全 文 ：Vol. 29 , No. 4
pp. 534～540 　July , 2003
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 29 卷 第 4 期
2003 年 7 月 　534～540 页
高粱抗蚜基因分子标记的建立
李　莹1 　赵姝华2 　杨立国2 　刘世强3 , Ξ
(1沈阳师范大学化学生命科学学院　辽宁沈阳 110034 　2辽宁省农业科学院 辽宁沈阳 110161 　3沈阳农业大学 辽宁沈阳 110161)
摘 　要 　采用BSA 法 ,应用 RAPD 技术筛选 500 个随机引物 ,共扩增出 1614 条 DNA 谱带 ,其中有 OPA201、OPP209、OPP214、
OPH219、OPN208、OPN207、OPN220、OPY214、OPS220、OPJ206 十个引物在抗感池间扩增出了多态性谱带。分析表明 ,132 株后
代中 ,OPN207727有 4 株重组 ,OPN208373有 8 株重组 ,OPY214600有 12 株重组 ,重组率为 310 %、611 %和 911 % ,换算为图距单
位为 312 cM、615 cM和 1117 cM。其中 OPN208373 、OPN207727与抗蚜基因紧密连锁。将这两个引物扩增出的 RAPD 片段回
收、纯化、克隆、测序。结果表明 :两片段长分别为 727 bp 和 373 bp。将这两个标记命名为 OPN207727和 OPN208373 。根据测
序结果设计 2 对特异性引物 ,进行特异性扩增 ,将 RAPD 标记成功地转化为 SCAR标记。同时构建了抗蚜基因的连锁群。
关键词 　高粱 ;抗蚜基因 ;BSA ;RAPD ;SCAR
中图分类号 : S514 　　　文献标识码 : A
Study on the Molecular Markers Linked to Aphid Resistance Gene of Sorghum
LI Yue2Ying1 　ZHAO Shu2Hua2 　YANGLi2Guo2 　LIU Shi2Qiang3 , 3
(1 Department of Biology , Shenyang Normal University , Shenyang , Liaoning 110034 ; 2 Liaoning Academy of Agricultural Science , Shenyang , Liaoning 110161 ;
3 Shenyang Agriculture University , Shenyang , Liaoning 110161 , China)
Abstract 　Molecular markers of RAPD linked to the single dominant gene of aphid resistance on sorghum were detected in
BTAM 428 ×ICS212B F2 bulked segregation populations. In total , 500 random primer were used to screen the markers
linked to the resistance gene , and 1614 DAN bands were amplified by using the primers of OPA201 , OPP209 ,OPP214 ,
OPH219 ,OPN208 ,OPN207 ,OPN220 ,OPY214 ,OPS220 ,OPJ206. The co2segregation analysis of 132 F2 individuals showed
that four recombinants by OPN207727 were found , eight recombinants by OPN208373 , twelve recombinants by OPY214600 .
The frequency of recombinants were 310 % , 611 % ,911 % , and the linkage map distance were 312 cM , 615 cM , 1117 cM
respectively. OPN207727 and OPN208373 markers were the most tightly linked to the resistant gene. The fragments amplified
by OPN207727 and OPN208373 were cleaned and cloned into pMD 182T Vector , and sequenced the length to be 727 bp and
373 bp . According to the sequences , two specific primers were designed for perform PCR and the RAPD markers were suc2
ceeded conversing to SCAR markers.
Key words 　Sorghum; Aphid resistant gene ; BSA ; RAPD ; SCAR
　　高粱蚜虫[ Melanaphis sacchari ( Guenée) ]是我国
高粱生产区经常发生的主要虫害之一 ,一般造成减
产 15 %左右 ,严重发生时减产达 30 %以上。过去采
用化学药剂防治既费工、费时 ,又产生抗药性 ,污染
环境。因此选用抗蚜品种是最为有效的途径[1 ] 。要
选育出抗蚜品种 ,须对高粱种质资源的抗蚜性做鉴
定 ,一般采用田间自然诱发初鉴和人工接虫复鉴相
结合的方法进行 ,从而确定抗性等级。再以抗蚜种
质为基础 ,培育出抗蚜亲本系及其杂交种。这项工
作需时长 ,见效慢。随着分子生物学技术的迅猛发
展 ,为植物抗病虫害的研究开辟了新天地 ,目前许多
科研单位 ,利用 RFLP、RAPD 及 AFLP 等分子标记技
术 ,对水稻、小麦、玉米等作物的主要农艺性状基因
进行了识别、定位和分离研究 ,构建了它们的基因图Ξ基金项目 :辽宁省教委资助课题[991121119 (054 - 420059) ]。
作者简介 :李　莹 (1966 - ) ,女 ,博士 ,副教授。从事生物技术教学及研究。
Received (收稿日期) :2002203204 ;Accepted(接受日期) :2002210215.

