全 文 ：毛竹竹秆基本组织发育过程中过氧化物酶的超微定位*
于暋芬1,丁雨龙2
**
(1江西农业大学竹子种质资源与利用重点实验室,江西 南昌暋330045;
2南京林业大学竹类研究所,江苏 南京暋210037)
摘要:利用电镜细胞化学技术对毛竹竹秆基本组织发育过程中过氧化物酶进行了细胞化学定位。基本组织
细胞过氧化物酶活性由胞间隙处的胞间层开始逐渐向中间推进,同期过氧化物酶体、内质网等细胞器也具
有酶活性,随后质膜和液泡膜出现酶反应物。次生壁形成期长细胞壁上过氧化物酶高活性主要集中在次生
壁窄层中,以休眠期酶活性最高。随着年龄的增加,长细胞的过氧化物酶活性逐渐降低,九年生长、短细
胞的过氧化物酶活性已很弱。短细胞的酶活性始终高于长细胞,细胞壁、质膜、运输小泡膜和纹孔也都具
有较高的酶活性。短细胞伸长停止与高过氧化物酶活性有关。过氧化物酶分布和活性并不完全对应于木质
素的沉积部位,短细胞的过氧化物酶可能参与了长细胞壁中木质素的合成。
关键词:竹秆;长细胞;短细胞;过氧化物酶;分化;生理功能
中图分类号:Q944暋暋暋 暋暋暋暋文献标识码:A暋暋暋 暋暋暋文章编号:0253灢2700(2010)02灢127灢07
UltracytochemicalLocalizationofPeroxidaseduringthe
GroundTissueDevelopmentinPhylostachys
edulis(Poaceae)Culms
YUFen1,DINGYu灢Long2**
(1JiangxiProvincialKeyLaboratoryforBambooGermplasmResourcesandUtilization,
JiangxiAgriculturalUniversity,Nanchang330045,China;2BambooResearch
Institute,NanjingForestryUniversity,Nanjing210037,China)
Abstract:TheUltracytochemicallocalizationofperoxidaseduringthegroundtissuedevelopmentinbamboo
Phylostachysedulisculmwasstudiedwithcytochemicaltechnology.Intheprimarywaldevelopmentperi灢
od,peroxidaseconcentratedintheintercelularlayerneartheintercelularspace,andthenextendedtoalin灢
tercelularlayer,andatthesametimetheperoxisome,endoplasmicreticulumandmitochondriaalsoshowed
peroxidaseactivity.Afterthatthedistributionofperoxidaseappearedinthetonoplastandplasmamembrane.
Inthesecondarywaldevelopmentperiod,peroxidaseactivitypartialyincreasedinthelongcel walsand
concentratedinthenarrowlamelae,especialyindormancyperiod.Theperoxidaseactivityinthenarrowla灢
melaeofthelongcelwalsdeclinedgradualywithaging,andinnineyearsoldculmtherewaslittleperoxi灢
dasereactiveproductbothinthelongandshortcels.Theshortcelalwayshadhigherperoxidaseactivity
thanthatofthelongcel.Thecelwal,plasmamembrane,transfervesiclesandpitsoftheshortcelhadal灢
soshownhigherperoxidaseactivity.Arelationshipbetweenperoxidaseandthedifferentiationoftheground
tissueinbambooculmswasalsodiscussed.
Keywords:Culm;Longcel;Shortcel;Peroxidase;Differentiation;Physiologicalfunction
云 南 植 物 研 究暋2010,32(2):127~133
ActaBotanicaYunnanica暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋DOI:10灡3724/SP灡J灡1143灡2010灡09191
*
**
基金项目:国家科技支撑计划 (2006BAD19B04)
通讯作者:Authorforcorrespondence;E灢mail:ylding@njfu灡com灡cn
