全 文 ：不同培养条件对半夏悬浮培养细胞生长及
总生物碱形成的影响
范美华，周吉源!
（华中师范大学生命科学学院，湖北 武汉 !##$%） 摘要：研究了半夏悬浮培养过程中细胞鲜重的变化和 &’培养基组分中碳源、钙盐、()盐及 肌醇变化对半夏悬浮培养细胞生长及总生物碱合成的影响。结果表明，半夏细胞的生长曲线 呈“’”型，细胞的最佳收获时间为 *+ ,。在两种碳源中，葡萄糖比蔗糖利于细胞的生长和 总生物碱的合成，最适浓度为 *# -./。最适合细胞生长和总生物碱形成的钙盐浓度为 +01 2234./、()盐浓度为 #0#5 2234./和肌醇浓度为 +## 2-./。 关键词：半夏；细胞悬浮培养；总生物碱；生长速率 中图分类号：6 %!7 文献标识码：8 文章编号：#*7 9 *$##（*##!）#5 9 #575 9 #7
!#$%& ’ ()*%)+# (’,-.%.’,& ’, (#** /+’0%1 2,- 3’%2* 4*52*’.- 6’+72%.’, ., 8)&9#,&.’, ()*%)+#& ’ !#$%%& ’$(#&’&
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4:&%+2$%：8 IJ>,K 3E JG) LG?E-)I 3M L)44 K;)4, ?E, JG) )MM)LJ 3M L?NO3GK,N?J)I，L?4L;>2，() ?E, ;E3I;J34 3E JG) L)44 -N3PJG ?E, ?4Q?43;,I IKEJG)I;I ;E I>IR)EI;3E L>4J>N)I 3M 6(+$##(. ,$-+.,.（SG>EOT）UN);J T P?I
L?NN;), 3>J T SG) N)I>4J IG3P), JG?J L)44 -N3PJG RN3L)II ;E I>IR)EI;3E L>4J>N) RN)I)EJ), ? ’NV)，
JG) ,?J) M3N G?NV)IJ K;)4, P?I ?O3>J *+IJ ,?KT W4>L3I) P?I O)JJ)N JG?E I>LN3I) M3N L)44 -N3PJG N?J) ?E, ?4Q?<
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?4Q?43;,I RN3,>LJ;3E P?I：*# -./ -4>L3I) X +## 2-./ ;E3I;J34 X +01 2234./ H?H4*·*=*A X #0#5 2234./
()’A!·$=*AT ;#< 0’+-&：6(+$##(. ,$-+.,.（SG>EOT）UN);J T；H)44 I>IR)EI;3E L>4J>N)；S3J?4 ?4Q?43;,I；WN3PJG N?J) 半夏为天南星科植物半夏［6(+$##(. ,$-+.,.（SG>EOT）UN);J T］的干燥块茎；主要含有活 性生物碱、半夏蛋白、刺激性物质、88（氨基酸）、脂肪酸等多种化学成分（关虎吕， +%%$）。其次生代谢物生物碱具有镇吐痛、抗心律失常、抗坏血栓、抗肿瘤和提高记忆之
云 南 植 物 研 究 *##!，=>（5）：575 Y 55#
4$%2 ?’%2,.$2 @),,2,.$2 ! 通讯作者 电话：#*$ 9 5$15$1!
