全 文 ：Vol. 31 , No. 1
pp. 11 - 17 　Jan. , 2005
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 31 卷 第 1 期
2005 年 1 月 　11～17 页
大豆种子特异性启动子的克隆及序列分析
财音青格乐　李明春　蔡　易　陶　然　邢来君 3
(南开大学生命科学学院微生物学系 ,天津 300071)
摘 　要 :通过 PCR 技术从大豆品种吉林 43 基因组DNA 中分离到大豆β2伴球蛋白α2亚基基因启动子片段 (BCSP489) ,对此
片段采用 TAIL PCR技术进一步延伸 ,获得了启动子片段 BCSP666。序列分析表明 ,在启动子片段 BCSP666 中含有多种种
子特异性启动子所特有的序列元件 ,如 AΠT富含序列元件、RY重复序列元件、AGCCCA 序列元件、TACACAT序列元件、
ACGT序列元件、E盒等。据此推测该启动子片段具有种子特异性启动子活性。以该片段构建种子特异性表达载体
pBI1212666 ,以 Floral Dip 方法转化拟南芥 ,转基因拟南芥中的 GUS 酶荧光光度分析和组织化学检测均表明 , GUS 基因在
启动子片段 BCSP666 调控下获得了种子特异性表达。
关键词 :种子特异性启动子 ;序列元件 ;TAIL PCR
中图分类号 : S565
Isolation and Sequencing Analysis of the Seed2specif ic Promoter from Soybean
CAI2YIN Qing2Ge2Le , LI Ming2Chun , CAI Yi , TAO Ran , XINGLai2Jun 3
( Department of Microbiology , College of Life Science , Nankai University , Tianjin 300071 , China)
Abstract :The low level of foreign genes’expression in transgenic plants is a key factor that limits plant genetic engineer2
ing1 Because of the critical regulatory activity of the promoters on gene transcription , they are studied extensively to improve
the efficiency of plant transgenic system1 The constitutive promoters , such as the CaMV 35S promoter , were usually used in
plant genetic engineering1 But those constitutive promoters continuously expressed their downstream genes during the whole
life span in all the tissues of the host plants1 This was not only wasteful to host plants’energy , but also harmful to host
plants and usually affecting their agronomic characters1 In contrast , the seed2specific promoter only expresses its down2
stream genes from mid to late stage of seed maturation , and there is no expression or much lower expression in other tissues1
So the seed2specific promoters are distinguished for the improvement having brought to plant quality engineering1 It was the
aim to characterize a new seed2specific promoter and improve the grain quality1 The promoter region ofβ2conglycininα2sub2
