　培养基配方
Table 1　Composition of media
培养基
M edia
组成
　　　Composition　　　
O c 　　　N 6+ 2, 42D 2. 5+ CH 600+ 3% Sucrose+ 0. 25% Phytagel, pH 5. 9
O l 　　　1ö4N 6+ 2, 42D 2. 5+ 100ΛM A S+ CH 600+ 3% Sucrose+ 0. 25% Phytagel, pH 5. 6
Y 　　　1ö4N 6+ 2, 42D 2. 5+ 100ΛM A S + CH 1000+ 2% Sucrose+ 1% Glucose, pH 5. 4
AAM 　　　AA + 2, 42D 2. 5+ 100ΛM A S + CH 600+ 2% Sucrose+ 1% Glucose, pH 5. 4
O y 　　　1ö4N 6+ 2, 42D 2. 5+ 100ΛM A S + CH 1000+ 2% Sucrose+ 1% Glucose+ 0. 25% Phytagel, pH 5. 6
O s 　　　N 6+ 2, 42D 2. 5+ CH 500+ Cn400+ Hn50+ 3% Sucrose+ 0. 3% Phytagel, pH 5. 9
O d1 　　　M SN 6+ BA 2. 0+ KT2. 0+ NAA 0. 2+ IAA 0. 2+ CH 300+ Cn250+ Hn50+ 3% Sucrose+ 0. 3% Phytagel, pH 5. 9
O d2 　　　M SN 6+ BA 2. 0+ KT2. 0+ NAA 0. 2+ IAA 0. 2+ CH 600+ P ro300+ Hn50+ 3% Sucrose+ 0. 3% Phytagel, pH 5. 9
O r 　　　1ö2M S (Full Fe2+ ) + 2% Sucrose+ 0. 25% Phytagel, pH 5. 9
　注 1: N 6 [10 ]; M S [11 ]; AA [12 ]; M SN 6 (M S 大量元素+ N 6 微量元素和有机物)。
　注 2: CH (水解酪蛋白) ; A S (乙酰丁香酮) ; Cn (羧苄青霉素) ; Hn (潮霉素)。
1. 3. 3　愈伤组织生理状态与农杆菌侵染　　取两
种不同状态的愈伤组织, 即直接诱导 25 d 的愈伤
组织和继代 20 d 的愈伤组织。经相同条件的预培
养、共培养和抗性筛选。统计和比较两种处理的抗
性愈伤率, 选择适合农杆菌侵染的愈伤组织生理状
态。
1. 3. 4　不同的预培养和共培养培养基与农杆菌侵
染　　设置 5 种不同的预培养和共培养的培养基处
理 (1: N 6+ 2, 42D 2. 5+ 100 ΛM A S+ 2% Sucrose + 1% Glucose+ 0. 3% Phytagel, 2: 1ö2N 6 + 2, 42D 2. 5+ 100 ΛmolöL A S + 2% Sucrose + 1% Glucose +0. 3% Phytagel, 3: 1ö4 N 6+ 2, 42D 2. 5+ 100 ΛmolöL A S 2% Sucrose + 1% Glucose+ 0. 3% Phytagel,4: 1ö4N 6+ 2, 42D 2. 5+ 100ΛmolöL A S + CH 600+2% Sucrose + 1% Glucose+ 0. 3% Phytagel, 5: AA+ 2, 42D 2. 5+ 100 ΛmolöL A S + 2% Sucrose+ 1%Glucose+ 0. 3%phyta2gel; 预培养培养基 pH 5. 9,共培养培养基 pH 5. 6)。经相同预培养和共培养时
5923 期　　　　　　　　　　　　林拥军等: 农杆菌介导的牡丹江 8 号高效转基因体系的建立　　　　　　　　　　　　　　

间、相同的农杆菌处理和相同筛选培养基的条件培
养后, 通过统计和比较不同处理的抗性愈伤率, 确
定最适的预培养和共培养培养基。
1. 3. 5　农杆菌悬浮培养基的比较试验　　用
AAM 和设计的 Y 培养基悬浮农杆菌, 并将菌液调
制成相同浓度 (1. 0 OD ) ; 然后, 用调制好的菌液分
别侵染预培养后的愈伤组织, 置于相同条件下共培
养和筛选; 最后统计和比较两个处理产生的抗性愈
伤效率。
1. 3. 6　农杆菌菌液浓度与其侵染　　用相同的悬
浮培养基配制 0. 5 OD、1. 0 OD、1. 5 OD 和 2. 0 OD
4 种农杆菌菌液浓度, 分别处理预培养后的质地、
大小和生理状态基本一致的愈伤组织。处理后, 经
相同的方法共培养和筛选, 最后统计和比较不同处
