全 文 ：第28卷 第2期 作　物　学　报 V ol. 28, N o. 2
2002 年3月　 254～ 259页 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA pp. 254～ 259　M ar. , 2002
苎麻栽培品种亲缘关系的 RAPD 分析Ξ
揭雨成1　周青文2　陈佩度2
(1中国农业科学院麻类研究所, 湖南长沙, 410006; 2南京农业大学农学系, 江苏南京, 210095)
摘　要　从1000多份苎麻种质资源中筛选出抗旱性较强和较弱的栽培品种各6个, 选用25个随机引物, 对其总DNA 进
行随机扩增。有12个引物扩增得到了稳定的RA PD 图谱; 扩增出的片段分子量在0. 6～ 5. 15 kb 之间, 条带数在3～ 15条
之间, 共扩增出90个条带; 采用聚类法中的中间距离法, 对12个品种的相似系数聚类生成树状图谱, 分为两类三组, 揭
示了供试品种的亲缘关系, 但抗旱基因型被分在不同的类一组中。
关键词　栽培苎麻; RA PD; 聚类分析
中图分类号: S563　　　文献标识码: A
Genetic Rela tion Ana lysis of Ram ie Culturars with RAPD M ark
J IE Yu2Cheng1　ZHOU Q ing2W en2　CH EN Pei2D u2
(1 Institu te of B ast F iber C rops, CA A S , Y uanj iang 413100; 2N anj ing A g ricultural U niversity , N anj ing 210095, China)
Abstract　Six drough t resistance and six sensitive ram ie cultivars w ere chosen fo r investigating their genetic
diversity by RA PD. 25 ram dom p rim ersw ere used to amp lify the to talDNA from these geno types. T he results
show ed that 12 p rim ers p roduced repoducible amp lified p roducts and the length of the p roducts ranged 0. 6～
5. 15 kb. To tal 90 bands w ere iden tified, of w h ich, 11 bands w ere common in all varieties and 79 bands w ere
po lymorph ic. T he po lymorph ic bands accoun ted fo r 87. 78% of the to tal amp lified bands. A cco rding to the
po lymorph ism , 12 ram ie cultivars could be divided in to two types and th ree group s. T h is outcom e w as
co rresponding to their geograph ical distribution, but drough t resistance geno types w ere clusted in differen t
type2group s.
Key words　R am ie cultivars; RA PD; C luster analysis
　　苎麻是荨麻科 (U rticaceae) 苎麻属 (B oehm eria)
的多年生草本植物。据文献记载, 此属约有120个
种。我国已发现约32个种11个变种, 其中具有工业
意义和栽培价值的是白叶苎麻 [B . nivea L. Gaud ]
和它的绿叶变种 (又称绿叶苎麻) [B . nivea L.
Gaud. var. tenacissim a (Roxb. )M iq ]。
我国主要栽培白叶种苎麻, 分布于北纬18度至
36度之间的广大地区。我国苎麻品种类型极为丰
富, 经过人们长期培育和人工选择, 这些品种对不
同环境条件和栽培制度形成高度的适应能力和若干
优良性状。长期以来, 有关学者和专家从植物学特
征、生育特性、经济性状、抗逆性及纤维产量和品
质对苎麻品种资源进行了分类整理和利用[ 1, 2 ]。
本项目旨在对已鉴定出的抗旱材料和一些抗旱
性弱的品种, 应用RA PD 技术, 进行遗传变异性分
析。以期为苎麻抗旱育种工作的亲本选配提供信
息。
1　材料与方法
1. 1　材料
12个苎麻品种, 其中抗旱性较强和较弱的各6
个, 如表1。Ξ 基金项目: 中国农业科学院院长基金资助, 本研究在南京农业大学农业部细胞遗传重点开放试验室进行。
作者简介: 揭雨成 (19662) , 男, 湖南桃源人, 副研究员, 博士, 主要从事生理生化、生物技术与品种资源科研工作。
