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第 28卷 第 5期 作 物 学 报 Vol.28,No.5
2002年 9月 638～643页 ACTAAGRONOMICASINICA pp.638～643 Sept.,2002
甘蓝型油菜种皮黑色素形成机理的研究*
叶小利1,* 李学刚2 李加纳2
(1西南师范大学生命科学学院,重庆 400715;2西南农业大学农学系 重庆 400716)
摘 要 甘蓝型油菜在种子发育过程中种皮中黑色素含量与多酚和游离酪氨酸呈极显著或显著负相关。提纯后黑色素
的 HPLC分析结果表明黑籽和黄籽油菜种皮黑色素的组成相同。在种子发育后期,种皮黑色素的增加速率(0.255)与
游离酪氨酸(0.071)和多酚(0.208)含量的下降速率之和(0.279)相近,说明黑籽油菜中黑色素是以游离酪氨酸和多酚
为前体合成的。实验结果还表明甘蓝型油菜种皮的黑色素是吲哚型和邻苯二酚型的混合型黑色素,并以邻苯二酚型黑
色素为主要组成成分。
关键词 黑色素;多酚;游离酪氨酸;种皮;甘蓝型油菜
中图分类号:S565 文献标识码:A
MechanismofMelaninSynthesisinSeedCoatofBrassicanapusL.
YEXiao-Li1 LIXue-Gang2 LIJia-Na2
(1DepartmentofLifeScience,SouthwestNormalUniversity,Chongqing400715,China;2DepartmentofAgronomy,SouthwestAgricultural
University,Chongqing400716,China)
Abstract MelaninhadahighlynegativecorrelationtopolyphenolsandfreetyrosineinseedcoatofBrassi-
canapusL.duringtheseeddevelopmentstage.AnalysisofHPLCshowedthatthecompositionofmelanin
inyelow-seedwassimilartothatinblack-one,andthedifferenceofseedcolorbetweenyelow-andblack-
seedresultsfromthatofthecontentofmelanininseedcoat.Duringthelatestageofseeddevelopment,
theincreasingrateofmelanin(0.255)inseedcoatapproximatedtothesumofthedecliningrateoffreety-
rosine(0.071)andpolyhenols(0.208).Itwasindicatedthatthesynthesisofmelaninneedednotonlyfree
tyrosine,butalsopolyphenols,andthatmelaninconsistedofeumelaninandpheomelanin,andthelatter
wasthemaincomposition.
Keywords Melanin;Polyphenols;Freetyrosine;Seedcoat;BrassicanapusL.
油菜种皮的色泽对于菜籽的品质,如含油量和
榨出油的质量等,具有重要的影响。研究表明,甘
蓝型油菜种皮中的色素主要有叶绿素、叶黄素、多
酚、类黄酮、花色素和黑色素等六大类[1],影响种
皮色泽的化合物可能主要是木质素、多酚化合物和
花色素等[2～4]。黄籽种皮的颜色,可能由水溶性花
色素类色素决定。黑籽除花色素外,可能还有其它
色素(如黑色素),也可能是花色素合成的前驱物的
影响所致[2]。王汉中等认为黑籽油菜种皮的颜色不
一定由花色素决定;有可能是多酚氧化酶所催化形
成的产物-简单型或聚合型苯醌类物质-黑色素决
定[5]。我们的研究结果表明,最终影响种皮色泽差