收稿日期:2009灢09灢28,2009灢12灢21接受发表
作者简介:于芬 (1980-)女,讲师,博士,主要从事植物发育和解剖学研究。E灢mail:yufen930@163灡com
暋暋毛竹是特殊的多年生木质草本常绿植物,材
质优良,用途广泛。其竹秆组织成分约52%为
基本组织,参与了各种生理代谢活动。与其他木
本植物不同,竹秆基本组织由长、短两种薄壁细
胞组成。长细胞垂直排列,具有多层、较厚且木
质化的细胞壁,休眠期有淀粉粒贮藏于长细胞内
(Parameswaran and Liese,1975;Liese and
Weiner,1996)。而短细胞较短,散布于其中,
细胞质较浓,细胞壁较薄,仅局部木质化,即使
在老的竹秆内也是如此 (Parameswaranand
Liese,1975,1980;Alvinand Murphy,1988;
He等,2002)。木质素是细胞壁主要组成成分之
一,木质素在细胞壁中的分布对细胞的生长和生
理功能具有重要的影响。过氧化物酶是木质素合
成过程中重要的催化酶。过去有研究曾发现短细
胞的过氧化物酶活性较长细胞高 (Parameswa灢
ranandLiese,1980),但对于过氧化物酶在不同
发育阶段细胞中的分布和活性、过氧化物酶与基
本组织细胞生理功能间的关系却还不是很清楚。
本研究拟通过对竹子基本组织发育过程中过氧化
物酶的超微细胞化学定位研究,为揭示两种基本
组织细胞分化发育机理及其生理功能提供细胞化
学方面的依据。
1暋材料与方法
1灡1暋材料
实验材料为采自于南京林业大学竹类植物园的毛竹
(Phylostachysedulis(Carr.)H.deLehaie),分别选取
不同发育阶段的竹笋和当年生幼竹以及一年生、三、四
年生竹秆。休眠期材料分别采取一、三、四、六和九年
生竹秆。竹笋从上至下连续截取各个节间中部,而当年
生幼竹秆和老竹秆则从竹秆中部的节间中间取材。
1灡2暋方法
取材后迅速将材料切成1mm暳1mm暳1mm左右
的小块投入0灡1mol·L灢1 (pH6灡9)磷酸缓冲液配制的
4%多聚甲醛与2灡5%戊二醛的固定液中,4曟下初固定
20min;用0灡1mol·L灢1 (pH6灡9)磷酸缓冲液配制的
6%的蔗糖漂洗液4曟下漂洗4次,每次15min;0灡1
mol·L灢1 (pH6灡9)磷酸缓冲液配制的5%蔗糖预孵育
液 (pH7灡0),28曟下预孵育15min,然后在每100ml
预孵育液中加入1ml1% H2O2配制的孵育液中于28曟
下孵育1灡5h;后用冷漂洗液漂洗4次,每次10min。
随后再在0灡1mol·L灢1 (pH6灡9)的磷酸缓冲液配制的
1%锇酸固定液中4曟下固定过夜,再用0灡1mol·L灢1
(pH6灡9)的磷酸缓冲液清洗2次,每次20min,重蒸
水清洗3次,每次30min。清洗好的材料经丙酮系列脱
水,Spurr树脂包埋,LKB灢V型超薄切片机切片,切片
不经染色,在 H灢600型透射电镜下观察、拍照。
对照样品处理时,孵育液中不加入 H2O2。
2暋 结果与分析
基本组织细胞发育过程分为初生壁发育期、
次生壁发育期,在生长发育的不同时期,过氧化
物酶的分布及活性都发生相应的变化。
2灡1暋初生壁发育期过氧化物酶活性
基本组织细胞分化前期,仅胞间隙处的胞间
层电子密度最高,过氧化物酶体、线粒体膜、运
输小泡膜、内质网、细胞核也可观察到酶反应物
(图版栺:1)。
随着基本组织细胞的发育和分化,细胞壁加
厚,胞间层的高电子密度范围由胞间隙角隅处逐
渐向中间推进,过氧化物酶活性升高 (图版栺:
2)。质膜和液泡膜上开始出现过氧化物酶活性
(图版栺:3)。
2灡2暋次生壁发育期过氧化物酶活性
在次生壁发育期,毛竹竹秆基本组织过氧化
物酶活性和分布随年龄和生长季节的变化而变化。
一年生毛竹竹秆基本组织在竹子生长旺盛
期,长细胞细胞壁上没有观察到过氧化物酶反应
物,仅短细胞的细胞壁和胞间层具有较高过氧化
物酶活性。过氧化物酶体增加,具有较高酶活
性,这一时期质膜、运输小泡膜、纹孔及一些细
胞器都具有较高的过氧化物酶活性 (图版栺:4、
5)。而在相对休眠期,基本组织过氧化物酶活性
较生长期升高,以长细胞次生壁上的酶活性升高
最为显著,大量酶反应颗粒主要集中在细胞壁窄
层中。长、短细胞内分布有大量的运输小泡,尤
其是在质膜附近,这些小泡膜上可观察到较多的
过氧化物酶反应颗粒。质膜、细胞核、线粒体、
降解物上以及纹孔的过氧化物酶活性升高 (图版
栺:6;图版栻:1)。
三、四年生毛竹竹秆基本组织细胞的过氧化
物酶活性降低。在生长期,短细胞的壁和胞间层
上酶活性较高,过氧化物酶体及膜系统上仍具酶
活性 (图版栻:2、3)。相对休眠期的酶活性较
821暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋云暋南暋植暋物暋研暋究暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋第32卷
生长期的升高,但与一年生竹秆基本组织细胞相
对休眠期的酶活性相比已降低,尤其是长细胞的
细胞壁,过氧化物酶反应物仍主要沉积在近期形
成的窄层中。短细胞壁酶活性仍高于长细胞 (图
版栻:4)。
在休眠期,九年生毛竹竹秆的基本组织长细