理的抗性愈伤率, 确定农杆菌的最适使用浓度。
1. 3. 7　共培养温度与农杆菌侵染　　预培养后的
愈伤组织, 经相同的农杆菌菌液处理后, 分别置于
15℃、19℃、23℃和 27℃ 4 种温度条件下共培养。
共培养后, 经相同的方法和条件筛选, 最后统计和
比较不同处理的抗性愈伤率, 确定最适的共培养温
度。
1. 4　程序化转基因体系的建立及其有效性的验证
试验
根据以上参数优化试验的结果, 建立模式化的
农杆菌介导的牡丹江 8 号转基因操作体系; 并按照
这个实验程序, 进行 3 次重复实验, 验证该实验程
序的有效性和稳定性。
1. 5　转基因植株的 GUS 表达分析和D NA 分子检
测
取数片 1 cm 左右叶片, 加入适量 GU S 染色
液[ 13 ] , 于 37. 0℃保温过夜。然后观察记载。
DNA 抽提: 转基因植株的 DNA 抽提采用
CTAB 法[ 14 ]。用 T E 将各样品的 DNA 浓度调至
300 ngöΛL 和 30 ngöΛL 各一份, 存于 4. 0℃备用。
PCR 检测: 引物序列为 hp t2F:
5′A GTCAA T GA CCGCT GT TA T GC 3′, hp t2R:
5′CT GA TCGAAAA GT TCGA CA GC 3′; GU S2F:
5′ CCA GGCA GT T T TAA CGA TCA GT TCGC 3′,
GU S 2R: 5′G2A GT GAA GA TCCCT T TCT T GT TA CC 3′。
反应体系: DNA 模板 30～ 50 ng, 10×buffer 2. 0ΛL , 2 mmolöL dN T P 1. 0 ΛL , 25 mmolöL M gC l2 1.
5 ΛL , 10 ΛmolöL 引物各 0. 4 ΛL , 加入 ddH 2O 至 20ΛL。反应条件: 94℃ 3 m in; 94℃ 1 m in, 57℃ 1
m in, 72℃ 1. 5 m in, 35Cycles; 4℃保存。电泳检测:
1. 0% 琼脂糖凝胶电泳, EB 染色, 紫外分析仪观察
并照相。
Southern 杂交分析: 将 PCR 阳性转基因植株
的DNA 用S p e É 酶切 (T 2DNA 区有一个切点) , 以
GUS 基因的 PCR 扩增片段为探针, 具体操作参照
本实验室实验手册[ 15 ]。
1. 6　转基因植株后代的遗传分析
R 0单株套袋自交。R 1代以株系种植, 单株取叶
片进行 GUS 染色, 分析R 1代植株 GUS 表达的遗传
方式。
2　结果与分析
2. 1　牡丹江8号愈伤组织对潮霉素的敏感性
处理后愈伤组织生长情况见表2。表2结果显
示, 65 m göL 潮霉素浓度造成愈伤组织迅速死亡;
由于细胞在死亡过程中会分泌大量的有毒次生代谢
物质, 使用该浓度筛选转化细胞, 势必造成转化细
胞的生长受到强烈抑制, 影响转化效率。35 m göL
潮霉素不能有效抑制愈伤组织生长, 若用于抗性愈
伤组织筛选, 容易造成大量的非转化细胞的逃逸。
而50 m göL 潮霉素既能有效抑制愈伤组织的生长,
又不至于造成细胞迅速死亡, 是比较理想的筛选浓
度。
表2　牡丹江8号愈伤组织对潮霉素的敏感性
Table 2　The sensitiv ity of“M udanjiang 8”
ca ll i to hygromycin
潮霉素浓度
(m göL )Conc. hn 愈伤组织数No. calli 愈伤组织状态Callus status 愈伤颜色Color of callus
35 98 继续生长
continuous grow ing
黄色
yellow
50 101 停止生长
stop grow ing
褐色
brow n
65 96
死亡
dead
焦化
burnt
表3　愈伤组织的生理状态对抗性愈伤率的影响
Table3 The effect of physiolog ica l status of ca ll i
on the frequency of resistant-ca llus
处理
T reatm ent
处理愈伤数
No. calli
抗性愈伤数
No. resist. calli
抗性愈伤频率
F req. Resist. calli
1 116 61 52. 6%
2 119 79 66. 4%
　3 注: 处理1, 未继代愈伤; 处理2, 继代20 d 的愈伤。
　T reatm ent 1, calli unsubcultured; T reatm ent 2, calli subcultured for
20 days
