全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(7): 1205−1211 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项(2008ZX08004-003), 国家自然科学基金项目(30971808), 吉林省科技发展计划重点项
目(20080204), 长春市科技局国际科技合作项目(08GH10)和“211”三期建设项目资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 王庆钰, E-mail: wqy414cn@yahoo.com.cn; 李景文, E-mail: lljjww998@sohu.com
第一作者联系方式: E-mail: hn_zhangqinglin@163.com(张庆林), zhaoyan3053877@yahoo.com.cn(赵艳) **共同第一作者
Received(收稿日期): 2011-01-04; Accepted(接受日期): 2011-03-27.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.01205
大豆硬脂酸-ACP脱饱和酶基因启动子的克隆及其表达活性分析
张庆林 1 赵 艳 2,** 李晓薇 1 翟 莹 1 张 艳 1 王 英 1 李景文 1,*
王庆钰 1,*
1 吉林大学植物科学学院, 吉林长春 130062; 2 齐齐哈尔大学生命科学与农林学院, 黑龙江齐齐哈尔 161006
摘 要: 以吉豆 2 号基因组为模板 , 通过 TAIL PCR 方法 , 扩增得到大豆硬脂酸-ACP 脱饱和酶基因启动子片段
SACPD-Cp。PLACE 在线启动子预测分析表明, 该序列中含有多种典型的种子特异性表达序列元件。将 SACPD-Cp
片段取代 pCAMBIA1301质粒中的 CaMV35S启动子, 构建表达载体 pCAM-SACPD-Cp, 通过农杆菌介导法在大豆组
织中进行瞬时表达, GUS组织化学染色和荧光定量研究其表达特性。结果表明, SACPD-Cp驱动 GUS基因在种子中
的表达活性是 CaMV35S启动子的 93.01%; SACPD-Cp启动子与现已知启动子无同源性, 仅在大豆种子中检测到GUS
活性, 而在根、茎和叶组织中均未检测到 GUS活性, 证实 SACPD-Cp是一个新的种子特异性启动子。
关键词: 大豆; 硬脂酸-ACP脱饱和酶基因; 序列分析; 种子特异性启动子; 瞬时表达
Cloning and Activity Analysis of Soybean SACPD-C Promoter
ZHANG Qing-Lin1, ZHAO Yan2,**, LI Xiao-Wei1, ZHAI Ying1, ZHANG Yan1, WANG Ying1, LI Jing-Wen1,*,
and WANG Qing-Yu1,*
1 College of Plant Science, Jilin University, Changchun 130062, China; 2 College of Life Science and Agro-Forestry, Qiqihaer University, Qiqihaer
161006, China
Abstract: The SACPD-Cp promoter of soybean SACPD-C was isolated from the genomic DNA of soybean cultivar Jidou 2 using
TAIL PCR. Promoter sequence analysis by PLACE showed that the cloned fragment contained many motifs that constituted the
seed-specific cis-elements. Replacing CaMV35S promoter of pCAMBIA1301 with the SACPD-Cp fragment, the binary expres-
sion vector pCAM-SACPD-Cp was constructed. Transient expression by Agrobacterium tumefaciens mediated method, the his-
tochemical GUS analysis and fluorometric GUS analysis were used for testing the expression of the GUS activity. The results
indicated that GUS activity driven by SACPD-Cp fragment was 93.01% of that driven by CaMV35S promoter. The SACPD-Cp
promoter did not have the homology compared with the reported promoters. GUS activity assays indicated that GUS was ex-
pressed only in seeds, but not in roots, stems and leaves, which suggests the SACPD-Cp is a seed-specific promoter.
Keywords: Soybean; SACPD-C gene; Sequence analysis; Seed-specific promoter; Transient expression
粮食作物和油料作物的种子是食用的主要部分,
与人们的日常生活密切相关, 因此种子中的营养成
分是植物基因工程改良的重要目标。种子特异表达
启动子能够驱动基因在种子中专一性表达, 使目的
基因的表达产物在种子中积累, 增加表达量, 避免
植物营养不必要的浪费, 使所表达的外源蛋白都集
中在种子中, 最大限度地减少对农作物其他代谢途
径的影响, 因此, 种子特异性启动子的研究和应用
在定向改良农作物品质性状方面具有重要的理论和
实际意义。
随着基因工程的不断发展, 对组织特异表达启
动子的需求越显迫切。近年来, 有很多种子特异启
动子被分离和鉴定, 如水稻球蛋白启动子[1]、小麦淀
粉粒结合淀粉合成酶启动子[2]、玉米球蛋白启动子[3]、
花生油质蛋白、大豆油酸去饱和酶基因启动子[4]等,
这些启动子能促使基因在特定的组织中特异表达 ,
1206 作 物 学 报 第 37卷