异的色素主要是黑色素[1]。通过黑色素与酪氨酸酶
及酪氨酸的相关性分析表明,种皮中的黑色素含量
与酪氨酸酶活性呈显著正相关,与游离酪氨酸含量
呈显著负相关。推测黑色素可能是在酪氨酸酶的作
用下以游离酪氨酸为前体进行合成的[6]。
迄今,关于甘蓝型油菜种皮黑色素形成的机
理,尤其是黑色素由何种前体物质转化而来等方面
的研究工作还未见报道。本文以两对不同遗传来源
的黑 黄籽近等基因系的甘蓝型油菜为实验材
料,研究了种子发育过程中种皮内黑色素的合成前
* 基金项目:国家九·五育种攻关(9600202131)、重庆市九·五重点攻关(9611001164)项目资助。
作者简介:叶小利,女,作物遗传育种专业博士,副教授,从事生物化学方面的教学和科研工作。
Receivedon(收稿日期):2001-09-17,Acceptedon(接受日期):2002-01-02
体的来源、黑色素的组成,希望能够通过对黑色素
的调控来解决黄籽油菜种皮色泽遗传不稳的问题。
1 实验材料和方法
1.1 供试材料和样品准备
相关性分析所用材料和样品的制备见文献[1]。
1.2 叶绿素和叶黄素的测定
称取 0.1000g左右的种皮用少量的丙酮研磨,
移入具塞试管中在 30℃水浴下提取 1小时,然后在
3500×g离心 15分钟,再用丙酮定容至 3.5mL,
混匀后于470nm、662nm和645nm处测定其吸光
度,按 Arnon[7]提供的测定叶绿素的方法分别计算
叶绿素 A、叶绿素 B和叶黄素的含量。
1.3 总酚、花色素和类黄酮的测定
总酚、花色素和类黄酮含量的测定见文献[1]。
类黄酮含量的计算见文献[8]。总酚的含量以没食子
酸作标准曲线(浓度范围 10～100µg)计算[9]。
1.4 黑色素的提取和测定
在实验材料与方法 1.2的残渣中加入 2mL
2%NaOH,在70℃的水浴中加热提取,所得提取液
在 290nm处测定其吸光度。黑色素的色价为 153,
以 mg/g干重表示其含量[10]:
C=E÷153(mg/g) (1)
其中,E为待测溶液在 290处的吸收值。
1.5 黑色素的提纯和高压液相色谱(HPLC)分析
黑色素粗提液进一步精制,以 0.05mol/L的
NH4HCO3水溶液作洗脱液,用交联葡聚糖凝胶
(G100)柱分离,将收集的有效组分 100mg溶于 20
mL6mol/L的 NaOH溶液,65℃水浴半小时,滴
加浓盐酸使之沉淀,静置过夜。沉淀用水洗至 pH
≥3,干燥后反复用乙醚振荡萃取。干燥后用于
HLPC分析。
黑色素提取液在 Waters高压液相色谱仪上用
C18进行分离,柱长 300mm×45mm,洗脱液是甲醇
(50%)溶液,检测波长为 290nm,流速 1mL/min。
1.6 种皮总酪氨酸和游离酪氨酸的测定
油菜种皮中总酪氨酸和游离酪氨酸的测定见文
献[6]。
数据用 DPS处理系统在计算机上进行统计分
析。
2 实验结果
2.1 黑色素与酪氨酸和其它色素之间的相关性分
析
表 1列出了黑色素与总酪氨酸和游离酪氨酸之
间的相关性分析结果。结果表明,黑色素与游离酪
氨酸呈显著和极显著的负相关,而与总酷氨酸关系
不密切。
表 1 黑色素与游离酪氨酸和总酪氨酸之间的相关性
Table1 Correlationcoeffecientamongmelaninandtyrosine
组合
Combination
黑色素和游离酪氨酸
Melaninandfreetyrosine
黑色素和总酪氨酸
Melaninandtotaltyrosine
游离酪氨酸和总酪氨酸
Freetyrosineandtotaltyrosine
4B -0.6284 -0.4995 0.1715
4Y -0.8820** -0.5173 0.5142
8B -0.8727** -0.5510 0.5046
8Y -0.8665** 0.6413 -0.5589
注:* 表示 5%的显著相关;** 表示 1%极显著相关;自由度为 3。 * and** indicatessignifiacantatthe5% and1% levels;df
=3.