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2. 2　愈伤组织生理状态对根癌农杆菌侵染的影响
处理结果见表3。
试验结果表明, 继代培养的愈伤组织经转化后
能获得更高的抗性愈伤率。其原因可能是: (1) 生
长活力更强的继代愈伤对农杆菌的侵染更加敏感;
(2) 两种愈伤对农杆菌侵染的敏感性相同, 只是因
为继代愈伤含有更多的可分生细胞; (3) 继代愈伤
的颗粒状结构具有更大的接触侵染面积。确切原因
有待进一步试验。
2. 3　预培养和共培养培养基对农杆菌侵染的影响
不同处理的抗性愈伤组织数和抗性愈伤率的结
果列于表4。
不同的预培养和共培养培养基对农杆菌的侵染
影响很大。结果总的趋势是: 随着培养基无机盐浓
度的降低, 抗性愈伤率逐渐增高, 农杆菌的侵染力
逐渐增强, 但1ö2N 6无机盐比N 6无机盐培养基反而
降低农杆菌的侵染: 培养基中添加氨基酸和短肽可
提高抗性愈伤率, 即提高农杆菌对愈伤组织的侵
染。
2. 4　农杆菌悬浮培养基
Y 培养基与AAM 培养基悬浮农杆菌的效果相
近, 见表5。有理由用 Y 替换AAM 作为悬浮农杆
菌的培养基。
表4　预培养与共培养培养基对抗性愈伤率的影响
Table4 The effect of preculture and coculture
media on the frequency of resistant ca llus
培养基
M edia
接种愈伤数
No. calli inoculated
抗性愈伤数
No. resist. calli
抗性愈伤频率
F req resist. calli
1 109 52 47. 8%
2 112 51 45. 5%
3 106 61 57. 5%
4 116 72 62. 1%
5 103 65 63. 1%
表5　不同悬浮培养基的比较
Table 5　Compar ison of different suspension-culture media
培养基
M edia
接种愈伤数
No. calli inoculated
抗性愈伤数
No. resist. calli
抗性愈伤率 (% )
F req. resist. calli
AAM 125 82 65. 6
Y 107 68 63. 6
2. 5　不同浓度的农杆菌对愈伤组织侵染的影响
四种菌液浓度处理的抗性愈伤统计结果如表
6: 　　　
表6　农杆菌菌液浓度对抗性愈伤率的影响
Table 6　The effect of Agrobacter ium concentration on frequency of resistant-ca llus
农杆菌浓度 (OD )
Conc. A g robacterium
处理愈伤数
No. calli
污染愈伤数
No. calli contam inated
抗性愈伤数
No. resist. calli
抗性愈伤率 (% )
F req. resist. calli
0. 5 93 0 49 52. 7
1. 0 102 0 70 68. 6
1. 5 110 15 58 52. 8
2. 0 107 35 41 38. 3
　　结果显示, 并不是农杆菌菌液浓度越高抗性愈
伤率越高; 而是用1. 0 OD 浓度的农杆菌菌液侵染
愈伤组织能获得最高的抗性愈伤率。
2. 6　共培养温度对农杆菌侵染力的影响
四种温度处理的愈伤组织经两次筛选培养后,
获得的抗性愈伤组织的结果见表7。
表7　共培养温度对抗性愈伤率的影响
Table 7　Effect of cocultivation temperature on frequency of resistant-ca llus
共培养温度
Cocultivation temp
接种愈伤数
No. calli
污染的愈伤数
No. calli contam inated
抗性愈伤数
No. resist. calli
抗性愈伤率 (% )
F req. resist. calli
15℃ 132 0 27 20. 5
19℃ 119 0 75 63. 0
23℃ 125 8 75 59. 1
27℃ 127 32 34 26. 8
　　表7结果显示, 19℃～ 23℃共培养温度条件下,
农杆菌具有最高的侵染活性, 产生最高的转化率。
这与前人研究结果一致[ 16 ]; 进一步印证了“农杆菌
具有最强侵染力的生长温度并不是其最适生长温
7923 期　　　　　　　　　　　　林拥军等: 农杆菌介导的牡丹江 8 号高效转基因体系的建立　　　　　　　　　　　　　　

度, 而是在较缓慢生长温度条件”的观点。这是否
意味着: 当农杆菌处于快速生长繁殖状态时, 与其