避免物质、能量的浪费和影响植物的正常生长, 这
些启动子已广泛用于转基因工程的研究及其应用。
但与其他植物相比, 分离的大豆种子特异性启动子
相对较少, 因此, 获得一种新的大豆种子特异性启
动子, 对大豆新品种的研究开发及植物基因工程发
展具有推动作用。
硬脂酰-ACP 脱饱和酶是一种可溶性酶, 存在
于质体基质中, 催化硬脂酰-ACP脱饱和而在脂肪酸
链的 C9与 C10间引入一个双键形成油酰-ACP的反
应。饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例与生物膜系
统的流动性、选择透性以及植物的多种生理功能有
密切的关系, 因此受到广泛重视, 其启动子还未被
克隆和研究过。本试验利用 TAIL-PCR 方法扩增出
硬脂酰-ACP脱饱和酶基因上游 2 081 bp的序列, 获
得了硬脂酰-ACP脱饱和酶基因启动子序列, 获得的
片段构建在含有 GUS 报告基因的表达载体 pCAM-
BIA1301中, 用其转化农杆菌 EHA105, 并利用农杆
菌介导法侵染大豆种子进行瞬时表达, 初步研究了
SACPD-C基因启动子的特异启动功效, 为其进一步
研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
大豆品种吉豆 2号与大肠杆菌(E. coli) DH5α、
根瘤农杆菌 EHA105 和 pCAMBIA1301 质粒均由吉
林大学植物科学学院植物种质资源与利用研究室保
存; EcoR I、Nco I、pMD18-T克隆载体、Ex Taq和
T4连接酶均购自 TaKaRa公司; DNA凝胶回收试剂
盒和清洁回收试剂盒购自维特洁公司, 由北京六合
华大基因科技股份有限公司完成 PCR 引物合成和
DNA 序列测定; 5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸(X-Gluc)
购自上海生工生物工程公司, 4-MU 和 4-MUG 购自
Sigma公司, 其他试剂均为进口或国产分析纯。
1.2 SACPD-C基因启动子的克隆和序列分析
采用 CTAB 法提取吉豆 2 号幼苗叶片总 DNA
作为 PCR的模板。根据 SACPD-C基因 ATG上游已
知近端序列(AK245255)利用 TAIL-PCR 方法扩增出
远端序列并测序, 按照测序结果设计合成 2 条引物
SACP-F: 5′-GGGGAATTCAAAGAAAAAAAAATCC
GTCC-3′ (下画线表示 EcoR I 酶切位点), SACP-R:
5′-GAACCATGGTGAGTGGGCCTTCCGGGCTTT
G-3′ (下画线表示Nco I酶切位点), 将 PCR扩增产物
连接到 pMD18-T克隆载体上, 对得到的重组质粒筛选
并测序, 命名为 pMD18-T-SACP-CP。利用 DNAMAN
软件对测序结果比对 , 利用植物顺式元件数据库
PLACE (plant cis-acting regulatory DNA elements, http://
www.dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/)[5] 和 数 据 库
plantCARE (plant cis-acting regulatory element, http://
oberon.rug.ac.be:8080/PlantCARE/index.html)[6]分析
其可能的顺式作用元件。
1.3 表达载体的构建
测序正确的 pMD18-T-SACP-Cp质粒经 EcoR I
和Nco I双酶切后插入到 pCAMBIA1301相应位点上,
以 PCR 和双酶切鉴定阳性克隆, 得到 SACP-Cp 和
GUS基因融合的表达载体 pCAM-SACP-Cp。阳性对
照为由 CaMV35S启动 GUS基因的质粒 pCAMBIA-
1301。利用冻融法将表达载体 pCAMBIA1301 和
pCAM-SACP-Cp转化根瘤农杆菌 EHA105中。
1.4 根瘤农杆菌介导法转化大豆各组织
按照 Hu等[7]的方法, 以农杆菌介导法转化大豆
根、茎、叶、种子。取大豆幼苗的根、茎、叶, 将
种子去皮后切成两瓣, 分别浸于含有 pCAM-SACP-
Cp 和 pCAMBIA1301 质粒的农杆菌 EHA105, 菌液
重悬后 OD600约为 0.2, 真空压力 0.09~0.10 MPa, 20
min[8]。
1.5 GUS测定
参照 Jefferson 等[9]方法测定大豆根、茎、叶和
种子中的 GUS报告基因的表达, 将侵染和未侵染的
大豆各个组织取出部分, 进行 GUS 组织化学染色,
加入 GUS染色液(50 mmol L−1磷酸钠缓冲液 pH 7.0,
10 mmol L−1 EDTA, 1 mmol L−1 X-Gluc, 0.1% Triton
X-100, 10 mmol L−1巯基乙醇)于 37℃温育过夜, 75%
乙醇脱色, 直至底色完全消失。将剩余种子在研钵
中加液氮研磨成粉末 , 加入提取缓冲液 , 4℃离心 ,
上清液为 GUS蛋白粗提液, 用分光光度计测量蛋白
浓度。取出部分加 GUS 反应底物 4-MUG, 于 37℃
反应 10 min, 进行荧光测定, 3次生物学重复, 用获
得的荧光值除以蛋白浓度和时间得到 GUS 相对活
性, 计算 GUS活性值。
1.6 分子检测
利用 DNA提取试剂盒提取大豆根、茎、叶和种
子基因组 DNA。根据质粒中潮霉素序列设计引物
H1: 5′-TTCTACACAGCCATCGGTCCA-3′ 和 H2:
5′-TGAAAAAGCCTGAACTCACCG-3′, 预期扩增
片段 1 000 bp左右。无侵染的根、茎、叶、种子为
阴性对照, 质粒 pCAMBIA1301 为阳性对照。PCR
第 7期 张庆林等: 大豆硬脂酸-ACP脱饱和酶基因启动子的克隆及其表达活性分析 1207