表 2列出了黑色素与叶绿素、叶黄素、多酚、
类黄酮和花色素之间的相关性。分析结果表明在甘
蓝型油菜种子发育过程中,黑色素的含量变化主要
与多酚呈显著或极显著的负相关关系;而与其它色
素(叶绿素、叶黄素、类黄酮和花色素等)的关系不
密切。
图 1和图 2示出了甘蓝型×埃塞俄比亚芥的组
合后代的黑籽(8B)种皮中黑色素、酪氨酸和多酚的
含量随着种子发育时间的变化情况。从图可知在种
子发育的初期,多酚的含量呈逐渐上升趋势,而黑
色素在此阶段的变化甚微;在油菜开花后第 35天
后,多酚的含量增加达到最大值,然后逐渐下降,
相比之下,黑色素的含量在此时开始表现出上升趋
势;在开花后第 43天,黑色素的含量激剧增加,而
此时多酚的含量也表现出迅速下降趋势。
从图 1也可以看到黑色素与酪氨酸含量的变化
趋势与图 2基本一致。前文[6]已发现黑色素的含量
变化与种皮中游离酪氨酸的含量呈极显著负相关,
并推测黑色素可能是在酪氨酸酶的作用下利用游离
酪氨酸为前题合成的。
9365期 叶小利等:甘蓝型油菜种皮黑色素形成机理的研究
表 2 甘蓝型油菜种皮中各种色素间的相关性分析
Table2 AnalysisofcorrelationbetweenpigmentsinseedcoatofBrassicanapus
色 素
Pigment
组合
Combination
叶绿素 a
Chlorophyla
叶绿素 b
Chlorophylb
叶黄素
Carotin
多 酚
Polyphenol
类黄酮
Flavonoid
花色素
Anthocyanidin
叶绿素 b 7B 0.7380*
(Chlb) 7Y 0.9391**
8B 0.2527
8Y 0.7759*
叶黄素 7B -0.7406* -0.4670
Carotin 7Y -0.7071* -0.8592*
8B -0.7157* -0.3238
8Y -0.2161 0.1921
多酚 7B 0.3358 0.3308 -0.5851
Polyphenol 7Y 0.2396 0.1051 0.1554
8B 0.9024 0.0174 -0.4078
8Y 0.4576 0.0611 -0.9413
类黄酮 7B 0.3583 0.7653* -0.2641 0.1985
Flavonoid 7Y 0.8123* 0.8907** -0.8773** -0.0227
8B -0.2625 0.2331 0.3376 -0.2583
8Y 0.5537 0.8577** 0.5051 -0.2404
花色素 7B -0.0862 0.0001 -0.0155 0.5777 -0.1542
Anthocy- 7Y -0.0729 -0.2046 0.4531 0.8811** -0.4010
anidin 8B 0.2545 0.1165 0.2136 0.4107 0.7276*
8Y 0.8250** 0.9472** 0.0595 0.1685 0.8382**
黑色素 7B -0.5427 -0.2335 0.8207* -0.8159* 0.1012 -0.4579
Melanin 7Y -0.1126 0.0898 -0.4738 -0.8521** 0.1500 -0.7796*
8B -0.9394** -0.1583 0.7744* -0.8255* 0.4013 -0.0890
8Y -0.0301 0.4018 0.9512** -0.8205* 0.6702 0.2517
注:*表示 5%的显著相关;** 表示 1%极显著相关;自由度为 6。 * and** indicatessignifiacantatthe5% and1% levels;df=
6.