谱 ,并取得了较大的进展[2、4、5、6 ] 。然而 ,在高粱抗蚜
基因的分子标记研究上 ,国内仍属空白 ,国际报道也
较少。擅文清等[3 ]研究表明 ,本研究选用抗高粱蚜
的国外高粱品种 BTAM428 对高粱蚜的抗性由显性
单基因控制 ,这有利于我们应用分子标记的方法对
杂种后代进行早期选择 ,淘汰感蚜基因型 ,加快育种
进程 ,节省选育所需的试验用地和成本。高粱抗蚜
基因的分子标记研究可为抗蚜基因的定位分离打下
基础 ,对抗蚜品种的选育 ,具有较大的实用价值 ,同
时填补高粱抗蚜基因分子标记研究的国、内外空白。
1 　材料和方法
1. 1 　供试材料
　　高粱试验试材 BTAM428 (抗亲) 、ICS212B (感亲)
由辽宁省农业科学院生物技术室提供。
BTAM428 来源于美国得克萨斯州 A & M 大学
农学系 ,经多年鉴定高抗麦二叉蚜 (在美国侵染高粱
的优势小种) ,20 世纪 80 年代初引入我国后经辽宁
省农科院植保所和高粱所多年鉴定 ,高抗甘蔗黄蚜
(我国高粱蚜虫优势小种) ,抗蚜性为一级。列为最
佳抗蚜源 (见表 1) 。
表 1 抗蚜性分级标准
Table 1 The standard for aphid resistance
等级
Standard
抗性
Resistance
株蚜量 (头)
Aphid number/ plant
叶蚜量 (头)
Aphid number/ leaf
1 高抗 1～60 1～40
3 抗 61～300 41～200
5 中抗 301～600 201～400
7 感 601～1000 401～700
9 高感 1000 以上 700 以上
　　注 :抗蚜性标准来自全国农作物品种资源鉴定专业组制定的高
粱抗蚜性分级标准。
Notes :The standard of the aphid resistance of sorghum draw up by the
Committee of Chinese Crop Varietal Resource.
F2 的来源 :1998 年于沈阳进行 BTAM428 ×ICS2
12B 的人工去雄杂交 ,获 180 粒种子 ( F1 种子) ;1998
年冬于海南岛种植 F1 世代 ,经自交 78 株获得种子 ,
并混合留用。1999 年于沈阳种植 F2 成苗约 900 株。
试材田间随机排列 ,设单行区 ,小区行长 5 m ,
每区不少于 30 株 ,除防治黏虫外 ,一律不施药。6
月 20 日～7 月 20 日蚜虫大发生期间 ,先后 3 次人工
接虫逐渐鉴定 F2 的抗蚜性。首次调查前 10～15d ,
取有无翅若蚜 20 头的小叶片 ,去掉天敌 ,卡在接蚜
株下数第三片叶腋间。每区从第三株起连续接 10
株 ,调查叶蚜量 ,依叶蚜量对 F2 划分抗性等级 ,盛发
期调查 2～3 次。确定抗性等级选择抗性为 1 级的
高抗单株 98 株 ,抗性为 9 级的高感单株 34 株。
1. 2 　药品、仪器与设备
102mer 引物 A2Z(除去 B 组) 购自 Operon 公司。
Taq 酶购自 PE 公司。PCR 仪 : 美国 PE 公司的
“PE9600”。紫外透射反射分析仪 ,型号 NT。
1. 3 　近等基因池的建立
应用分离群体分组分析法 (Bulked Segregation
Analysis)即 BSA 法。将 F2 代分为抗池及感池 ,抗池
和感池是分别由 F2 代 98 株抗蚜株叶片及 34 株感
蚜株叶片提取 DNA 混匀而成[11 ] ,制备时每株均取 2
ngDNA。
1. 4 　RAPD 分析
PCR 扩增反应系统总体积为 25μL ,含 1 倍扩增
缓冲液 ,115 U Taq 酶 ,50 ng 的模板 DNA ,100μmol/ L
的 dNTP , 012μmol/ L 引物 ,上覆矿物油。反应程序
为 :预变性 94 ℃3 min →变性 94 ℃20 s ,退火 38 ℃30
s ,延伸 72 ℃1 min ,循环 35 次 →延伸 72 ℃10 min。
用 Operon 公司生产的 A2Z(除 B 组外) 共 500 个
引物 ,对亲本及抗池、感池 4 个样品进行分析 ,如 4
个样品扩增出的 RAPD 产物带型相同 ,则无多态性 ,
而如扩增产物中的带型有差异 ,则对这些引物进行
重复并进行连锁分析。
1. 5 　产物检测
扩增产物在 114 %含 015μg/ mL EB 的琼脂糖凝
胶中电泳 ,电压为每厘米 3～4V ,电泳结果用紫外透
射反射分析仪观察。