扩增产物在 1.0%琼脂凝胶上电泳。
2 结果与分析
2.1 启动子 SACPD-Cp的克隆
用吉豆 2号大豆基因组 DNA为模板, 利用上述
方法进行 PCR扩增, 扩增出 1条约 2.1 kb特异片段,
电泳检测目的片段(图 1), 并切胶回收, 与 pMD18-T
载体连接后转化到大肠杆菌中, 提取质粒进行鉴定,
EcoR I和 Nco I双酶切鉴定结果得到与预期相符的
片段(图 2), 测序正确后命名为 pMD18-SACPD-Cp。

图 1 SACPD-Cp扩增产物
Fig. 1 PCR amplification of SACPD-Cp
M: 2000 bp DNA marker; 1: PCR产物。
M: 2000 bp DNA marker; 1: PCR amplification of SACPD-Cp.

图 2 pMD18-SACPD-Cp酶切鉴定
Fig. 2 Restriction enzyme digestion identification of
pMD18-SACPD-Cp
M: 2000 bp DNA marker; 1: EcoR I和 Nco I双酶切片段。
M: 2000 bp DNA marker; 1: EcoR I and Nco I digestion of
pMD18-SACPD-Cp.

2.2 启动子 SACPD-Cp的生物信息学分析
利用在线软件 Neural Network Promote Predic-
tion对大豆启动子 SACPD-Cp进行生物信息学分析,
进行基础启动子预测, 在 411~461 bp、1 146~1 196
bp、1 530~1 580 bp、1 988~2 038 bp和 2 021~2 071
bp 的位置发现基础启动子序列 , 其可能性分别是
0.95、0.83、0.90、0.97 和 0.94, 后 2 个基础启动子
区预测值较高。根据真核细胞基因启动子的基本特
征, 推测可能的转录起始位点在 2 062 bp处的 A。
序列中含有 CAAT 盒(可能与转录起始频率有关[10])
和 TATA盒(RNA聚合酶 II的结合位点[11])及多个典
型的种子特异性表达元件(图 3), 如 AACA[10](种子
特异性元件[12]), E-box (常出现在参与三酰基甘油合
成和植物种子特异表达基因启动子中[13]), SEF1 mo-
tif (能够增强启动子的转录活性[14])和多个顺式作用
元件 B-box[15]、CCAA[16]等。这些作用元件可能对
SACPD-Cp的表达起重要的作用。
2.3 瞬时表达载体的构建和农杆菌菌种的转化
将 SACPD-Cp插入 pCAMBIA1301的相应位置,
对培养出的单菌落提质粒后进行双酶切鉴定(图 4),
获得了约 2 100 bp的片段, 表明 SACPD-Cp启动子
已正确插入 pCAMBIA1301 中 , 替代了原来的
CaMV35S 组成型启动子(图 5), 证明 SACPD-Cp 和
GUS 基因融合的表达载体 pCAM-SACP-Cpbei 构建
成功。
通过冻融法将质粒 pCAM-SACPD-Cp 和 pCAM-
BIA1301 转化根瘤农杆菌 EHA105 中, 用于下一步
农杆菌介导大豆。
2.4 GUS蛋白的种子特异性表达
2.4.1 GUS 组织化学染色 对农杆菌侵染的大
豆根、茎、叶、种子进行 GUS 染色, 图 6 表明, 阴
性对照的大豆根、茎、叶和种子几乎没有被染色, 说
明 GUS报告基因没有被激活表达; 转化 pCAMBIA-
1301 载体的大豆根、茎、叶和种子都被 X-Gluc 溶
液染成蓝色, 说明在大豆根、茎、叶和种子中 GUS
报告基因都可以被 CaMV35S 组成型启动子激活表