unit gene was isolated from the genomic DNA of soybean Jilin 43 by PCR method , and successfully extended this fragment
by TAIL PCR method and obtained the promoter fragment BCSP666 ( Fig11 - 3) 1 Sequencing analysis showed that the
cloned fragment BCSP666 contained all of the motifs , such as RY repeat element , AGΠCCCCA motif , TACACAT motif ,
ACGT motif , AΠT rich motif , and E2box etc1 , that constituted the seed2specific promoter activity( Fig14) 1 Based on this
sequencing analysis , the seed2specific promoter activity of the promoter fragment BCSP666 was predicted1 And then the
seed2specific expression vector pBI1212666 , which contained GUS reporter gene , was constructed with the fragment BC2
SP666 ( Fig15 ,6) 1 Transformation of Arabidopsis thaliana plants by Agrobacterium2mediated floral2dip method with the
recombined vector pBI1212666 was conducted1 The transgenic plants were selected on the kanamicin2resistant MS medium ,
and confirmed by southern blot analysis( Fig17) 1 Fluorometric and histochemical analysis of GUS enzyme activity of the
transgenic Arabidopsis thaliana plants ( Fig18 ,9) approved our original suggestion1 So , the seed2specific promoter BC2
SP666 is obtained and characterized1
Key words :Seed2specific promoter ;Motif ;TAIL PCR
基金项目 : 国家自然科学基金 (30200176)和天津市重点基金 (013802511)项目。
作者简介 : 财音青格乐 (l975 - ) ,男 ,蒙古族 ,南开大学在读博士研究生 ,研究方向为分子微生物学。3 通讯作者 :邢来君。
Tel : 86222223508506 ;Fax : 86222223508800 ; E2mail : xinglaij @eyou. com
Received(收稿日期) :2003210228 ,Accepted(接受日期) : 20042022151

　　大豆种子中主要含有 2 种种子贮藏蛋白 ,β2伴
球蛋白 (7 S蛋白)和球蛋白 (11 S蛋白) ,其中β2伴球
蛋白占种子总蛋白的 30 %[1 ] 。β2伴球蛋白由α、α’和
β3 个亚基组成。其中 ,α’2亚基基因启动子序列中
含有多种种子特异性启动子所特有的序列元件 (mo2
tif) ,并且α’2亚基基因启动子具有很强的种子特异
性启动子活性[2 ] 。Cahoon 等人利用这一启动子在大
豆体细胞胚中成功地表达了脂肪酸脱氢酶基
因[3～5 ] 。因此 ,通过种子特异性启动子在转基因植
物中时序调控目的基因是可行的。这对植物基因工
程技术是一个重要的突破和改进。
对大豆β2伴球蛋白α和β亚基基因启动子至今
还没有功能分析的报道。在 Yoshino 等人的报道
中[6 ] ,只是提出了一个 489 bp 的α2亚基基因启动子
的序列而没有对其功能进行进一步的分析。为了进
一步探索大豆β2伴球蛋白α亚基基因启动子的功
能 ,以及寻找新的种子特异性启动子 ,笔者根据已报
道的大豆β2伴球蛋白α2亚基基因启动子序列设计特
异性引物 ,用 PCR 方法克隆到大豆β2伴球蛋白α2亚
基基因启动子片段 BCSP489 ,再以 TAIL PCR(热不对