图 1 黑色素和酶氨酸含量变化
Fig.1 Changesinthecontentofmelanin
andtyrosineinseedcoatofrape
-n-Melanin -*-ootaltyrosine -p-Freetyrosine
2.2 黑色素q游离酪氨酸和多酚含量变化速率比
较
为了比较种皮中酪氨酸和多酚含量下降的速率
与黑色素含量增加的速率之间的关系;先对图 1和
图 2中的实验点利用最小二乘法的原理进行曲线拟
合;再以开花后 35天时的含量 C35为基准r从平滑
曲线上读取第s天种皮中游离酪氨酸或者多酚或者
黑色素的含量 Csr利用下式计算变化率tuCt:
tuCt=tCs-C35t (2)
图 2 油菜种皮多酚含量变化
Fig.2 Changesinpolyphenolcontent
inseedcoatofrape
046 作 物 学 报 28卷
(2)式对图 1和图 2中的数据处理,有关结果
示于图 3中。
从图 3可以看到,45天以后,种皮中黑色素、
游离酪氨酸和多酚含量的绝对值单调线性增加。在
种子发育的后期,种皮中黑色素的含量增加非常迅
速;对于图 3中曲线的线性部分进行处理,计算出
有关物质含量变化曲线的斜率 K。结果表明,
K黑色素=0.255 (mg/g干重·天) (曲线 A)
K酪氨酸=0.071 (mg/g干重·天)
(曲线游离酪氨酸)
K多酚=0.208 (mg/g干重·天) (曲线 B)
图 3 黑色素、多酚和游离酪氨酸的变化速率
Fig.3 ChangingRateofmelanin,polyphenolandfree
tyrosineinseedcoatofrape
-K-Lelanin -M-Nolyphenol -O-Free
tyrosine PPPAQQQB
A表示种子发育后期黑色素的变化斜率;B表示多酚的变化斜率
AistheslopeofmelaninandBistheslopeofpolyphenol
inthelatestageofdeRelopment
对比K的变化可以看到,K酪氨酸(0.071)明显小
于 K黑色素(0.255),即酪氨酸的减少速度,明显小于
黑色素增加的速度;K多酚(0.208)也小于 K黑色素
(0.255),即多酚含量下降的速度也小于黑色素增
加的速度;K多酚SK酪氨酸=0.27T,与 K黑色素(0.255)
相差不大,说明黑色素增加的速度与酪氨酸和多酚
二者下降的速度相差不大。
U.V 液相色谱分析的结果
从同一遗传背景的黄籽和黑籽油菜中,提取得
到黄籽种皮的黑色素和黑籽种皮的黑色素,利用
WNXC在 2T0nm处进行组成鉴定,有关结果示于
图 4和图 5中。
从图中可以看到,在本试验条件下,两种黑色
素的液相色谱图中均出现两个洗脱峰(一个保留值
在 3.8分钟,另一个保留值在 4.4分钟),表明两种
黑色素均由两种物质组成。对比图 4和图 5,可以
发现,两种液相色谱的图谱完全类似,表明黑籽和
黄籽种皮的黑色素成分完全相同,只是含量不同。
图 4 甘蓝型黄籽油菜种皮黑色素的 WNXC分析
Fig.4 WNXCofmelanininyeloYPseedrape
图 5 甘蓝型黑籽油菜种皮黑色素的 WNXC分析
Fig.5 WNXCofmelanininZlac[Pseedrape
V 讨论
黑色素(Lelanin)是对广泛分布于动植物界的
结构复杂的黑色难溶性色素的总称。在动植物体内
黑色素具有防御、保护的功能。由于黑色素有难溶
性、强吸光性及高分子结构,使得人们对其结构缺
乏全面和清楚的认识。现有资料表明,黑色素一般
为两种类型,即吲哚型(\]melanin)和邻苯二酚型
14^5期 叶小利等_甘蓝型油菜种皮黑色素形成机理的研究