达; 转化载体 pCAM-SACPD-Cp 的大豆根、茎、叶
没有被染成蓝色, 与未侵染的大概相同, 而大豆种
子被染成蓝色, 说明载体 pCAM-SACPD-Cp 只能驱
动 GUS报告基因在大豆种子中表达, 具有种子特异
性。
2.4.2 GUS 荧光定量分析 荧光分析表明(图 7),
阴性对照的大豆根、茎、叶和种子荧光强度都比较
低, 侵染载体 pCAMBIA1301 载体的大豆根、茎、
叶和种子荧光强度相对值相差无几, 都比较高, 侵
染载体 pCAM-SACPD-Cp的种子中的荧光强度相对
值比根、茎、叶中高 4.5 倍左右; 侵染载体 pCAM-
SACPD-Cp 的种子的荧光强度相对值是侵染载体
pCAMBIA1301的种子的 93.01%。启动子 SACPD-Cp
具有较强的种子特异性, 是一个全新的种子特异性
1208 作 物 学 报 第 37卷


图 3 SACPD-Cp序列的生物信息学分析
Fig. 3 Bioinformatic analysis of DNA sequences of SACPD-Cp
大豆 SACPD-Cp序列; +1位置为推测的转录起始位点; 推测的顺式调控元件序列为方框内字母并予以标注。
DNA sequences SACPD-Cp from soybean. Putative transcription initiation site is indicated with +1. Putative cis-acting elements are shown
inside boxes.
第 7期 张庆林等: 大豆硬脂酸-ACP脱饱和酶基因启动子的克隆及其表达活性分析 1209



图 4 pCAM-SACPD-Cp酶切鉴定
Fig. 4 Restriction enzyme digestion indentification of
pCAM-SACPD-Cp
M: 2000 bp marker; 1: EcoR I和 Nco I双酶切片段。
M: 2000 bp DNA marker; 1: EcoR I and Nco I digestion of
pCAM-SACPD-Cp.
启动子。与 CaMV35S启动子相比, SACPD-Cp启动
子种子中的荧光强度低了 6.99%, 分析可能是 SACPD-
Cp 启动子相对较长, 远端序列存在负相关元件, 这
方面仍需做启动子缺失或作用元件缺失试验的进一
步验证。
2.5 PCR检测
阴性对照的大豆根、茎、叶、种子没有扩增出
约 1 000 bp的条带; 转 pCAMBIA1301质粒的大豆
根、茎、叶、种子 X-Gluc 染色呈蓝色的组织 DNA
和质粒 pCAMBIA1301均扩增出约 1 000 bp的条带;
转 pCAM-SACPD-Cp质粒出现蓝色的种子和未出现
蓝色的根、茎、叶中均扩增出约 1 000 bp的片段(图
8), 表明 pCAMBIA1301 和 pCAM-SACPD-Cp 通过
农杆菌侵染法转入相应组织中。

图 5 植物表达载体 pCAM-SACP-Cp构建过程
Fig. 5 Construction process of expression vector pCAM-SACP-Cp


图 6 大豆不同组织的 GUS组织化学染色分析
Fig. 6 Histochemical analysis of GUS activity in different
organs of soybean
A: 未侵染的大豆; B: GUS基因由 CaMV35S启动子驱动;
C: GUS基因由 SACPD-Cp启动子驱动。
A: non-transformed soybean; B: the GUS gene driven by CaMV35S;
C: the GUS gene driven by SACPD-Cp.