Received on (收稿日期) : 2000204229, A ccep ted on (接受日期) : 2001203204

表1　供试品种的名称、来源、产地及抗旱性
Table 1　Names, or ig ins and drought resistance of ram ie cultivars tested
代码
Codes
品种名称
V arieties
产地和来源
O rigins and breeding m ethods
根型
Root type
抗旱性
D rought resistance
aa 圆叶青 　　　　　中国农业科学院麻类所新选育品种 深 强
bb 乐昌岐苎 　　　　　广东省乐昌县地方品种 深 中
cc 青麻苎 　　　　　海南省保亭县地方品种 深 弱
dd 资兴绿麻 　　　　　湖南省资兴县地方品种 深 弱
ee 新宁箭杆麻 　　　　　湖南省新宁县地方品种 中 弱
ff 小鲁班 　　　　　江西省吉安地方品种 中 强
gg 长沙青叶圆麻 　　　　　湖南省长沙县地方品种 中 弱
hh 修水麻 　　　　　江西省修水县地方品种 中 强
ii 芦藩 　　　　　江西省宜春、分宜、万载地方品种 浅 强
jj 武岗原皮种 　　　　　湖南省武岗县 浅 弱
kk 吉安白皮苎 　　　　　江西省吉安县地方品种 浅 强
ll 吉安白麻 　　　　　江西省吉安、吉永县地方品种 浅 强
1. 2　方法
1. 2. 1　DNA 提取　　参照 Guidet 等[ 3 ]的方法并
略加改进, 具体步骤如下:
1. 取0. 2 g 幼嫩叶片于1. 5 mL Eppendorf 离心
管中, 放入液氮速冻;
2. 取出 Eppendorf 管, 用自制尖头玻璃将其中
叶片迅速磨碎;
3. 加入600 ΛL DNA 微量提取液[4% Sarkosy2
N a, 100 mmolöL T ris2HC l (pH 8. 0) , 100 mmolö
L ED TA (pH 8. 5) , 15% PV P ]混匀, 置冰上5～ 10
m in;
4. 加600 ΛL 苯酚ö氯仿ö异戊醇 (25÷24÷1)混合
液, 充分乳化, 置冰上5～ 10 m in;
5. 13000 röm in, 4℃离心5′, 将上清转至新
Eppendorf 管中;
6. 加600 ΛL 氯仿ö异戊醇 (24÷ 1) 重新抽提一
遍;
7. 13000 röm in, 4℃离心5 m in;
8. 移取上清液, 加入 75 ΛL 3 molöL N aA c
(pH 4. 8) 和600 ΛL 预冷异丙醇, 反转混匀以利
DNA 沉淀析出;
9. 将沉淀之DNA 用枪头挑出, 置新的1. 5 mL
Eppendorf 管中, 70% 酒精漂洗数次;
10. 加适量 T E 及R nase (最终浓度50 ΛgömL )
溶解 DNA , 并于 37℃处理 30～ 60 m in, 取适量
DNA 稀释, 与标准DNA 比较定量。
1. 2. 2　PCR 反应　　随机引物为美国Operon 公
司产品, 长度皆为10 bp , 随机选用A、B、F、G、
H、I、J、K、L、N、O 共11个试剂盒的25个随机引
物进行 PCR 扩增。DN T P 为 P rom ega 产品, 10×缓
冲液、M gC l2及 T aq DNA 多聚酶购自M B I 公司。
PCR 反应总体积为25 ΛL , 其中含有40 ng 左右的模
板DNA , 0. 2 ΛmolöL 随机引物, 200 ΛmolöL 每种
dN T P, 1×缓冲液 [ 10 mmolöL T ris2HC l(pH 8. 5～
9. 0) , 50 mmolöL KC l, 2. 0 mmolöL M gC l2, 0. 1%
T riton100或0. 01 Gelatin ]1U T aq 酶, 加30 ΛL 石腊
油 覆 盖。 反 应 在 Perk in2E lm er Cetus180 DNA
T herm al Cyaler 仪上进行。扩增条件为: 50个循环,
前5个循环为: 96℃变性1 m in, 35℃复性1 m in,
72℃延伸2 m in, 后45个循环: 96℃变性1 m in, 36℃
复性1 m in, 72℃延伸90 s; 最后72℃延伸10 m in。
扩增产物在1% 琼脂糖凝胶, 1×TA E 缓冲液中电
泳, 电泳完毕后, 经 EB 染色, 在紫外灯下观察结
果并照相, 试验进行两次重复。
1. 2. 3　数据统计分析　　根据每个位点上谱带的
有无分别用“1”、“0”代表。
采用N ei 和L i 的公式 Sx y = 2N x y ö(N x + N y) 计
算两品种间的相似系数, 再用系统聚类法对相似系
数进行聚类分析, 绘出树状图[ 4 ]。
2　结果与分析
2. 1　引物筛选
在试验的25个随机引物中, 有2个引物 (O PF2
18、O PF217)不能对任何供试苎麻品种基因组DNA
进行扩增, 有11个引物 (O PJ206、O PJ209、O PO 201、
