全 文 ：　　
第26卷 第5期 作　物　学　报 V ol. 26, N o. 5
2000 年9月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA Sep. , 2000
马协不育花药药隔ATPase 超微结构定位X
关和新1　田惠桥1　朱英国1, 3 3 　蓝盛银2　徐珍秀2
(1武汉大学遗传研究所, 湖北武汉, 430072; 2 华中农业大学电镜室, 湖北武汉, 430070)
提　要　马协可育花药单核期和二核期药隔维管束薄壁细胞核、筛分子质膜、胞间连丝及其转运物、
药隔薄壁细胞液泡膜、胞间隙及淀粉粒表面具有A T Pase 活性。马协不育花药单核期维管束薄壁细胞
核变形, 核内有弥散的异染色质, 随后异染色质团转移到核边缘, 并表现出减少的趋势; A T Pase 主要
定位于核异染色质、线粒体、液泡、质膜以及药隔薄壁细胞胞间隙。不育花药维管束缺乏胞间连丝, 药
隔内无淀粉, 二核期许多维管束薄壁细胞仅存空腔。基于以上研究结果, 我们认为可育花药维管束营
养物质卸出主要取共质体途径。不育花药维管束营养物质卸出存在障碍; 论文还探讨了不育花药维管
束薄壁细胞解体的可能机制。
关键词　水稻; 雄性不育; 药隔; A T Pase 定位
Ultra structura l L oca l iza tion of ATPa se in Connective of M ax ie
Cytopla sm ic M a le Ster ile (CM S) An ther (O ryza sa tiva L. )
GUAN H e2X in1　T IAN H ui2Q iao1　ZHU Ying2Guo1　LAN Shen2Yin2　XU Zhen2X iu2
(1 Institu te of Genetics, W uhan U niversity , W uhan, H ubei P rov ince, 430072; 2 E lectrical M icroscope L ab, H uazhong
A g ricalturial U niversity , W uhan, H ubei P rov ince, 430072)
Abstract　 It w as show n that nuclei of parenchym atous cells, p lasm a m em brane of sieve elem en ts
and p lasmodesm ata together w ith lts transm itted m aterials have A T Pase activity in vascular
bundle of fertile an ther bo th at un i2and binucleate stages. W h ile in connective, A T Pase w ere
localized in tonop last, in tercellu lar space and starch grain s′surface. In sterile an ther at
un inucleate stage, nuclei of parenchym atous cells in vascalar bundle w ere defo rm ed, and
heteroch rom atin w ere scattered in the nulclei, then heteroch rom atic bodies transpo rted to the
periphery and tend to disappear. A t the sam e stage in vascular bundle, A T Pase w ere localized in
heteroch rom atic bodies, m itochondria, vacuo le and p lasm a m em brane. W h ile in connective,
A T Pase w ere localized in the in tercellu lar space. Furthermore, neither p lasmodesm ata in vascular
bundle no r starch grain in connective w as observed. A t binucleate stage, a lo t of parenchym atous
cells in vascular bundle w ere emp ty. Based on the above results, w e suggested that nutrien ts
un loaded from vascular bundle via symp lasm ic pathw ay in fertile an ther, and there w as som e
obstacle at nutrien t un loading in sterile an ther. A t the end of paper, the m echn ism w as also
discussed about the degeneration of parenchym atous cells in the vascular bundle of sterile an ther.