收稿日期：*##! 9 #! 9 *#，*##! 9 +# 9 #1接受发表
作者简介：范美华（+%$% 9）女，硕士研究生，主要从事植物的组织培养工作。Z 9 2?;4：,;E-)N7#[ I3G>0 L32 功效，是半夏药理作用主要有效成分之一（江苏新医学院，!#）。由于植物细胞具有全 能性及多条代谢途径，因而通过对培养条件的调控就会使代谢方向朝所需终产物方向增 强，从而达到提高次级产物含量的目的（甘烦远和郑光植，!!）。由于野生资源的匮乏， 对半夏愈伤组织的诱导和增殖做了大量的工作（韩献忠等，!$；万美亮等，!%；朱宝
成，!%）但对半夏细胞悬浮培养和次生代谢形成的培养条件的研究还未见报道。钙盐和
&’盐作为植物生长不可缺少的矿质元素，对药用植物的生长和次生代谢物的积累具有很
大的影响，但对其研究较少（韩建萍等，())*）。本文研究了半夏悬浮培养过程中细胞鲜
重的变化和 +,培养基组分中碳源、钙盐、&’盐及肌醇变化对半夏悬浮培养细胞生长及总
生物碱合成的影响，以期筛选最合适的培养条件，这对提高半夏细胞培养物中有效成分产
率，实现大规模生产具有重要意义。
! 材料与方法
!! 实验材料与培养条件
材料为由半夏幼嫩叶柄在 +, - ).% /012 3 4 56 - !.) /012(，7 4 8的培养基上诱导、在同一培养基中
继代培养 * 9 7代的生长均一，质地疏松、分散性好的愈伤组织。采用 (%) /:的三角瓶，装液量 !)) /:，
培养液 ;< %.$，加入 3 4 56 ).% /012和 (，7 4 8 !.) /012。在 ).!)% +;=，!(!>下灭菌 () /?@，每瓶接种 量为 !.% 0鲜重的愈伤组织，转速 !*) A1/?@，温度 (% B (>，光照白光（7)!/C:/ 4 ( D4 !，!7 E1F）或黑暗的 条件下悬浮培养。在对细胞周期和对钙盐、&’盐及肌醇进行测定时的碳源均为 *) 012的蔗糖。在对 +, 培养基组分进行修饰的时候，只有其中考察的一种组分变化，其余的均不改变。各实验独立进行，均做 *次重复，取其平均值。 !# 细胞生长周期的测定 接种后每 * F取光照和黑暗条件下培养的悬浮细胞，经真空泵减压过滤称其鲜重，绘出生长曲线。 !$ 细胞生长速率的测定
在光照条件下培养 (! F，培养结束后，将经真空过滤收集的培养物，置于 3)>的烘箱中烘干至恒
重，称其干重并按下列公式计算细胞生长速率：
细胞生长速率 G（收获干重 4接种干重）1（培养时间 H培养液体积）
由烘干至恒重的愈伤组织测其总生物碱含量。
!% 总生物碱含量的测定 参照张明和于超（())!）的方法。
# 结果与分析
#! 悬浮培养细胞的生长周期
在半夏细胞悬浮培养的过程中，分别置于黑暗和光照条件下培养，以细胞鲜重为生长
指标，可以看到生长曲线呈“,”型，并明显的分为 *个时期：延迟期、指数期和直线期、
静止期。在光照条件下，细胞生长速度较快，生长周期也较长，为 (! F左右。而在黑暗
条件下，其生长速度较慢，生长周期也短，为 !$F左右。此结果与郑光植和梁峥（!#3） 的研究结果相似。从生长曲线上还可以看出，在延迟期（) 9 3 F）培养物增重缓慢，这可 能是由于细胞对环境的适应需要一个过程，不能很好的吸收营养物质。在指数期（3 9 F）培养物增重迅速，直线生长期（ 9 (! F）为生长稳定增长期而到 (! F以后鲜重的增加 减慢并有下降趋势。这是由于培养基中养分耗尽或者是有害物质的积累所造成的。因此培 #%33期 范美华等：不同培养条件对半夏悬浮培养细胞生长及总生物碱形成的影响 养细胞的最佳收获期为 ! #。 !! 不同碳源对半夏悬浮细胞生长和总生物碱的影响 !$!$不同葡萄糖浓度对半夏悬浮细胞生长和总生物碱含量的影响 由表 可知，细胞生长率在 !% &’(的浓度下最大而总生物碱的含量在 )% &’(浓度下最 高。这与葡萄糖作为唯一的碳源参与细胞初级代谢和次级代谢是有关的。葡萄糖浓度超过 !% &’(时，半夏悬浮细胞的生长受到抑制，可能与高糖带来的培养基高渗透压有关。高渗 透压对培养基中其他营养物质的吸收有抑制作用，还可以造成细胞内含水量下降，从而也 影响了细胞内某些代谢功能的正常进行。鉴于细胞生物量和总生物碱含量的考虑，浓度为 !% &’(的葡萄糖是最合适的碳源。 表 # 不同葡萄糖浓度对半夏悬浮细胞生长和总生物碱含量的影响 *+,-. /00.123 40 #500.6.72 &-8143. 1471.726+25473 47 1.-- &6492: +7# +-;+-45#3 <64#812547 57 383<.73547 18-286.3 40 !#$%%& ’$(#&’&（*:87,=）>6.52 = 葡萄糖浓度 收获干重 生长速率 总生物碱含量 ?-8143. 1471.726+2547（&’(） @+6A.32 BC（&BC’(） ?6492: 6+2.（&BC’($#） D472.72 40 +-;+-45#3（!&’&BC）
% E$FGH I %$%HG %$H%JJ$!E! K %!