1. 6 　连锁分析
当某一引物在鉴定的抗蚜基因的 F2 代抗感分
离群体 (即抗池及感池)及抗感亲本间选到稳定的多
态性片段 (RAPD) 标记后 ,取 F2 抗、感单株各 10 株 ,
用筛选到的引物进行分析。如果存在连锁关系进一
步扩大群体分析 ,统计单株的 RAPD 标记 ,计算重组
率和遗传距离。若 RAPD 标记与抗病基因紧密连
锁 ,则进行多态性片段回收。
交换型株数 =抗性单株样本群中不含多态性谱带
的株数 +感性单株样本群中含有多态性谱带的株数。
再通过 Mapmaker 310 计算机软件分析 ,可将重
组率转换为遗传距离即是图距单位 ( centimorgan ,
cM) [7 ,8 ] 。
1. 7 　多态性片段的回收、纯化、克隆与鉴定[9 ,10 ]
535　4 期 李　莹等 : 高粱抗蚜基因分子标记的建立 　　　

将回收纯化的片段克隆于 pMD 182T Vector 载
体上。在 ABI PRISMTM 377XL 测序仪上进行测序。
1. 8 　RAPD 标记转化为 SCAR标记
根据测序结果 ,从序列两端按引物的要求设计
出一对 20～24 碱基的引物 ,引物由宝生物工程 (大
连)有限公司合成。
SCAR的 PCR 扩增条件 :扩增反应物总体积为
25μL ,含 2. 5μL 扩增缓冲液 ;5 U Taq 酶 ,50 ng 的模
板 DNA ,100μmol/ L 的 dNTP ,012μmol/ L 的引物 Ⅰ,
012μmol/ L 的引物 Ⅱ,上覆 20μL 矿物油。
通过对特异引物 OPN207 和 OPN208 的 PCR 反
应条件进行优化 ,SCAR 反应程序分别定为 :预变性
94 ℃3 min →变性 98 ℃ 30 s ,退火 60 ℃ 59 s ,延伸
72 ℃59 min ,循环 35 次 →延伸 72 ℃10 min。
预变性 94 ℃3 min →变性 98 ℃30 s ,退火 52 ℃
59 s ,延伸 72 ℃ 59 min ,循环 35 次 →延伸 72 ℃ 10
min。
用这对引物检测 BTAM428 (抗亲) 、ICS212B (感
亲)及二者杂交后的 F2 抗池、感池和单株 ,比较其与
RAPD 分析的一致性和可靠性。
2 　结果分析
2. 1 　高粱抗蚜基因的 RAPD 多态性标记
　　以 F2 抗、感分离群体的近等基因池及抗亲、感
亲的 DNA 为模板进行 RAPD 分析 ,经过多次重复 ,
筛选出具有稳定多态性的引物为 OPA201400、OPH2
191500、OPJ206800、OPN207727、OPN208373、OPN220800、
OPS220800、OPP2091800、OPP214500和 OPY214600共 10 个
引物 (见表 2) 。
表 2 具有稳定多态性的 RAPD 引物及多态性片段的大小
Table 2 Polymorphic fragment amplified by RAPD primer
引物
Primer
多态性片段 (bp)
Polymorphism fragment
引物
Primer
多态性片段 (bp)
Polymorphism fragment
OPA201 400 OPN207 727
OPJ206 800 OPN208 373
OPH219 1500 OPN220 800
OPP209 1800 OPS220 800
OPY214 600 OPP214 500
　　多态性片段的扩增情况见图 1、2。图 1 为 OPN2
07 和 OPN208 2 个引物的多态性扩增图谱 ,1～4 是
以 OPN207 为引物 ,分别以抗亲、感亲、感池、抗池的
DNA 库为模板 ,扩增的产物情况 ,其中抗亲 (1) ,抗
池 (4)比感亲 (2) ,感池 (3) 多扩增出一条谱带 ,根据
Marker 指示 ,大约在 700 bp 左右。5～8 号带是以
OPN208 为引物扩增的产物情况 ,其中抗亲 (5) 、抗池
(8)比感亲 (6) 、感池 (7) 多扩增出一条谱条 ,大约在
300 bp 左右。
图 2 为OPN220、OPJ206、OPS220 三个引物的多态
性扩增图谱。1～4 号带为 OPN220 引物扩增的产物
情况 ,其中抗亲 (1) 、抗池 (4) 比感亲 (2) 、感池 (3) 多
扩增出一条谱带。根据 Marker 指示 ,大约在 800 bp
左右。5～8 号带为 OPJ206 引物扩增的产物 ,其中抗
亲 (5) 、抗池 (8) 比感亲 (6) 、感池 (7) 多扩增一条谱