Key words　R ice (O ry za sativa L. ) ; CM S; Connective; A T Pase L ocalization
X 国家自然科学基金资助项目　　3 3 通讯联系人
收稿日期: 1999203224, 接受日期22000201229

关于营养器官维管束研究已有较多报道[ 1, 2 ] , 而生殖器官花药的维管束研究却很少, 且
大多数研究仅限于显微水平观察。药隔作为花粉营养物质转运的咽喉对花粉发育无疑具有重
要影响, 但至今我们对其物质运输机理几乎一无所知, 而仅依靠结构研究不能获得支持共质
体或质外体运输的直接证据[ 3 ]。A T Pase 定位可以揭示A T Pase 的水解活性[ 4～ 6 ] , 并能反映物
质运输的共质体或质外体途径[ 7 ]。本文采用A T Pase 定位方法研究了二核晚期败育[ 8 ]的马协
不育花药药隔, 以探索其结构和功能的变化。
1　材料和方法
将马协不育花药和可育花药横切, 一半用于超微结构观察, 半薄切片鉴定花粉发育时
期。另一半用于A T Pase 定位研究, 将横切过的花粉立即投入50 mmolö L Sodium 2cocadylate
配制的含0. 5% 戊二醛和4% 多聚甲醛的前固定液中, 4℃固定75m in, 其余步骤同何才平[ 7 ]的
方法; 孵育液不加A T P 底物或加入N aF 抑制剂作对照, A T Pase 定位样品超薄切片后直接观
察。超微结构研究的样品经醋酸铀和柠檬酸铅双重染色后观察。
2　结果
统计表明可育花药药隔维管束横切面约排列45个细胞 (不含鞘细胞) , 比不育花药约15个
细胞多2倍。
单核边位期可育花药维管束有2个导管, 导管内无 A T Pase 活性; 6～ 7个质膜上有
A T Pase 活性的筛分子组成发达的筛管群; 薄壁细胞核大, 多位于细胞的中央, A T Pase 极活
跃; 液泡小且膜完整, 液泡内无A T Pase 活性 (图版 É , 1)。薄壁细胞间有丰富的胞间连丝 (图
略) , 薄壁细胞与鞘细胞间也存在丰富的胞间连丝, 并可清楚地观察到物质经胞间连丝转运
入鞘细胞并在胞间连丝出口附近堆叠 (图版 É , 1、2)。从图版 É , 2还可以清楚地观察到薄壁
细胞核A T Pase 分布均匀, 细胞核无异染色质化现象; 此外, 薄壁细胞液泡、薄壁细胞与鞘细
胞间细胞壁以及胞间隙均无A T Pase 活性 (图版 É , 2)。单核边位期可育花药药隔薄壁细胞有
大的中央液泡, 液泡膜上有较多 A T Pase 定位颗粒, 液泡内则无 A T Pase 活性, 细胞核
A T Pase 极活跃, 复粒淀粉的每一单粒表面也有A T Pase 活性, 药隔薄壁细胞的质膜及胞间隙
有A T Pase 定位颗粒存在 (图版 É , 3)。
超微结构观察表明马协不育花药维管束缺乏导管, 仅2～ 3个筛分子, 单核边位期不育花
药维管束薄壁细胞有较大的液泡, 并观察到液泡膜局部破裂, 线粒体有很大的电子透明区
(论文待发表)。A T Pase 定位也观察到液泡间膜破裂, 有的液泡内及液泡膜上A T Pase 活跃。
薄壁细胞质膜也具有活跃的A T Pase 活性, 细胞壁局部破裂, 细胞壁和胞间隙未观察到
A T Pase 活性, 也未观察到胞间连丝 (图版 É , 4)。不同切面显示薄壁细胞质壁分离, 细胞壁
破裂, 细胞核异染色质化, 异染色质具有活跃的A T Pase 活性 (图版˚ , 5)。单核边位期不同
样品观察到异染色质团转移到核边缘, 异染色质团的A T Pase 活性很强, 无异染色质区域则
缺乏A T Pase 活性 (图版˚ , 6) ; 有的薄壁细胞有许多中等大小的液泡, 液泡内及液泡膜有极
活跃的A T Pase 活性, 细胞核严重变形 (图版˚ , 7) , 核经放大后可以观察到核边缘仅存少量
异染色质团 (图版˚ , 8)。此外, 在薄壁细胞内还观察到线粒体具有活跃的A T Pase 活性 (图
版˚ , 9)。单核边位期不育花药药隔薄壁细胞扭曲变形, 许多细胞缺乏胞质, 残存的质膜及
胞间隙有A T Pase 活性 (图版˚ , 10)。
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二核期 (营养核位于萌发孔侧面) 可育花药维管束A T Pase 定位于薄壁细胞核、筛分子质
膜及少数液泡内 (图版˚ , 11) , 细胞壁和胞间隙无A T Pase 活性, 薄壁细胞间有丰富的胞间
连丝, 并可观察到跨胞间连丝的转运物 (图版˚ , 12)。药隔薄壁细胞仍然能观察到复粒淀粉,
复粒淀粉的每一单粒表面具A T Pase 活性 (图略)。
二核早期 (营养核位于萌发孔对面) 超微结构观察显示不育花药维管束薄壁细胞核解体,
细胞核内有很多电子透明的空腔, 并存在有膜包围的圆形物, 与细胞核邻接的液泡内也观察
到类似的圆形物 (图版¸ , 13)。A T Pase 定位显示二核期 (营养核位于萌发孔侧面) 不育花药