称交错 PCR)方法 ,在 5′端延伸 BCSP489 片段而获得
了一个新的启动子片段 BCSP666。序列分析表明 ,
它具有多种种子特异性启动子所特有的序列元件。
据此推测 ,该片段 BCSP666 具有种子特异性启动子
活性 ,本文对其进行了功能分析并得到初步验证。
1 　材料和方法
111 　材料
11111 　实验材料　　大豆种子吉林 43 由吉林省农
业科学院提供。拟南芥种子由南开大学王宁宁教授
提供。大肠杆菌 DH5α、根癌农杆菌 LBA4404、植物
表达载体 pBI121 由本实验室保存 ,测序载体 p GEM2
T 购自 Promega 公司。
11112 　实验试剂　　限制性内切酶和 DNA 胶回收
试剂盒购自宝生物工程 (大连) 有限公司 , Taq DNA
聚合酶购自鼎国生物工程公司 ,其他试剂均为进口
或国产分析纯。PCR 引物由上海生工生物工程公司
合成 ,PCR 反应在 Biometra Tgradient PCR 仪上进行 ,
DNA 序列测定由宝生物工程 (大连) 有限公司完成 ,
荧光分析在 RF2540 型荧光光度计上进行。
112 　方法
11211 　大豆总DNA 的提取 　　取大豆吉林 43 幼嫩
叶片 200 mg ,用 SDS2CTAB 改进法[7 ] 提取总 DNA ,取
5μL DNA 样品 ,琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和
浓度。　　
11212 　PCR 扩增
(1) 扩增 BCSP489 片段 　　根据已发表的大豆β2伴
球蛋白α2亚基基因启动子序列[6 ] 设计合成引物 P1
和 P2 ,并在引物中分别加入了 Hind Ⅲ和 Xba Ⅰ位
点 ,以大豆品种吉林 43 总 DNA 为模板进行 PCR 反
应。
引物 P1 : 5′2GCG AAG CTT AAG CAA CCA TAT
CAG CAT ATC23′,引入 Hind Ⅲ位点 ;
引物 P2 : 5′2GAA TCT AGA AAC CGC GCT CTC
ATC ATA GTA TAT23′,引入 Xba Ⅰ位点。
反应条件为预变性 97 ℃5 min ;94 ℃30 s ,52 ℃1
min ,72 ℃2 min ,共 35 个循环 ; 72 ℃后延伸 10 min。
将这一扩增片段 (BCSP489)用 DNA 胶回收试剂盒回
收 ,并连接到测序载体 p GEM2T 上 , 获得 pT2BC2
SP489 ,进行测序。
(2)进行 TAIL PCR 反应 ,5′端延伸 BCSP489 片段 　
　根据 BCSP489 序列 ,设计合成 3 个套式引物SP1～
SP3 ,再根据Liu Yao2Guang 等人的 TAIL PCR 方法[8 ] ,
合成 3 条随机简并引物 AD1～AD3 :
SP1 :5′2GTT GCG CAT GCA TGA TCC AAG AGA
SP2 :5′2CTT GGA CAT TGC TTT CGA AAG GAT A
SP3 : 5′TGA AGT GGG GTG AGG TTG CAT T
AD1 :5′2NTCGA( GΠC) T(AΠT) T( GΠC) G(AΠT) GTT
AD2 :5′2NGTCGA( GΠC) (AΠT) GANA(AΠT) GAA
AD3 :5′2(AΠT) GTGNAG(AΠT) ANCANAGA
用以上引物进行 TAIL PCR 反应 ,反应条件根据
LIU Yao2Guang 等人的 TAIL PCR 方法[8 ] ,并略做改
进 ,TAIL PCR 反应成分如表 1 所示 ,TAIL PCR 反应
步骤如表 2 所示。
用以上 TAIL PCR 方法获得片段 TAIL1 (约 200
bp) ,经 DNA 胶回收试剂盒回收后 ,直接进行测序。
(3)扩增 BCSP666 片段 　　根据 TAIL1 序列 ,设计合
成上游引物 P3 :5′2GCGAAG CTT CAA AAA CGC AAT
CAC ACA CA23′引入 Hind Ⅲ位点 ,用引物 P3 和 P2 ,
再以大豆品种吉林 43 总 DNA 为模板进行 PCR 反
应 ,反应条件为预变性 97 ℃5 min ;94 ℃30 s ,52 ℃1
min ,72 ℃2 min ,共 35 个循环 ; 72 ℃后延伸 10 min。
将获得的片段 BCSP666 用 DNA 胶回收试剂盒回收 ,
连接到测序载体 p GEM2T上 ,获得 pT2BCSP666 ,由宝
生物工程 (大连)有限公司测序。
21 　　　　作 　　物 　　学 　　报 第 31 卷 　

表 1 TAIL PCR反应混合液的组成