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!$!$! 不同蔗糖浓度对半夏悬浮细胞生长和总生物碱含量的影响
由表 和表 !可以看出，蔗糖和葡萄糖出现相似的趋势。葡萄糖作为碳源时，其悬浮
细胞生长量和总生物碱含量比用蔗糖做为碳源时稍高，这与郑穗平和郭勇（GGF）的实验
结果相似。这可能是因为葡萄糖易于被吸收利用或者是其分子量小培养基中的摩尔浓度
高，渗透势也会随之增加。所以一定量的高渗对半夏总生物碱的积累是有利的。
表 ! 不同蔗糖浓度对半夏悬浮细胞生长和总生物碱含量的影响
*+,-. ! /00.123 40 #500.6.72 381643. 1471.726+25473 47 1.-- &6492: +7# +-;+-45#3 <64#812547 57 383<.73547
18-286.3 40 !#$%%& ’$(#&’&（*:87,=）>6.52 =
蔗糖浓度 收获干重 生长速率 总生物碱含量
M81643. 1471.726+2547（&’(） @+6A.32 BC（&BC’(） ?6492: 6+2.（&BC’($#） *42+- +-;+-45#3 1472.72（!&’&BC） % E$!GG I %$J!! %$!EL F$FE!) K % !% E$FG! I %$J!F %$H%JJ F$F!JH K % H% E$!LJ I %$)!J %$!EJ) F$G%H! K % )% L$FGJ I %$JHJ %$!)LG $%H%H K %! E% J$GJ! I %$HJL %$LHG L$H!FF K % %% J$!HL I %$)HJ %$H%H )$!GJH K % !$ 不同 %&%’!·!(!)浓度对半夏悬浮细胞生长和总生物碱含量的影响
由表 H可以看出：无 D+盐存在时，细胞褐化死亡，这说明 D+盐是细胞生长必不可少
的物质；在低浓度下，细胞生长随 D+D-!·!@!N浓度的增加而增加，当达到 $! OO4-’(时， 细胞生长率最大为 %$!FF! &BC’($#。D+盐浓度过高或过低都不利于总生物碱的合成，这 与赵德修和李茂寅（!%%%）的实验结果相似；当 D+D-!·!@!N浓度为 H$% OO4-’(时，总生
F)L 云 南 植 物 研 究 !L卷
物碱含量达 !!#$% & !’(!)*)+,约为浓度为 ’% --./*0时的 !12倍。这可能是钙盐对细 胞代谢的调节机制，影响了合成生物碱的某些关键酶的活性。鉴于细胞生物量和总生物碱 含量的考虑，!$ --./*0的 343/(·(5(6将是最适合的 34(7源。
表 ! 不同 #$%·%&%’浓度对半夏悬浮细胞生长和总生物碱含量的影响 849/: 2 ;<<:=>? .< @A<<:B:C> =4/=AD- =.C=:C>B4>A.C? .C =:// )B.E>F 4C@ 4/G4/.A@? HB.@D=>A.C AC ?D?H:C?A.C =D/>DB:? .< !#$%%& ’$(#&’&（8FDC9I）JB:A> I 343/(·(5(6浓度 收获干重 生长速率 总生物碱含量 34/=AD- =.C=:C>B4>A.C（--./*0） 54BK:?> +,（)+,*0） LB.E>F B4>:（)+,*0@） 8.>4/ 4/G4/.A@? =.C>:C>（!)*)+,） ’ ! ! ’% M$!( N ’2#% ’(’M2 M1#O% & !’