维管束筛分子质膜上有较活跃的A T Pase 活性, 但许多薄壁细胞缺乏胞质仅存空腔 (图版¸ ,
14)。药隔薄壁细胞缺乏淀粉 (图略)。
孵育液加入N aF 抑制剂 (图版¸ , 15)或不加底物A T P (图版¸ , 16)均无A T Pase 活性反
应。
3　讨论
3. 1　可育花药药隔ATPa se 定位及功能
应用磷酸铅沉淀技术在超微水平上研究高等植物细胞内A T Pase 的分布状况已有较多报
道。A T Pase 定位可以探测A T Pase 的水解活性[ 4～ 6 ], 此外, 质膜和液泡膜A T Pase 可能与物
质的吸收或分泌有关[ 7 ] , 而细胞壁和胞间隙的A T Pase 活性可能参与质外体运输过程[ 9 ] , 细
胞核的A T Pase 可能与DNA 和RNA 合成有关[ 10, 11 ]。
马协不育花药维管束薄壁细胞核大, A T Pase 极活跃, 推测可育花药维管束薄壁细胞
DNA 和 RNA 合成旺盛。线粒体无A T Pase 活性, 表明线粒体A T Pase 的主要功能是合成
A T P。维管束薄壁细胞大多数液泡不具A T Pase 活性, 可能液泡的水解酶类在二核期以前处
于相对不活跃状态, 加上液泡膜完整, 有利于水解酶类的屏闭, 保护细胞不被消化。药隔薄
壁细胞都有很大的中央液泡, 液泡膜有活跃的A T Pase 活性, 显示药隔薄壁细胞液泡吸收和
分泌活跃, 以上A T Pase 定位结果同时也说明药隔薄壁细胞液泡的功能与维管束薄壁细胞液
胞的功能存在明显差别。维管束薄壁细胞间以及薄壁细胞与鞘细胞间的细胞壁与胞间隙缺乏
A T Pase 活性, 而在药隔薄壁细胞胞间隙存在较活跃的A T Pase 活性, 表明营养物质在药隔薄
壁细胞间的转运方式与维管束营养物质卸出方式存在差异。营养物质卸出维管束主要取共质
体途径 (见下文) , 质外体途径可能不活跃, 而营养物质在药隔薄壁细胞间传递存在明显的质
外体转运机制。此外, 本文还观察到药隔薄壁细胞存在较多的复粒淀粉, 复粒淀粉的每一单
粒表面均存在A T Pase 活性, 推测药隔薄壁细胞的碳水化合物处于贮存或转移的动态变化之
中, 而不是处于静止状态。
3. 2　不育花药药隔维管束异常与程序性细胞死亡
研究表明雄性不育小麦和水稻花药活性氧类物质显著高于可育花药[ 12, 13 ] , 而活性氧类
物质与程序性细胞死亡密切相关[ 14～ 16 ]。导管分化是植物程序性细胞死亡的典型例子[ 1, 16 ] , 许
多不同类型的细胞在离体条件下能发育成导管[ 17 ]; 筛分子分化要求精确消除某些种类的细胞
器而保留另外几类细胞器, 而细胞核的消除同样被认为与程序性细胞死亡有关[ 2 ]。马协不育
花药无导管, 仅2～ 3个筛分子, 可能维管束发生早期细胞不能实现必要的、正常的程序性死
亡。此外, 单核边位期不育花药维管束薄壁细胞壁破裂, 质壁分离, 可育花药药隔薄壁细胞
未出现质壁分离现象, 图版 É , 4多数薄壁细胞也无质壁分离现象, 且多数细胞结构保持完
5165期　　　　　　　　　关和新等: 马协不育花药药隔A T Pase 超微结构定位　　　　　　　　　　　　　

好, 推测图版˚ , 5质壁分离是局部的、真实的, L evine 用100 mmolö L H 2O 2处理大豆细胞也
观察到细胞壁破裂现象 (文献14图7C) , 因此我们认为不育花药维管束薄壁细胞壁破裂、质壁
分离是细胞解体的必然现象而非制样过程形成的假像; A ndrew Groover[ 18 ]认为中央大液泡解
体是细胞程序性死亡的标志, 超微结构观察表明单核边位期不育花药维管束薄壁细胞液泡膜
破裂 (论文待发表) , A T Pase 定位也观察到类似现象; 此外, 细胞核变形, 其内弥散着异染色
质, 随后异染色质团转移到核边缘, 并有逐渐减少的趋势。超微结构还观察到二核早期不育
花药维管束薄壁细胞核内以及与核邻接的液泡内均存在圆形物, 维管束薄壁细胞的以上特点
类似于程序性细胞死亡的解剖特征[ 14, 16, 19 ]。但是, 薄壁细胞解体是否存在程序性细胞死亡机
制还有待进一步研究。
3. 3　从不育花药药隔的ATPa se 定位看其结构和功能的变化
马协不育花药维管束缺乏导管, 仅2～ 3个筛分子, 维管束细胞数量也明显少于相应的可
育花药, 推测营养物质纵向运入药隔存在障碍。
A T Pase 定位显示不育花药单核边位期维管束薄壁细胞核异染色质化, 异染色质团转移
到核边缘, 并有逐渐减少的趋势, 可能此时细胞核发生了染色质浓缩、断裂及转移等剧烈的
变化[ 20 ] , 推测细胞核的正常功能受到了严重影响。
超微结构观察显示不育花药单核边位期药隔维管束薄壁细胞线粒体有很大的电子透明区
(论文待发表) , 本文观察到同期的线粒体有很强的A T Pase 活性。A T Pase 可能有水解A T P
和合成A T P 2种构象, 且2种构象在一定条件下可以相互转化, 而线粒体A T Pase 的 F 1部分从
酶解离后本身就有水解A T P 的功能[ 21 ]。不育花药维管束薄壁细胞线粒体的A T Pase 活性暗