Table 1 The composition of TAIL PCR reaction mixture
反应成分
Reagent
第一步反应混合物中的用量
Amount in primary reaction
mixture (μL)
第二步反应混合物中的用量
Amount in secondary reaction
mixture (μL)
第三步反应混合物中的用量
Amount in tertiary reaction
mixture (μL)
10 ×PCR buffer 2 2 5
2 mmolΠL dNTPs 2 2 5
10 mmolΠL AD 4 4 10
1 mmolΠL GSP 4 4 10
ddH2O 615 615 17
Taq Plus (2 UΠμL) 015 015 2
Templet 1 (100 nmol)
以 50 倍稀释的第一步反应
产物为模板
1 (1Π50 primary PCR product) 以 50 倍稀释的第二步反应产物为模板1 (1Π50 secondary PCR product)
表 2 TAIL PCR反应步骤
Table 2 TAIL PCR procedure
反应
Reaction
文件序号
File No1 反应条件Thermal cycling condition 循环次数Cycle No1
第 1 步反应 1 95 ℃2 min , 97 ℃1 min 1
Primary 2 95 ℃15 s , 65 ℃15 s , 72 ℃30 s 5
3 95 ℃15 s , 25 ℃3 min ,ramping 1
to 72 ℃over 3 min , 72 ℃2 min
4 95 ℃15 s ,44 ℃15 s , 72 ℃30 s 3
5 95 ℃10 s ,65 ℃15 s , 72 ℃30 s
95 ℃10 s ,65 ℃15 s , 72 ℃30 s
95 ℃10 s ,44 ℃15 s , 72 ℃30 s 12
6 72 ℃7 min 1
第 2 步反应 95 ℃10 s ,61 ℃15 s , 72 ℃30 s
Secondary 7 95 ℃10 s ,61 ℃15 s , 72 ℃30 s 15
95 ℃10 s ,48 ℃15 s , 72 ℃30 s
8 72 ℃7 min 1
第 3 步反应 95 ℃10 s ,65 ℃15 s , 72 ℃30 s
Tertiary 9 95 ℃10 s ,65 ℃15 s , 72 ℃30 s 15
95 ℃10 s ,48 ℃15 s , 72 ℃30 s
10 72 ℃7 min 1
11213 　以启动子片段 BCSP666 构建种子特异性表
达载体及其转化拟南芥 　　pT2BCSP666 经 Hind Ⅲ
和 Xba Ⅰ双酶切后 ,分别与同样双酶切的植物表达
载体 pBI121 连接 ,转化大肠杆菌 ,筛选阳性克隆 ,获
得重组载体 pBI1212666 ,通过液氮冻融法[9 ] 转化到
根癌农杆菌LBA4404 中 ,然后用 Floral Dip 转化法[10 ]
转化拟南芥 ,收集种子 ,在卡那霉素抗性培养基 (1Π2
MS + Kan 50 mgΠL)上筛选转基因植株。提取转基因
植株的总 DNA ,以 GUS 基因 PCR 产物为探针 ,进行
Southern blot 分析[11 ] 。PCR 扩增 GUS 基因的上下游
引物分别为 PGUS1 : 5′2GAAGAGGATCCCCGGGTGGT2
CAG23′; PGUS2 : 5′2ACAGAGCTCGATGGTG CGCCAGGA
GAGTTG23′。
11214 　转基因拟南芥中 GUS 蛋白的荧光分析 　　
GUS蛋白的荧光检测和组织化学检测都参照 Jeffer2
son 的方法[11 ] 。取转基因拟南芥叶片和种子 100
mg ,并以同等重量的野生型拟南芥叶片和种子为对
照 ,提取 GUS 蛋白 ,以 MUG为底物 ,37 ℃反应过夜
后 ,荧光分光光度计上进行荧光分析。将转基因拟
南芥种子和野生型拟南芥种子数粒 ,浸泡于 X2Gluc
溶液 [含 1 mmolΠL X2gluc (52bromo242chloro232indolyl
glucuronide) 的 011 molΠL 的磷酸缓冲液 ]中 ,37 ℃水
浴中反应过夜。然后 ,用 75 %的乙醇 ,在 37 ℃水浴
中脱色 4～6 h ,4～10 倍的显微镜下观察染色情况。
2 　结果
211 　种子特异性启动子片段 BCSP666 的克隆
21111 　以大豆品种吉林 43 总 DNA 为模板 ,通过引
物 P1 和 P2 的 PCR 扩增 ,分离到启动子片段 BC2