侵染有关的基因表达受阻, 侵染力下降。而当农杆
菌生长趋缓时, 与其侵染有关的基因才能充分表
达, 方具有最高侵染活力。
2. 7　农杆菌 Ti质粒介导的牡丹江8号转基因程序
化操作体系及体系效率的验证
根据以上的试验结果, 建立程序化操作程序如
下: (1) 成熟种子去壳; 70% 乙醇泡1 m in, 0. 15%
升汞消毒20 m in; 然后, 用无菌水洗3～ 4次, 接入
诱导培养基O c, 26℃暗培养诱导愈伤组织。 (2) 诱
导培养35 d 后, 取活力强、颗粒状愈伤转入O c 培
养基上继代培养。(3)取继代培养20 d 的愈伤颗粒,
接入O l 预培养培养基, 26℃暗培养4 d。 (4) 在预培
养的第3天, 用LA (LB + 1. 5% 琼脂) 划线接种农杆
菌菌株, 28℃静止培养2 d。2天后, 将农杆菌刮入
Y 液体培养基, 28℃振荡培养3～ 4 h。分光光度计
测定菌液浓度, 并将其浓度调至1. 0 OD。 (5) 将预
培养后的愈伤组织接入100 mL 桶形瓶, 加入调制
好的农杆菌菌液, 浸泡30 m in, 期间摇动数次。 (6)
倒去菌液, 将愈伤置于灭菌滤纸上吸干表面菌液,
接入共培养培养基O y, 19℃～ 20℃暗培养3 d。 (7)
将共培养后的愈伤用无菌水先快速摇动清洗2次;
然后加入无菌水浸泡10 m in, 使愈伤内部的菌体游
离出来; 倒去洗液, 再加入含400 m göL Cn 的无菌
水浸泡15 m in; 倒干洗液, 将愈伤置于灭菌滤纸上
吸干; 接入筛选培养基O s, 26℃暗培养。每两周继
代1次, 共2次。 (8) 将筛选获得的抗性愈伤组织接
入预分化培养基O d1, 26℃暗培养一周。(9) 预分化
培养一周的抗性愈伤转入分化培养基O d2 (改用三
角瓶或平底试管) ; 25℃, 2000 L x 光照培养, 再生
转基因植株。 (10) 待小植株长到3～ 5 cm ; 转入O r
生根培养基上发根。 (11) 将根系健壮的植株移入盆
钵, 凉棚过渡3～ 5 d; 然后移到自然条件下生长,
直至成熟。
建立的这个转基因程序化操作体系, 效率究竟
如何?需要经过重复试验验证。试验设3个重复, 严
格按上面操作程序, 试验结果列表8。
表8　牡丹江8号农杆菌介导的基因转化系统的转化效率
Table 8　Eff ic iency of Ag robacter ium -mediated transgen ic system of M udanjiang8
重复
Repeat
愈伤数
No. calli
抗性愈伤数
No. resist. calli
抗性愈伤率
F req. resist. calli
分化愈伤数
No. calli differ
抗性植株转化率
F req. trans. resist p lantsÉ 196 132 67. 3% 71 36. 2%Ê 190 144 75. 8% 80 42. 1%Ë 203 140 70. 0% 77 37. 9%
平均M ean 196. 3 138. 6 71. 0% 76 38. 7%
　　从试验结果看, 建立的农杆菌介导的牡丹江8
号程序化转基因操作体系具有很高的抗性愈伤率:
最高达到75. 8% , 平均为71. 0% ; 以及很高的抗性
植株转化率: 平均为38. 7% , 完全可以满足实际工
作的需要。与已报道的试验结果比较, 也属上乘。
并且3次重复试验的结果比较稳定。
第一批移栽160株苗, 存活129株。
2. 8　转基因植株的GUS 组织化学染色分析和 PCR
鉴定
取叶片GUS 染色分析, 在129株抗性再生植株
中, 98株为 GUS 表达阳性植株, 阳性率为76. 0%。
用 GUS 和 H p t 引物 PCR 扩增检测, 结果113株为
GUS 基因阳性植株, 114株为 H p t 基因阳性植株,
其中有一个单株的差异。部分阳性植株的 PCR 扩
增结果见图1。
假如GUS 基因表达都能被有效检测的话, 则转
基因植株中GUS 基因的表达率为86. 7% , 也即GUS
基因的失活率为13. 3%。
2. 9　转基因植株 Southern 杂交分析
用 GUS 基因引物扩增产物作探针, 对113株
GUS 基因 PCR 阳性植株进行 Southern 杂交, 结果
显示: PCR 检测结果与 Southern 杂交结果完全吻
合, 说明 PCR 检测可用于该转化体系的转基因阳
性植株的鉴定。并且结果表明, 大多数转基因植株
为单拷贝外源基因整合, 个别也有8个以上拷贝的
转基因植株, 部分结果见图2。
2. 10　转基因植株后代遗传分析
转基因植株套袋自交收种, 按株系种植 R 1代,