带 ,大约也在 800 bp 左右。而 9～12 是以 OPS220 为
引物扩增的产物 ,其中抗亲 (9) 、抗池 (12) 比感亲
(10) 、感池 (11)也多扩增出一条 ,大约在 800 bp 左右
的一条多态性片段。
图 1 　　OPN207、OPN208 对抗蚜基因的多态性扩增片段
Fig. 1 　　Amplified polymorphism fragment by OPN206 ,OPN207 for aphid resistant gene
BTAM428 (1 ,5) , ICS212B(2 ,6) ,抗池 (4 ,8) ,感池 (3 ,7) ,M(100bp DNA ladder plus Markers)
Resistant parent (1 ,5) , Susceptible parent (2 ,6) , Resistant bulk (4 ,8) , Susceptible bulk (3 ,7)
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图 2 OPN220、OPJ206、OPS220 对抗蚜基因的多态性扩增片段
Fig. 2 Amplified polymorphism fragment by OPN220 , OPJ206 , OPS220 for aphid resistant gene
BTAM428 (1 ,5 ,9) ICS212B(2 ,6 ,10) ,抗池 (4 ,8 ,12) ,感池 (3 ,7 ,11) ,M (100 bp DNA ladder plus Markers)
Resistant parent (1 ,5 ,9) , Susceptible parent (2 ,6 ,10) ,Resistant bulk (4 ,8 ,12) ,Susceptible bulk (3 ,7 ,11)
2. 2 　与抗蚜基因连锁的 RAPD 多态性标记
将可重复的扩增稳定的 10 个引物 ,分别用 10
株 F2 代抗感单株进行 RAPD 连锁分析 ,只有引物
OPN207、OPN208 和 OPY214 的扩增产物出现具有连
锁性的多态性片段 ,对这 3 条引物进行了进一步的
连锁分析 ,共分析了 F2 代分离群体 132 株 ,其中 98
株抗蚜 ,34 株感蚜。(结果见表 3、4、5) 。
表 3 OPN207727在 F2 代中的共分离分析
Table 3 Amplification of the polymorphism fragment in F2
using primer OPN207727 by co2segregation analysis
F2
株数
Plants
多态性片段
Polymorphism fragment
有 无
重组率 ( %)
Recombination
frequency
抗蚜 Resistant to aphid 98 96 2
感蚜 Susceptible to aphid 34 2 32 3. 0
表 4 OPN208373在 F2 代中的共分离分析
Table 4 Co2segregation analysis of the amplification
polymorphism fragment in F2 using primer OPN208373
F2
株数
Plants
多态性片段
Polymorphism fragment
有 无
重组率 ( %)
Recombination
frequency
抗蚜 Resistant to aphid 98 93 5
感蚜 Susceptible to aphid 34 3 31 6. 1
　　从表 3～5 中数据可见 ,OPN207727、OPN208373及
OPY214600的重组率分别为 310 %、611 %及 911 %。应
用 Mapmaker 310 软件包换算成图距单位分别为 312
cM、6. 5 cM 和 11. 7 cM。将 OPN207727和 OPN208373二
条多态性片段回收 ,进行进一步的研究。
表 5 OPY214600在 F2 代中的共分离分析
Table 5 Co2segregation analysis of the amplification
polymorphism fragment in F2 using primer OPN208373
株数
Plants
多态性片段
Polymorphism fragment