O PL 201、 O PK203、 O PH 214、 O PJ215、 O PB 203、
O PA 216、O PJ216、O P I208) , 仅仅能对部分苎麻品
种的基因组 DNA 进行扩增, O PB 02、O PJ207、
5522期　　　　　　　　　　　　　　揭雨成等: 苎麻栽培品种亲缘关系的RA PD 分析　　　　　　　　　　　　　　　　

O PG211、O PK206、O PN 210、O PA 219、O PH 212、
O PF210、O PK203、O PO 216、O PF204等12个引物可
以对12个苎麻品种扩增出多态性谱带。
2. 2　扩增结果
从表2和图1、2、3可以看出, 不同引物对同一
苎麻品种所扩增出的DNA 片段数目不尽相同, 同
一引物对不同苎麻品种所扩增的DNA 片段数也不
尽相同, 少的3条, 多的有13条, 扩增出的片段分子
量在0. 6～ 5. 15 kb 之间。12个引物在12个苎麻品种
上总共扩增出90条带, 多态性为87. 78%。在12个
引 物 中, O PG211、 O PB 202、 O PF210、 O PJ2
0 7、O PO 21 6等 5个引物多态性达 1 0 0 % , 其中
表2　从苎麻12个品种中检测有多态性 RAPD 谱带数
Table 2　Number of ampl if ied polymorphic DNA fragments from 12 ram ie genotypes
引物
P rim er
碱基序列
Sequences
检测条带数
N um ber of
amp lified
多态性条带数
N um ber of po ly2
morphic bands
多态性 (% )
Ratio of po lym erphic
bands to amp lified bands
O PB202 TGA TCCCTGG 7 7 100. 00
O PA 219 CAAACGTCGG 7 6 85. 71
O PG211 TCCCCCTCCT 13 13 100. 00
O PH212 ACGCGCA TGT 7 4 57. 14
O PF210 GGAA GCTTGG 3 3 100. 00
O PJ207 CCTCTCGACA 9 9 100. 00
O PK206 CACCTTTCCC 7 4 57. 14
O PO 216 TCGGCGGTTC 7 7 100. 00
O PK203 CCA GCTTA GG 5 4 80. 00
O PN 208 ACCTCA GGGC 11 10 90. 91
O PN 210 ACAACTGGGG 5 4 80. 00
O PF204 GGTGA TCA GG 9 7 77. 78
总计 Total 90 79 87. 78
图1　引物O PA 219扩增的RA PD 图谱
F ig. 1　The RA PD pattern w ith p rim er O PA 219
自左至右为: Κ= M arker, 1= 圆叶青, 2= 乐昌岐苎, 3= 青麻苎, 4= 资兴绿麻, 5= 新宁箭杆麻, 6= 小鲁班, 7= 长沙青叶圆麻,
8= 修水麻, 9= 芦藩, 10= 武岗厚皮种, 11= 吉安白皮苎, 12= 吉安白麻等, 图2、3、4同。
The cultivars′nam es and order num ber are as fo llow s. 1= Yuanyeqing, 2= L echangqizhu, 3= Q ingm azhu, 4= Zixinlum a,
5= Xinningjianganm a, 6= Xiao luban, 7= Changshaqingyeyuanm a, 8= Xiushuim a, 9= lufan, 10= W uganghoup izhong,
11= J i′anbaip izu, 12= J i′anbaim a. The order num ber is the sam e to F ig2、F ig3 and F ig4
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图3　用引物O PH 212扩增的RA PD 图谱
F ig. 3　The RA PD pattern w ith p rim er O PH206
O PG211扩增条带为最多。
2. 3　利用 RAPD 标记提供的相似系数信息进行聚
类分析
2. 3. 1　基因型间的相似系数　　参照N ei. M 和
W. H. L i[ 4 ]提出的相似性公式计算12个品种间在分
子水平上的相似系数。其全矩阵列于表3。
2. 3. 2　聚类分析　　依据相似矩阵, 应用中间距
离法作聚类分析, 所用程序包 C lust11由南京农业
大学大豆研究所编制提供。结果见图4, 12个苎麻
基因型被划分为两大类, 三个组。第一类包括圆叶
青、武岗厚皮种、小鲁班、芦藩、长沙青叶圆麻、修
水麻、吉安白皮苎等8个基因型, 第二类包括乐昌
岐苎、资兴绿麻、青麻苎、新宁箭杆麻。在第一类