SP489 ,电泳结果显示 (图 1) ,与预期的片段大小相
符 (约 500 bp ) 。将这一片段连接到测序载体
p GEM2T ,获得 pT2BCSP489 ,并测序。
21112 　根据 pT2BCSP489 的序列设计合成引物 ,用
TAIL PCR 方法获得了延伸的启动子片段 TAIL1 ,电
泳结果如图 2 所示。TAIL1 片段直接进行测序。
21113 　根据 TAIL1 (217 bp) 序列设计合成引物 P3 ,
以大豆品种吉林 43 总 DNA 为模板 ,通过引物 P2 和
31　第 1 期 财音青格乐等 :大豆种子特异性启动子的克隆及序列分析 　　　

P3 的 PCR 扩增 ,分离到启动子片段 BCSP666 ,电泳
结果显示 (图 3) ,与预期的片段大小相符 (约 700
bp) 。并将启动子片段 BCSP666 连接到测序载体
p GEM2T上 ,获得 pT2BCSP666 ,并测序。
图 3 BCSP666 的克隆
Fig13 Cloning of BCSP666
1 :PCR product BCSP666
2 :DNA Marker
212 　种子特异性启动子片段 BCSP666 的序列分析
启动子片段 BCSP666 的序列分析表明 ,它具有
666 对碱基 ,并且具有多种种子特异性启动子序列元
件 ,如图 4 所示 : (1) AΠT富含序列元件 ,这是转录因 子结合的重要部位 ,为种子特异性表达所必需[12 ] 。(2) RY重复序列元件 (也叫 Lgeumin box) ,也是种子特异性表达必需的序列元件[13 ] 。(3) AGCCCA 序列元件 ,参与转录调控 ,并提高种子贮藏蛋白的特异性表达[14 ] 。(4) TACACAT 序列元件 ,其中允许有一个碱基的错配 ,多拷贝的 TACACAT序列元件可能参与种子贮藏蛋白的特异性转录激活[15 ] 。(5) ACGT 序列元件 , 也是种子特异性表达所必需的序列元件[16 ] 。(6) E 盒 ( E2box) ,它与其他种子特异性序列元件协同作用 ,调节异源启动子的种子特异性激活[17 ] 。启动子片段 BCSP666 和已发表的大豆β2伴球蛋白α’2亚基基因启动子序列进行比较表明 ,核苷酸序列同源性虽然很低 (40 %) ,但所含的启动子序列元件的数量和距离上很相似 ,均具有多拷贝的 RY重复序列元件、AGCCCA 序列元件、TACACAT 序列元件和 TΠA 富含序列元件 (如图 5) 。据此 ,这两个启动子具有相似的启动子活性。以上分析表明 ,启动子片段 BCSP666 可以启动外源基因的种子特异性表达。
图 4 大豆种子特异性启动子 BCSP666 的序列分析
Fig14 Sequence analysis of soybean seed2specific promoter BCSP666
41 　　　　作 　　物 　　学 　　报 第 31 卷 　

图 5 已报道的α’2亚基基因启动子和 BCSP666 核苷酸序列上的启动子序列元件分布示意图
Fig15 Schematic diagram summarizing distribution of seed2specific promoter related motifs the on nucleotide sequences of
theα’2subunit gene promoter and BCSP666
□:TATA box ; ■:CAAT box ; ○:RY repeat elements ; △:AGΠCCCCA motifs ;
●:TACACAT motifs ; ▲:ACGT motifs ; ◇: E2box.
图 6 种子特异性表达载体 pBI1212666 的构建
Fig16 Construction of seed2specific expression vector pBI1212666
51　第 1 期 财音青格乐等 :大豆种子特异性启动子的克隆及序列分析 　　　

213 　种子特异性表达载体的构建及其转化拟南芥
种子特异性表达载体 pBI1212666 的构建流程如
图 6 所示。通过限制性内切酶 Hind Ⅲ和 Xba Ⅰ双酶
切鉴定表明 (见图 7) ,种子特异性启动子片段 BC2
SP666 确实插入到植物表达载体 pBI121 的 GUS 基
因前面 ,并替换了原来的 35S CaMV 启动子。将种子
特异性表达载体 pBI1212666 通过液氮冻融法转化到
根癌农杆菌LBA4404 ,并用 Floral Dip 方法转化拟南
芥 ,收集种子约 2 000 粒。将这些种子培养在卡那
霉素抗性培养基上 ,培养 15 d 左右 ,筛选到 20 棵转