胞壁上观察到酶反应物已很少,短细胞壁上的过
氧化物酶活性也显著降低,但电子密度仍高于长
细胞壁 (图版栻:5)。
对照试验中不加 H2O2,没有观察到过氧化
物酶活性的反应物,表明实验结果是可靠的 (图
版栻:6)。
3暋讨论
竹秆基本组织由两种类型的细胞组成是竹子
的一个特点,这两种细胞形态结构之间具有明显
的差异。过氧化物酶是植物细胞内重要的组成成
分,广泛存在于植物体,参与各种生理代谢活
动。研究表明过氧化物酶参与调节植物细胞的伸
长和分化,通过氧化分解IAA、催化木质素形
成从而使细胞分化成熟 (Lee,1977;Christens灢
en等,1998)。过氧化物酶是一种重要的IAA侧
链氧化酶,具有氧化分解吲哚乙酸的功能,能将
促进植物细胞伸长的IAA分解 (Denchevaand
Klisurska,1982,1986),而IAA也抑制过氧化
物酶基因的表达 (KlotzandLagrimini,1996)。
这使过氧化物酶活性与IAA含量呈反相关 (王
英等,1997;Mwange等,2003)。MacAdam 等
(1992)对长酥油草叶伸长区过氧化物酶活性进
行研究时也发现,细胞壁过氧化物酶活性升高后
细胞停止伸长,认为细胞伸展的停止与过氧化物
酶催化的细胞壁连接反应有关。植物组织细胞分
化是以细胞壁失去伸展性为基础的,对于细胞伸
展的停止,过氧化物酶发挥了极其重要的作用,
其作用机制主要包括促进细胞内的IAA分解、
伸展素蛋白质亚单位间产生交联及细胞壁的木质
化 (Fry,1979)。木质素在细胞壁中的沉积,增
加了细胞壁的机械强度,细胞壁的伸展性变得越
来越小,最终细胞停止扩大生长 (MacAdam
等,1992)。毛竹竹秆基本组织短细胞在生长发
育过程中,细胞长度较分化前几乎没有增加,而
且短细胞上的过氧化物酶活性始终高于长细胞。
短细胞停止伸长生长可能与细胞壁上的过氧化物
酶活性相对较高有关。
次生壁形成期长细胞壁上的过氧化物酶活性
局部升高,且主要集中在次生壁窄层中,以进入
秋季相对休眠期之后活性最高。随着秆龄的增加
至三、四年生,长细胞次生壁窄层中的过氧化物
酶活性逐渐降低,至九年生的竹秆基本组织细胞
壁中过氧化物酶活性已很弱或观测不到。竹茎秆
基本组织长细胞次生壁是明暗、宽窄交替分布的
多层结构 (ParameswaranandLiese,1975)。在
春夏季主要合成积累的细胞壁物质为纤维素,而
在相对休眠期主要积累木质素,从而形成宽窄、
明暗不同的壁层。并且基本组织细胞壁在前三至
四年加厚比较明显,之后细胞壁物质合成减少。
在电子显微镜下,木质素具有较大的电子密度,
而纤维素则较低,木质素沉积部位与过氧化物酶
活性部位及时期都是一致的。许多实验证明过氧
化物酶参与了木质素的合成 (Smith等,1994;
Quiroga等,2000;Takabe等,2001;Marjamaa
等,2006),并已经找到木质素合成相关的过氧
化物酶基因 (Tokunaga等,2009),Ipelcl等
(1999)通过抑制杨树的一种过氧化物酶的表达,
使木质素含量下降。我们的研究结果说明长细胞
的细胞壁结合的过氧化物酶参与了长细胞次生壁
木质素沉积过程。
现有的研究结果可知,在次生壁形成期短细
胞壁仅在与长细胞壁连接处发生木质化,而在角
隅处并没有次生加厚,也一直都没有木质素沉积
(He等,2002),而且短细胞的次生壁比较薄,
也没有明暗交替的多层结构 (Parameswaranand
Liese,1975,1980)。而短细胞一直具有较长细
胞高的过氧化物酶活性,其细胞壁上的过氧化物
酶活性在与长细胞连接处和角隅处都比较高。短
细胞上的过氧化物酶并不完全对应于木质素的沉
积部位。在毛白杨形成层活动周期中过氧化物酶
同工酶的变化研究也发现,次生壁中木质素的沉
积位置并不是与过氧化物酶活性位置密切相关,
认为可能是由于不同时期和不同位置分布的过氧
化物酶具有不同功能的同工酶组份 (殷亚方和姜
笑梅,2007)。反映一种木素过氧化物酶同工酶
是否有合成木素的能力有4个参数:对木素单体
底物的专一性、酶初级结构、酶在细胞中的位
9212期暋暋暋暋暋暋暋于暋芬和丁雨龙:毛竹竹秆基本组织发育过程中过氧化物酶的超微定位暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋
置、酶活性大小和木素合成的时间偶联性
(LewisandYamamoto,1990)。因此,不能将
细胞分化过程中细胞壁上木质素的沉积位置与过
氧化物酶的分布简单地对应起来。过氧化物酶是
在粗面内质网上合成,经高尔基体糖基化后,通
过运输小泡与质膜融合运输至特定位置 (Tak灢
abe等,2001)。基本组织细胞次生壁的木质素主
要在秋冬季节形成沉积,而相对休眠期的长细胞
生理代谢较弱,短细胞具有较浓的细胞质和明显
的细胞核 (AlvinandMurphy,1988),并且短
细胞内可观察到存在较多的运输小泡,短细胞的
细胞壁和内质网、线粒体、质膜、运输小泡膜以
及纹孔都具有较高的过氧化物酶活性,尤其是膜
质系统的酶活性与长细胞壁中木质素的沉积时间
一致。由此表明短细胞可能在长细胞次生壁木质