中, 长沙青叶圆麻和吉安白麻相似系数最高, 达
0. 7667, 它们与修水麻聚成一亚组; 小鲁班和芦藩
相似系数为0. 6606, 聚在同一亚组, 上述两亚组与
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表3　根据 RAPD 得到的苎麻基因型间相似距阵图
Table 3　M atr ix of genetic sim ilar ity coeff ic ien ts of RAPD in 12 ram ie genotypes
bb 0. 1379
cc 0. 4000 0. 4483
dd 0. 2105 0. 4000 0. 3509
ee 0. 3793 0. 2500 0. 3448 0. 2545
ff 0. 4390 0. 3000 0. 4146 0. 3544 0. 3750
gg 0. 4828 0. 4000 0. 3218 0. 3810 0. 4235 0. 5872
hh 0. 2933 0. 4110 0. 4000 0. 4722 0. 2740 0. 4948 0. 5294
ii 0. 5287 0. 3765 0. 5287 0. 4286 0. 3059 0. 6606 0. 5439 0. 6078
jj 0. 4138 0. 2500 0. 2069 0. 2909 0. 1071 0. 5250 0. 3765 0. 4658 0. 4941
kk 0. 2769 0. 2857 0. 2769 0. 3548 0. 2857 0. 5287 0. 6087 0. 5000 0. 4565 0. 222
ll 0. 4516 0. 4615 0. 4301 0. 4222 0. 3736 0. 6261 0. 7667 0. 6667 0. 7000 0. 4615 0. 5102
aa bb cc dd ee ff gg hh ii jj kk
图4　苎麻基因型的RA PD 聚类分析树状图
F ig. 4　Dendrogram of the tested iso lates of ram ie
genotypes tased on RA PD m arkers
吉安白皮苎聚为同一组; 圆叶青与武岗厚皮种相似
系数达0. 4138, 聚为一组, 上述两组归为第一类;
在第二类中, 乐昌岐苎与青麻苎相似系数为
0. 4483, 首先聚在一起, 它们与资兴绿麻聚成一
组, 新宁箭杆麻与这一组归于第二类。各类、组或
亚组内的基因型在地理分布上具有一定的相关性。
如小鲁班与芦藩聚在同一亚组, 它们均来自江西吉
安、宜春等麻区, 乐昌岐苎与青麻苎来自广东与海
南, 聚在同一亚组; 圆叶青与武岗厚皮种均来自湖
南, 聚在同一亚组。但在抗旱性较强的6个基因型
中, 除了芦藩和小鲁班聚在同一亚组外, 其它均聚
在不同的组或亚组, 表明它们可能携带有不同的抗
性基因, 或者所分析的RA PD 标记太少和抗旱性无
直接联系, 而6个抗旱性较弱的基因型中却有4个聚
在同一组或类。
3　讨论
3. 1　RAPD 标记的稳定性
RA PD 分析程序简单, 周期短, 所需DNA 量
极少且质量要求不苛刻, 可使研究者快速高效地获
取涉及许多个体许多位点的DNA 序列多态性资
料, 另外, 它不受种属特异性和基因组结构限制,
一套引物可适于任何物种, 包括那些无任何分子生
物学研究基础的物种, 因而该技术已应用于生物学
研究的各个领域, 如染色体组图谱分析[ 5 ]; 基因定
位[ 6 ]; 品种鉴定[ 7 ]; 遗传变异性分析系系统进化研
究[ 8～ 10 ]。一般而言, 理想的标记应具备以下几个特
点; ①高度的多态性; ②容易使用; ③数目丰富;
④可靠。对于RA PD , 前3点是其引起人们注意并予
以广泛应用的突出属性。至于可靠性, RA PD 确实
很敏感, 反应体系及条件稍有变化, 便会对其结果
产生影响。所以应保持DNA 模板浓度, 引物浓度,
M g2+ 浓度, 热循环反应条件相同, T aqDNA 聚合酶
批次一致。就本研究而言, 试验进行2次重复, 重复
性很好, 结果是可靠的。
3. 2　RAPD 在苎麻栽培品种亲缘关系分析中应用
的可行性
传统的亲缘关系研究大多采用系谱、地理分
布, 形态及生化分析, 这些分析虽然对阐明植物亲
缘关系起了很大的使用, 但也有一定的局限性。在
栽培品种之间, 可以应用 RA PD 进行遗传变异分
析。本研究聚类分析结果与地理分布基本吻合, 证
实了RA PD 用于品种间遗传变异性分析的可行性。
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利用聚类中组或亚组亲缘关系较远的抗源作为
杂交亲本, 利于拓宽遗传基础, 在育成品种中积聚
抗性基因。而利用组或亚组间亲缘关系较远而抗性
差异又大的材料做为杂交亲本, 则有可能形成分子
标记多态性水平较高的分离群体, 利用构建分子标
记框架图谱, 定位抗性基因。
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