!( OMM( N ’M$1 ’($$( %!’!# & !’ !$ %(#1 N ’#$% ’((%! !’2(# & !’( 2’ M1(# N ’2(% ’(!’O !!#$% & !’(
#( M(22 N ’!(# ’!OO$O!M!# & !’ %’ 2(M1 N ’#2( ’’$2$%2(O# & !’ ! 表示细胞褐化死亡 %() 不同 *+盐浓度对半夏悬浮细胞生长和总生物碱含量的影响 由表 #可知当铁盐浓度为 ’’# --./*0时最适合生物碱合成，过高或过低都不利于生 物碱的积累。这可能与 P:盐的调节机制有关，P:盐浓度过低，会造成腺嘌呤磷酸转移酶 （QRS8）基因的表达，催化生物碱的主要成分腺嘌呤和磷酸核糖焦磷酸（RSRR）合成能量 供蛋氨酸循环的利用，使生物碱的积累减少，过高可能会造成 P: 盐毒害（戚金亮等， (’’2）。细胞生长率在 ’’% --./*0时达最大值 ’($%( )+,*0 @。P:盐浓度过低，细胞易褐
化死亡，这可能是细胞缺乏 P: 盐以致不能进行光合和呼吸作用，而导致死亡的。’’%
--./*0的 P:盐是半夏细胞生长和总生物碱积累的最佳选择。
表 ) 不同 *+盐浓度对半夏悬浮细胞生长和总生物碱含量的影响
849/: # ;<<:=>? .< @A<<:B:C> P: =.C=:C>B4>A.C? .C =:// )B.E>F 4C@ 4/G4/.A@? HB.@D=>A.C AC ?D?H:C?A.C
=D/>DB:? .< !#$%%& ’$(#&’&（8FDC9I）JB:A> I
P:T6#·O5(6浓度 收获干重 生长速率 总生物碱含量
P: =.C=:C>B4>A.C（--./*0） 54BK:?> +,（)+,*0） LB.E>F B4>:（)+,*0@） 8.>4/ 4/G4/.A@? =.C>:C>（!)*)+,）
’’( MO12 N ’(!O ’(’## %##2’ & !’
’’# M$2( N ’21’ ’(’%2 O%2$( & !’
’’% OM!’ N ’M!( ’($%( O(2#% & !’ ’!’ M1#$ N ’22! ’(!!$MO(1M & !’ ’!# 2#$( N ’2(% ’’1#2 M(2%# & !’
’(’ 22#( N ’((2 ’’$OO M#2MM & !’ %(, 不同肌醇浓度对半夏悬浮细胞生长和总生物碱含量的影响 由表 M可以看出，不同浓度的肌醇对细胞生长率变化的影响不大，浓度过高可稍微抑 制细胞的生长。其总生物碱的含量在低浓度时随肌醇浓度升高而增加，随后下降。在肌醇 浓度为 !’’ -)*0时，总生物碱的含量最大。这可能与肌醇参与细胞的某些代谢活动有关， 其对总生物碱合成的调节机制还需进一步研究。 由以上实验结果可知：适合半夏细胞悬浮培养的 UT培养基的最佳组合为：(’ )*0葡 萄糖 7 !’’ -)*0肌醇 7 !$ --./*0 343/(·(5(6 7 ’’% --./*0 P:T6#·O5(6。其组分对总生物
1M%%期 范美华等：不同培养条件对半夏悬浮培养细胞生长及总生物碱形成的影响
碱的调节机制还需进一步的探讨和研究。
表 ! 不同肌醇浓度对半夏悬浮细胞生长和总生物碱含量的影响
!#$% & ’((%)*+ ,( -.((%/%0* .0,+.*,$ ),0)%0*/*.,0+ ,0 )%$$ 1/,2*3 0- $4$,.-+ 5/,-6)*.,0 .0 +6+5%0+.,0
)6$*6/%+ ,( !#$%%& ’$(#&’&（!360#7）8/%.* 7
肌醇浓度 收获干重 生长速率 总生物碱含量
90,+.*,$ ),0)%0*/*.,0（:1;<） =/>%+* ?@（1?@;<） A/,2*3 /*%（1?@;CD EBFGC H IBJGE DBCGFK LBDGD& M ID
LD EBI&& H IBFFD DBCLKJ LBICJG M ID
IDD EBJKF H DBFJJ DBCGDE GBGC&& M ID
IFD EBFGD H DBJ&E DBCGFG &BKJFC M ID