示A T Pase 的结构和功能发生了变化, 这些变化将会导致A T P 合成能力降低或丧失。
不育花药维管束薄壁细胞液泡系的活动也是非常明显的。本文观察到单核边位期大多数
薄壁细胞都有较大的液泡, 有些液泡及液泡膜表现出强烈的A T Pase 活性, 表明液泡的水解
酶类处于活化状态 (注意可育花药药隔薄壁细胞A T Pase 酶仅定位于液泡膜上) , 加上液泡膜
破裂, 液泡与胞质间失去屏障, 水解酶类逸出液泡, 导致胞质消化, 细胞解体。所以在二核期
我们观察到许多维管束薄壁细胞仅存空腔。单核及二核期不育花药维管束及药隔薄壁细胞质
膜具活跃的A T Pase 活性, 可能细胞质膜的A T Pase 在解体物向胞外撤离过程中起重要作用。
胞间连丝的物质运输和信号传递功能已为越来越多的实验证实[ 22 ] , 拟南芥幼根分生区和
伸长区未分化的细胞间共质体联系, 细胞分化时则出现共质体隔离; 在成熟的根毛区, 表皮
细胞与其内侧的细胞共质体隔离; 不能建立共质体区的拟南芥突变体表现严重的发育缺
陷[ 22, 23 ]。这些实验说明胞间连丝对生长和发育有着深远影响。马协可育花药单核边位期和二
核期维管束薄壁细胞间、薄壁细胞与鞘细胞间有丰富的胞间连丝并显示活跃的物质运输, 而
细胞壁和胞间隙缺乏A T Pase 活性, 暗示维管束营养卸出的共质体途径非常重要, 胞间连丝
的功能不可替代。单核边位期不育花药维管束薄壁细胞缺乏胞间连丝或处于不活跃状态, 表
明细胞间共质体隔离, 而共质体隔离又阻碍了维管束细胞间以及维管束细胞与鞘细胞间的物
质运输和信息传递, 药隔薄壁细胞内缺乏淀粉也暗示药隔维管束营养物质卸出存在障碍。
马协不育花药花粉败育发生在二核晚期[ 8 ] , 本文研究结果表明远在花粉败育前, 药隔维
管束的结构和功能已发生了深刻的变化, 这些异常变化无疑会影响花粉营养物质的供应, 并
对花粉育性产生重大影响。因此, 密切注视维管束的活动有助于探索雄性不育的发生机制。
616　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　26卷

参　考　文　献
1　Fukuda H. T he P lant Cell, 1997, 9: 1147～ 1156
2　Sjo lund R D. T he P lant Cell, 1997, 9: 1137～ 1146
3　Robinson2Beers K, R F Evert. P lanta, 1991, 184, 291～ 306
4　Gilder J , J Cronshaw , T he J ournal of Cell B iology , 1974, 60: 221～ 235
5　Katz D B, M R Sussm an, et al. P lant P hy siol, 1988, 86, 841～ 847
6　朱　彤, 麻左力, 李文钿. 植物学报, 1990, 32 (2) : 91～ 96
7　何才平, 杨弘远. 植物学报, 1991, 33 (2) : 85～ 90
8　丁　毅, 余金洪, 朱英国. 武汉大学学报 (自然科学版) , 1998, 44 (6) : 729～ 732
9　简令成, 孙龙华, 孙德兰. 植物学报, 1983, 25 (4) : 313～ 315
10　简令成, 董合铸, 孙龙华. 实验生物学报, 1980, 13 (2) : 135～ 145
11　田国伟, 申家恒. 植物学报, 1993, 35 (5) : 329～ 336
12　陈贤丰, 梁承邺. 植物生理学报, 1991, 17 (1) : 44～ 48
13　赵会杰, 刘华山, 林学梧等. 作物学报, 1996, 22 (3) : 365～ 367
14　L evine A , R I Pennell, et al. Current B iology , 1996, 6 (4) : 427～ 437
15　M ittler R , V Shulaev, et al. T he P lant Cell, 1996, 8: 1991～ 2001
16　Pennell R I, C L am b. T he P lant Cell, 1997, 9: 1157～ 1168
17　Fukuda H. Int J P lant S ci, 1994, 155 (3) : 262～ 271
18　M eeting Report. T he P lant Cell, 1997, 9: 2105～ 2117
19　Cohen J J. Imm unology T od ay , 1993, 14 (3) : 126～ 130
20　田国伟, 申家恒, 植物学报, 1996, 38 (2) : 100～ 104
21　Hamm es G G. P roc N atl A cad S ci, U SA , 1982, 79: 6881～ 6884
22　M clean B G, F D Hempel, et al. T he P lant Cell, 1997, 9: 1043～ 1054