当幼苗长到4～ 5片叶, 取1～ 2 cm 左右做GUS 染色
检测。结果显示: 约70% 左右的转基因R 1株系遗传
符合孟德尔遗传规律; 30% 左右难以用孟德尔遗传
规律进行解释。典型的结果列于表9。
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图1　牡丹江8号部分转基因植株 PCR 检测结果
F ig. 1　The PCR detection of som e transgenic p lants of M udanjiang 8
注: (1)H p t 引物扩增结果, 扩增片段为592 bp。M : M arker, CK: 原品种对照。
注: (2)GU S 引物扩增结果, 扩增片段为1. 2 kb。M : M arker, CK: 原品种对照。
图2　部分转基因植株的 Southern 杂交检测
F ig 2　Southern blo t detection of partial transgenic p lants
表9　R1转基因株系的遗传方式
Table 9　Genetic model of R1 population
转基因株系
T ransgenic
p lan t2line GU S 基因拷贝数GU S cop ies GU S 阳性植株数No. GU S 2po si2tive p lan ts GU S 阴性植株数No. GU S 2nega2tive p lan ts 遗传方式Genetic mode
M 219 1 35 14 孟德尔遗传 (3: 1)
M 220 1 59 18 孟德尔遗传 (3: 1)
M 231 2 42 11 孟德尔遗传 (3: 1)
M 237 2 37 24 非孟德尔遗传
M 238 8 24 22 非孟德尔遗传
M 246 3 6 41 非孟德尔遗传
从以上结果可看出, 单拷贝整合转基因植株后
代的 GUS 基因表达很稳定, 符合孟德尔遗传规律;
两个或两个以上拷贝转基因植株的 GUS 基因表达
出现非孟德尔遗传方式, 且单株之间GUS 表达强度
存在较大差异, 可能是外源基因插入的位置效应、
多基因造成的基因沉默。
3　讨论
不同物种、甚至同一物种的不同基因型对潮霉
素的敏感程度存在差异。因此, 在转基因工作中,
应该对供试受体的潮霉素敏感性进行测试, 确定最
有效的使用浓度。如何确定选择试剂的使用浓度,
至今还未有一个明确的标准, 也未见相关研究报
道。总体原则是使用的选择压既能有效抑制非转化
细胞的生长, 又能使转化细胞的生长不受抑制。在
操作上, 具体怎样量化?作者在水稻转基因工作中
做过相关研究; 结果显示, 筛选培养后阳性愈伤比
例为70%～ 80% 的选择剂浓度能产生最好的选择效
果, 获得最多的阳性愈伤数 (数据未列出)。或者在
受体敏感性试验中受体材料在培养4天左右开始变
褐的选择剂使用浓度可定为筛选浓度。
多数研究者都采用AAM 培养基悬浮农杆菌,
该培养基富含对农杆菌侵染有促进作用的氨基酸营
养。因此, 往往能取得很好的效果。但AAM 培养
基制备比较繁琐, 需要过滤灭菌。从前面的试验结
果看, 添加CH 的低盐培养基可以达到几乎相同的
效果, 并且效果很稳定。因此, 在建立的标准化操
作程序中, 改用添加 CH 的低盐培养基悬浮菌液,
操作简易且有效。
报道基因瞬时表达分析可以作为外源基因导入
受体细胞的指示, 人们可以根据报道基因瞬时表达
的情况而优化外源基因导入的参数, 但这仅仅只能
作为参考, 一味追求极大提高瞬时表达效率的做法
是不明智的。因为极大表达报告基因的条件可能对
受体材料是有害的。再者, 至今还未证明瞬时表达
和稳定整合是否完全相关; 甚至有时在未检测到瞬
时表达的情况下, 却发生了较高频率的外源基因整
合[ 21 ]。因此, 采用抗性愈伤率分析比采用报道基因
瞬时表达分析要准确得多。
本研究建立的农杆菌介导的程序化转基因操作
体系, 已成为本研究室农杆菌介导的水稻基因转化
的标准化操作程序, 得到广泛使用。转化受体已涉
及粳稻6个品种 (农垦58S、台北309、中花15号、黑
交932、黑粳5号、合江19) , 均获得较高的转化频率
(∂ 30% )。可见, 该转化体系在水稻农杆菌介导基
因转化中具有广泛适用性。
9923 期　　　　　　　　　　　　林拥军等: 农杆菌介导的牡丹江 8 号高效转基因体系的建立　　　　　　　　　　　　　　

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003　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　28 卷