有 无
重组率 ( %)
Recombination
frequency
抗蚜 Resistant to aphid 98 93 5 9. 1
感蚜 Susceptible to aphid 34 7 27
2. 3 　与抗蚜基因连锁的 RAPD 多态性标记的回收、
克隆及测序
2. 3. 1 　OPN207727、OPN208373的回收
将引物 OPN207、OPN208 扩增的多态性片段
OPN207727、OPN208373回收纯化 ,电泳检查结果 (图 3)
表明回收片段大小与 OPN207727、OPN208373完全一
致。
2. 3. 2 　OPN207727、OPN208373的克隆及测序
将回收纯化的片段 ,连接到 pMD 182T Vector 载
体上 ,转化大肠杆菌 DH5 ,利用蓝白斑筛选重组子 ,
从白色菌落中提取质粒 ,对重组质粒进行 PCR 扩
增 ,通过电泳显示 PCR 扩增结果与回收片段大小一
致 (见图 4) 。由此说明 ,OPN207727、OPN208373已与质
粒载体重组并克隆了。
对用 pMD 182T Vector 质粒载体克隆的两个重
组质粒进行测序 ,测序结果证明 OPN208 扩增的多态
性片段为 373 bp ,而 OPN207 扩增出的多态性片段为
727 bp ,故将这两个多态性片段命名为 OPN207727和
OPN208373。测定出的碱基序列如图 5、图 6。图中黑
体划线碱基为随机引物序列。
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图 3 OPN207727、PN208373回收片段
Fig. 3 Polymorphism fragments harvest of OPN207727 ,OPN208373
抗池 (2 ,5) ,感池 (1 ,6) ,回收片段 (3 ,4) , Marker (100bp DNA ladder plus)
Resistant bulk (2 ,5) , Susceptible bulk (1 ,6) , Recycle fragment (3 ,4)
图 4 OPN207727及 OPN208373克隆片段
Fig. 4 Harvesting and cloning fragments of OPN207727 ,OPN208373
回收片段 (2 ,5) ,克隆片段 (1 ,4) ,Marker (PBR322/ BstN I) (3) , Recycle fragment (2 ,5) , Cloning fragment (1 ,4)
图 5 多态性片段 OPN207727的测序结果
Fig. 5 Sequencing of the polymorphism fragment
amplified by OPN207
图 6 多态性片段 OPN208373的测序结果
Fig. 6 Sequencing of polymorphism fragment amplified by OPN207
2. 4 　将 RAPD 标记转化为 SCAR标记
根据特异片段 OPN207727、OPN208373两端序列和
引物设计原则 (避免发夹结构 ,适当的 G + C 含量) ,
在序列两端设计了两对特异性引物 ,见表 6。
表 6 SCAR引物序列
Table 6 Primer sequence of SCAR
SCAR 引物
SCAR primer
引物序列
Primer sequence
OPN207727a 5’ - TTC ATG GAA ACA AAT TTG CA - 3’
OPN207727b 5’ - TGT ATC TTC AGC CAA GCC - 3’
OPN208373a 5’ - GAA AAG AAA ATA GTG GAG TCG- 3’
OPN208373b 5’ - CAA TAA TAA ACA ACA AGA TG- 3’
　　用这对引物检测 BTAM428 (抗亲) 、ICS212B (感
亲)及二者杂交后的 F2 抗池、感池和单株 ,结果表明
SCAR 标记和抗蚜基因的 RAPD 标记的连锁性完全
一致 ,以 OPN208373a 和 OPN208373 b 为引物进行 PCR
扩增 (即 SCAR 分析) ,结果见图 7。从图中可见 ,抗
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亲 (1) 、抗池 (3) 及抗蚜单株 (5～13) 都扩增出 OPN2