23　Duckett C M , K J Oparak, et al. D evelopm ent, 1994, 120: 3247～ 3255
Explana tion of Pla tes
BS2Bundle Sheath　cw 2CellW all　is2Intercellular space　m 2M itochondria　n2N ucleus　PC2Parenchym atous Cell　
pm 2P lasm a M em brane　S2Sieve E lem ent　st2Starch Grain　T2T racheary E lem ent　v2V acuole
A ll the F igures w ere A TPase localization excep t special exp lained.
Plate É 　1. V ascular bundle of fertile anther at uni2nucleate stage. Show ing p lalsmodesm ata betw een PC and BS
(arrow ). ×3040　　2. Enlarged of F ig. 1 at arrow indicated area. Show ing p lasmodesm ata (ho llow arrow ) and its
transm itted m aterials (arrow ). ×22400　　3. Connective parenchym atous cells of fertile anther at uninucleate stage. ×
11600 　　4. V ascular bundle of sterile anther at uninucleate stage, show ing tonop last (arrow ) and cell w all (ho llow
arrow ) cleaved, attention that som e vacuole have A TPase activity. ×3643.
Plate ˚ 　F ig. 529. , Parenchym atous cells in vascular bundle of sterile anther at uninucleate stage. 　　5. Show ing
p lasmolysis, cleaved cell w all ( arrow ) and deform ed nucleus w ith scattered heterochrom ation. × 10000 　 　 6.
Heterochrom atic bodies transported to the periphery of nucleus (arrow ). ×14000　　7. Show ing A TPase deposited in
vacuoles. ×4800　　8. Enlarged of F ig. 7, only a few of heterochrom atic bodies existed (arrow ). ×14000　　9. A TPase
activity of the m itochondria. ×14000　　10. Connective parenchym atous cells of sterile anther at uninucleate stage,
show ing A TPase activity in the intercellular space. ×9280　　11. V asular bundle of fertile anther at binucleate stage,
show ing A TPase activy of nuclei and vacuole. ×11520
Plate ¸ 　　12. V ascular bundle of fertile anther at binucleate stage, show ing p lasmodesm ata and its transm itted
m aterials (arrow ). ×9640　　13. U ltrastructure of parenchym atous cell in vascular bundle of sterile anther at binucleate
stage, show ing spherical liked m aterials in nucleus(arrow ) and vacuole (ho llow arrow ). ×15200　　14. V ascular bundle
of sterile anther at binucleate stage. ×2850　　15. N aF w as added to incubation　　16. Incubation w as absent of A TP
7165期　　　　　　　　　关和新等: 马协不育花药药隔A T Pase 超微结构定位