素的合成过程中发挥了重要的作用。
暡参暋考暋文暋献暢
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图暋版暋说暋明
A.淀粉体;CW.细胞壁;Dg.降解物;ER.内质网;ICL.胞
间层;IS.胞间隙;LC.长细胞;LCW.长细胞的壁;M.线粒
体;N.细胞核;P.纹孔;SC.短细胞;SCW.短细胞的壁;
TV.运输小泡;V.液泡
图版栺:1~3.初生壁形成期基本组织细胞过氧化物酶活性:
1.基本分生组织细胞过氧化物酶活性,角隅处的胞间层酶活性
最高;2.示胞间层酶活性升高;3.质膜和液泡膜开始出现酶反
应颗粒;4.生长期一年生长细胞和胞间层的过氧化物酶活性;5.
生长期一年生短细胞壁活性较高;6.相对休眠期一年生长细胞的
过氧化物酶活性升高,细胞壁窄层中分布有大量的酶反应物。
图版栻:1.示相对休眠期一年生短细胞的过氧化物酶活性;2、
3.生长期三、四年生基本组织细胞的过氧化物酶活性:2.长细
胞的过氧化物酶活性;3.示短细胞的酶活性;4.相对休眠期
三、四年生基本组织长、短细胞的过氧化物酶活性;5.九年生
基本组织细胞过氧化物酶活性。6.对照,没有观察到过氧化物
酶反应颗粒。
ExplanationofPlates
A.amyloplast;CW.cel wal;Dg.degradating;ER.endo灢
plasmicreticulum;ICL.intercelularlayer;IS.intercelular
space;LC.longcel;LCW.longcel wal;M.mitochondia;
N.nucleus;P.pit;SC.shortcel;SCW.shortcelwal;TV.
transfervesicles;V.vacoule.
Plate栺:1-3.Peroxidasedistributioningroundtissueinprima灢
rywalperiod:1.Peroxidasedistributioningroundmeristem;2.
Showingtheriseofperoxidaseactivityinintercelularlayer;3.
Peroxidasedistributionappearedinthetonoplastandplasma
membrane;4.Showingperoxidasedistributioninoneyearold
longcelsandtheintercelularlayeringrowingperiod;5.Show灢
inghighperoxidaseactivityinoneyearoldshortcelsingrowing
period;6.Peroxidasedistributioninoneyearoldlongcelsin
dormancyperiod,amassofperoxidasereactingsubstance.
Plate栻:1.Peroxidaseactivityinoneyearoldshortcelsindor灢
mancyperiod;2,3.Showingperoxidasedistributioninthreeor
fouryearsoldgroundtissuecelsingrowingperiod:2.Showing
peroxidasedistributioninthreeorfouryearsoldlongcelsin
growingperiod;3.Peroxidasedistributionintheshortcel;4.
Peroxidaseactivityinthreeorfour灢year灢oldgroundtissuecelsin
dormancyperiod;5.Peroxidasedistributionin nine灢year灢old
groundtissuecels;6.Controlexperiment,showingnoperoxi灢
dasereactingsubstance.
1312期暋暋暋暋暋暋暋于暋芬和丁雨龙:毛竹竹秆基本组织发育过程中过氧化物酶的超微定位暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋
暋暋于暋芬等:图版栺暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋YUFenetal灡:Plate栺
231暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋云暋南暋植暋物暋研暋究暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋第32卷
暋暋于暋芬等:图版栻暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋YUFenetal灡:Plate栻
3312期暋暋暋暋暋暋暋于暋芬和丁雨龙:毛竹竹秆基本组织发育过程中过氧化物酶的超微定位暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