(Pheomelanin)(见图 6)[11],认为动物黑色素多属
吲哚型(Eumelanin),而植物源黑色素多属邻苯二
酚型(Pheomelanin)。如乌贼墨黑色素属于吲哚型,
是酪氨酸在酪氨酸酶的作用下形成多巴(Dopa),进
一步氧化后,再经多巴色素、5,6-二羟基吲哚、黑
色素原色素而形成的[12,13]。王岩[11]等人研究了几
种天然黑色素分子结构的红外光谱,认为香蕉皮黑
色素和葵花籽皮黑色素属于邻苯二酚型黑色素,是
多酚类物质在多酚氧化酶和酚羟基酶的作用下转化
为羟基醌,进而聚合形成的[14,15],后来还发现有些
天然黑色素是吲哚型和邻苯二酚型的混合型色素,
如头发黑色素和芝麻黑色素属于混合型黑色素[11]。
图 6 两种类型黑色素的来源
Fig.6 Sourcesoftwotypesofmelanin
紫外扫描结果表明,甘蓝型黑籽和黄籽油菜种
皮中的黑色素吸收光谱峰形基本相同[16],即都只在
290nm处有一个吸收峰;分离提纯后的黑色素进
行 HPLC分析。从 HPLC图谱上显示出黄籽黑色
素的出峰保留值分别是 3.817和 4.433分钟,黑籽
黑色素的出峰保留值分别为 3.820和 4.420分钟,
说明两者出峰的时间基本相同,可以认为黑籽和黄
籽种皮的黑色素的组成是相同的,因此,黑籽和黄
籽种皮色泽的差异主要是由于黑色素的含量不同所
引起的。从 HPLC图谱上看,两种颜色种皮的黑色
素都有两个峰,说明黑色素是由两种色素成分组
成。
前文[6]的统计分析的结果发现黑色素的含量变
化主要与游离酪氨酸含量呈显著或极显著的负相
关。说明在种子的发育过程中,黑色素含量的增加
与游离酪氨酸含量的下降有非常密切的关系。对开
花后第 45天黑色素的增加速率与同时期游离酪氨
酸的下降速率进行比较分析的结果表明,游离酪氨
酸的下降速率(0.071)远小于黑色素增加的速率
(0.255),如果以全部游离酪氨酸作为黑色素合成
前体,也不会形成如此众多的黑色素。因为从合成
途径上,1g的游离酪氨酸(181g/mol)大约可以形
成 0.9g吲哚型黑色素(193g/mol)。说明甘蓝型油
菜种皮在种子发育的后期除了以游离酪氨酸为前体
合成黑色素外,还必需以大量的其它物质为前体合
成黑色素才能满足黑籽油菜种皮中大量黑色素形成
的需要。
表 1的结果表明,黑色素含量的变化与多酚含
量的变化呈极显著或者显著负相关,即黑色素的增
加与多酚含量的下降密切相关。图 3的结果显示,
开花后第 45天后,黑色素增加的速率(0.255)与多
酚和酪氨酸下降的速率之和(0.279)接近,表明甘
蓝型油菜种皮的黑色素除了以游离酪氨酸为前体合
成外,还以大量的多酚为前体进行合成。对比多酚
含量下降的速率(0.208)与酪氨酸下降的速率
(0.071)可以看到,多酚下降的速率约为酪氨酸的 3
倍,表明多酚转化为黑色素的量可能比酪氨酸转化
为黑色素的量多几倍,两种色素含量的明显差异从
液相色谱图中也可以看到(参见图 4和图 5)。
多酚转化为黑色素需要多酚氧化酶和酚羟基酶
的共同作用。已经发现,随着种子发育,多酚氧化
酶活力的变化与多酚类似[1]:种皮中多酚氧化酶的
活力从 35天开始下降,到 43天后多酚氧化酶的活
力很小(此时多酚的含量也很小了);这可能意味着
酚羟基酶的活力在多酚转化为黑色素的过程中起着
更重要的作用。
可见,甘蓝型油菜种皮的黑色素是由多酚转化
而来的邻苯二酚型黑色素和游离酪氨酸转化的吲哚
型黑色素组成的混合型色素,并且以邻苯二酚型黑
色素为主;为了控制黄籽油菜种皮黑色素的过分积
累,需要抑制多酚转化为黑色素的转化途径,而调
节酚羟基酶的活力可能更为有效。
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