基因拟南芥 ,然后移栽至花盆 ,收集种子。转基因拟
南芥总 DNA 的 Southern blot 分析表明 (如图 8) , GUS
基因均以单拷贝方式插入到拟南芥基因组中。
图 7 种子特异性表达载体 pBI1212666 的酶切鉴定
Fig17 Digestion of the seed2specific vector
pBI1212666
1 : The DNA Marker , 2 :The PCR product BCSP489
3 : Double digestion product pT2BCSP666ΠHind ⅢΠXba Ⅰ
4 : Double digestion product p GEM2TΠHind ⅢΠXba Ⅰ
5 : Double digestion product pBI1212666ΠHind ⅢΠXba Ⅰ
6 : Double digestion product pBI121ΠHind ⅢΠXba Ⅰ
图 8 转基因拟南芥和野生型拟
南芥总 DNA的 Southern blot 分析
Fig18 Southern blot analysis of gDNA of transgenic plants
and wild type plants
　　1 : Wild type plants
　　2 - 5 : Transgenic plants
　　6 : GUS gene as a positive control
214 　拟南芥中 GUS 蛋白的种子特异性表达
转基因拟南芥和野生型拟南芥叶子和种子的荧
光分析结果表明 ,如图 9 所示 ,转基因拟南芥 (卡那
霉素抗性拟南芥) 种子中的荧光强度最高。转基因
拟南芥和野生型拟南芥种子的组织化学检测表明
(如图 10) ,转基因拟南芥种子具有很强的 GUS 酶活
性 ,而野生型拟南芥种子未能染色 ,并没有 GUS 酶
活性。以上结果表明 ,转基因拟南芥中的 GUS 基因
是在种子特异性启动子 BCSP666 的调控下种子特异
性表达。
图 9 转基因拟南芥和野生型的荧光分析
Fig19 Fluorometic analysis of transgenic and wild type
Arabidopsis thaliana plants
图 10 转基因拟南芥和野生型拟南芥种子的 GUS 染色
Fig110 Histochemical analysis of the seeds of
transgenic plants and wild type plant
A ,B : Transgenic plants and wild type plants ; C ,D : Wild type plants1
3 　讨论
笔者通过 PCR 方法分离了大豆β2伴球蛋白α2
亚基基因启动子片段 BCSP666。序列分析表明 ,具
有多种种子特异性启动子所具有的序列元件。其中
TACACAT序列元件最多 ,共有 5 个拷贝 ;其次是 RY
重复序列元件和 AGCCCA 序列元件 ,各有 4 个拷贝。
这些多拷贝的种子特异性启动子序列元件可能与核
蛋白等反式作用因子相互作用而表现其种子特异性
表达特性。有趣的是 ,克隆的启动子片段 BCSP666
具有 2 个 TATA 盒和 2 个 CAAT盒 ,如图 4 所示。这
种现象在其他启动子序列中很少见 ,具体有什么功
能尚需进一步分析。
本文还通过 TAIL PCR 方法于 5′端成功延伸了
启动子片段 BCSP489 ,虽然延伸的距离并不是很长 ,
但对已知序列附近的未知序列的分离提供了一个有
效简便的方法 ,尤其是对未知启动子的克隆提供了
61 　　　　作 　　物 　　学 　　报 第 31 卷 　

实验依据。因为未知启动子的克隆通常只有两条途
径 ,一是构建基因组文库 ,通过杂交来筛选目的启动
子 ,但这种方法工作量大、资金投入多 ;二是通过接
头连接 PCR[18 ]或反向 PCR[19 ]来扩增目的启动子 ,但
这种方法比较复杂。而使用 TAIL PCR 方法具有简
便、快速、高效、特异性强等特点 ,它只需合成 3 条特
异性引物和几条较短的随机兼并引物 ,通过 6～8 h
的一次性 PCR 反应即可看到结果。本文中 TAIL
PCR 延伸的片段较短 ,可能的原因是合成的随机兼
并引物的数量较少 (只有 3 条) ,可以通过增加随机
兼并引物的数量使其延长的片段更长一些。据文献
报道[20 ] ,TAIL PCR 方法通常可以扩增到 012～2 kb
的片段。所以 ,TAIL PCR 方法是用于未知启动子克
隆的一种有效、简便的方法。
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