图 7 CaMV35S和 SACPD-Cp融合 GUS基因表达载体在大豆组
织中的 GUS活性分析
Fig. 7 GUS activity analysis in different organs of soybean trans-
formed by the vectors with CaMV35S and SACPD-Cp fused to
GUS reporter gene
CK: 负对照; CaMV35S: 正对照; SACPD-Cp: 侵染
pCAM-SACPD-Cp表达载体的大豆组织。
CK: negative control; CaMV35S: positive control; SACPD-Cp: soy-
bean tissues transformed with expression vector pCAM-SACPD-Cp.
1210 作 物 学 报 第 37卷


图 8 大豆各个组织的 PCR检测
Fig. 8 PCR detection result of soybean organs
M: 2000 bp marker; 1: 质粒 pCAMBIA1301; 2~5: 分别为阴性对
照的根、茎、叶、种子; 6~9: 分别为转 pCAMBIA1301的根、茎、
叶、种子; 10~13: 分别为转 pCAM-SACPD-Cp的根、茎、叶、
种子。
M: 2000 bp marker; 1: pCAMBIA1301; 2–5: root, stem, leaf, seed
of negative control; 6–9: Root, stem, leaf, seed transformed with
expression vector pCAMBIA1301; 10–13: root, stem, leaf, seed
transformed with expression vector pCAM-SACPD-Cp.

3 讨论
本研究通过 TAIL PCR和 PCR方法首次分离大
豆硬脂酰-ACP脱饱和酶启动子序列, 以解决目前缺
少大豆种子特异性启动子的问题, 为大豆转基因研
究提供有力工具, 特别为利用大豆种子作为生物反
应器的研究和开发创造了条件。启动子驱动基因表
达需要多个不同的作用元件, 这些元件的种类、数
量及彼此之间的顺序与距离都可能影响基因的转率
程度。序列分析表明, 该序列中具有多种种子特异
性启动子作用元件, 包括AACA序列元件 16个拷贝;
E-box 和 ACGT 序列各 5 个拷贝; RY-repeat 序列元
件 2个拷贝等。分析结果表明, SACPD-Cp启动子中
存在种子特异性表达的调控元件, 能调控 GUS基因
在种子中特异性表达。另外, 该启动子序列中还含
有多个转录因子顺式作用元件和多个逆境相关元件,
如 ACGT、MYBST1、MYBCARE等, 因此对 SACPD-
Cp 启动子顺式作用元件的深入研究对了解该启动
子的具体作用有实际意义。
在植物的代谢过程中, 基因的表达调控是一个
非常复杂的过程, 启动子的启动能力有可能影响到
基因的表达情况, 一个组织特异性强、表达模式与
强度适宜的启动子, 往往是基因工程试验成败的关
键[19]。完整的或较长的启动子中含有种子特异性序
列元件拷贝数的多少与启动子活性的强弱相关[20]。
膜脂不饱和脂肪酸必须维持在较高水平, 植物才能
生存, 硬脂酸-ACP 脱饱和酶是最重要的脱饱和酶[21],
表达量应该比较高, 本试验比较了 CaMV35S 启动
子和 SACPD-Cp 启动子在大豆种子中驱动 GUS 基
因表达的能力, SACPD-Cp驱动 GUS基因在种子中
的表达活性是 CaMV35S 启动子的 93.01%, 推测大
豆 SACPD-Cp 启动子远端序列可能存在负相关元件,
还有待进一步研究。
本试验表明 SACPD-Cp启动子具有较强驱动下
游基因在种子特异性表达的特点; 但 SACPD-Cp 启
动子作用元件具体如何调控该启动子, 仍需进一步
深入研究。
4 结论
克隆得到一个全新的大豆种子特异性启动子
SACPD-Cp。该启动子在大豆种子中的启动活性是
CaMV35S 启动子的 93.01%, 推测 SACPD-Cp 启动
子远端序列存在负相关元件。
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