CDD EBIIF H DBIFC DBCLEJ &BCDJL M ID
〔参 考 文 献〕
关虎吕主编，IKKE 7 中国现代化研究与应用（第 C卷）［N］7 北京：学苑出版社
江苏新医学院，IKKE 7 中药大词典上册［N］7 上海：上海科学技术出版社
A0 OP（甘烦远），Q3%01 AQ（郑光植），IKKI7 !3% .0($6%0)% ,( -.((%/%0* ()*,/+ ,0 )%$$1/,2*3 0-R*,),53%/,$ ),0*%0* ,( )6$*6/%+ (/,: )&(’*&+,- ’#.’/(,-［S］7 0.’& 1/’ 2#（植物学报），（E）：&IL—&CC =0 ST（韩建萍），<.01 QU（梁宗锁），@01 SN（王敬民），CDDJ7 !3% /%$*.,0+3.5 #%*2%%0 :.0%/$%$%:%0* 0- *3% /,,* 1/,2*3
0- ))6:6$*.,0 ,( %((%)*.>% .01/%-.%0* .0 /,,* ,( */-.*.,0$ 3%/#+［S］7 !%&#’ !*3-/% )/++,#（植物生理学通讯），#（I）：
EG—GI
=0 VQ（韩献忠），Q301 QA（张治国），<.6 =（刘骅）， $’ &%，IKGK 7 W%+%/)3 ,0 *3% *%)30,$,1X ,( ,0%R+*%5 )6$*6/% .0 !#$%%&
’$(#&’&（!360#7）8/%.* 7［S］7 )*# 4(&5’ 6$(7 8(,9-（中草药），$%（II）：F&—FE
Y. S<（戚金亮），@01 P（王忆），P.0 !%&#’ !*3-/% )/++,#（植物生理学通讯），#（J）：CKF—CKG
@0 N<（万美亮），Z3%0 =[（陈宏康），Q3,6 SP（周吉源）， $’ &%，IKK& 7 U*6-.%+ ,0 *.++6% )6$*6/% 0- /5.- 5/,51*.,0 ,(
!#$%%& ’$(#&’&（!360#7）8/%.* 7［S］7 )*#& : )*# 4(&5’ ;$5（中国中药杂志），$%（K）：&CL—&CK
Q301 N（张明），P6 Z（于超），CDDI7 ?%*%/:.0*.,0 ,( *3% $4$,.-+ .0 !#$%%& ’$(#&’$（!360#7）8/%.* 7 O/,: >/.%- /%+ #X \] #+,/5*.,0 +5%)*/,+),5X［S］7 )*/#9<#9 )*# 4(&5’ 6$(7 8(,9- =$-（重庆中草药研究），&：JF—JL Q3, ?V（赵德修），<. NP（李茂寅），CDDD7 ’((%)*+ ,( :%-. ,0 *3% 5/,-6)*.,0 ,( ($>,0,.-+ #X +6+5%0+.,0 )6$*6/%+ ,( 2&,--,($&
+$5,-&［S］7 )*# : 1/’$.*（生物工程学报），’(（I）：KK—IDC
Q3%01 AQ（郑光植），<.01 Q（梁峥），IKEL 7 Z $$6+ )6$*6/%+ ,( 2./>/%& &.,’ ,%& (,/ *3% 5/,-6)*.,0 ,( 3X,+)X:.0% 0- +),5,$R :.0%［S］7 0.’& 1/’ 2#（植物学报），’)（C）：ILJ—ILK Q3%01 UT（郑穗平），A6, P（郭勇），IKKG7 ’((%)*+ ,( +*5$% 06*/.%0* ,0 )%$$ 1/,2*3 0- 0*3,)X0.0 5/,-6)*.,0 .0 +6+5%0+.,0 )6$R *6/% ,( 67-.,- -&75&(??& <7［S］7 @,*&&（广西植物），’)（I）：ED—EF Q36 8Z（朱宝成），@6 ^N（吴爱民），Z3%01 P<（成亚利），$’ &%，IKK& 7 U*6-.%+ ,0 *.++6% )6$*6/% ,( !#$%%& >$5&’-$.’& U)3,**
0- 0$X+.+ ,( .*+ :%-.)$ ),:5,+.*.,0［S］7 0.’& 09(/# 2#（作物学报），$’（F）：FE&—FEG
DLL 云 南 植 物 研 究 CL卷