08373一条谱带 ,而感亲 (2) 、感池 (4) 对感蚜单株 (142
22)都未扩增出任何片段。图 8 是以 OPN207727a 和
OPN207727 b 为引物进行的 PCR 扩增 (即 SCAR 分
析) ,结果可见 ,抗亲 (1) 、抗池 (3) 及抗蚜单株 (5～
13)扩增出了 OPN207727谱带 ,而感亲 (2) 、感池 (4) 及
感蚜单株 (14～22) 均未有此谱带的出现。说明
SCAR标记特异性强 , PCR 产物只为一条 727 bp 或
373 bp 的条带 ,易于区分。这样就顺利地将 RAPD
标记转化为了稳定性重复性很好的 SCAR 标记。
图 7 OPN208 的 SCAR 标记对部分单株的检测结果
Fig. 7 PCR detection of some individuals with the specific OPN - 08 SCAR primers
抗亲 (1) ,感亲 (2) ,抗池 (3) ,感池 (4) ,F2 抗单株 (5～13) ,F2 感单株 (14～22) ,Marker (PBR322/ BstNI) (23) Resistant parent (1) , Susceptible
parent (2) , Resistant bulk (3) , Susceptible bulk (4) , F2 resistant - segregation individuals (5～13) , F2 susceptible segregation individuals (14～22)
图 8 OPN207 的 SCAR 标记对部分单株的检测结果
Fig. 8 PCR detection of some F2 individuals with the specific OPN208 SCAR primers
抗亲 (1) ,感亲 (2) ,抗池 (3) ,感池 (4) ,F2 抗单株 (5～13) ,F2 感单株 (14～22) ,Marker (PBR322/ BstNI) (23)
Resistant parent (1) , Susceptible parent (2) , Resistant bulk (3) , Susceptible bulk (4) , F2 resistant2segregation individuals (5～13) ,
F2 susceptible segregation individuals (14～22)
2. 5 　抗蚜基因连锁群的建立
对经电泳检测的多态性扩增产物进行数据收
集。根据多态性条带的有无分别赋值“1”和“0”,模
糊不清或数据缺失赋值为“2”。应用 Mapmaker 310
软件包 ,进行综合分析。结果表明 :OPN207727、OPN2
08373及 OPY214600与抗蚜基因的图距单位分别为 312
cM、615 cM、1117 cM。3 个分子标记与抗蚜基因的连
锁顺序为 OPN208373 —抗蚜基因 —OPN207727 —OPY2
14600。绘制连锁图 (图 9) :
从该连锁图可见 ,连锁距离最近的两个标记
OPN207727、OPN208373位于抗蚜基因两侧 ,可在此基础
上筛选更近的分子标记 ,丰富抗蚜基因连锁群 (这方
面工作正在进行当中) ,进而利用染色体登陆法克隆
该基因。
3 　结论与讨论
3. 1 　本研究利用 RAPD 技术对显性单基因控制的
抗蚜基因进行标记 ,通过筛选了 500 个随机引物 ,找
到了与抗蚜基因连锁的多态性标记 ,但由于 RAPD
标记的稳定性及重复性较差 ,很难将此标记应用于
作物遗传育种及辅助选择中。于是将 RAPD 标记转
换成了稳定性好和重现性高的 SCAR 标记 ,从而提
高了扩增反应的特异性和稳定性。使 RAPD 标记及
SCAR 标记在分子标记的辅助选择中具有更广阔的
应用前景。
3. 2 　通过应用 Mapmaker 310 软件包对与抗蚜基因
连锁的分子标记的综合分析 ,虽建立起了一个连锁
图 ,但其中标记的数量还有待进一步充实 ,从而建立
一个高密度的分子标记图谱 ,必将具有更大的应用
935　4 期 李　莹等 : 高粱抗蚜基因分子标记的建立 　　　

价值。
图 9 抗蚜基因连锁图
Fig. 9 Linkage map of the resistant gene
　
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