全 文 ：几种兰花种子无菌萌发及胚胎发育过程的几种途径?
王卜琼1 , 李枝林1
??
, 刘国民2 , 钱慧生3 , 余朝秀1
(1 云南农业大学 , 云南 昆明 650201; 2 海南大学 , 海南 海口 570228;
3 云南城镇建设工程设计有限公司 , 云南 昆明 650224 )
摘要 : 以虎头兰 (黄色素花 ) ×大雪兰、大雪兰×虎头兰 (黄色素花 )、虎头兰 (黄色素花 ) ×黄蝉兰、黄
蝉兰×虎头兰 (黄色素花)、冬凤兰、竹叶兰、窄唇蜘蛛兰、半柱毛兰、三褶虾脊兰和多花脆兰为材料 ,
进行了杂交和自交种子无菌培养研究 , 并对胚胎发育进行了显微观察 , 结果表明 : 兰花种胚的发育途径有
两条 , 一是种胚突破种皮后再转绿 ; 二是种胚转绿后再突破种皮 , 且两条途径是同时进行的。种胚突破种
皮的方式有 3 种 : 一是种子发育过程中 , 种皮慢慢消失 , 变成裸露的胚 ; 二是种胚向种子的一端移动 , 最
终突破种皮 ; 三是种胚从种子的一侧突破种皮 , 形成裸胚。幼苗的发育途径有两条 : 一是小球体经圆球茎
发育成小苗 ; 二是小球体伸长成根茎后发育成小苗。
关键词 : 兰花 ; 种子 ; 无菌培养 ; 胚胎学
中图分类号 : Q 945 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700(2006)04 - 399 - 04
Study on Seeds Aseptic Culture and Embryo Growth
Routes of Several Orchid
WANG Bu-Qiong
1
, LI Zhi-Lin
1 **
, LIU Guo-Min
2
, QIAN Hui-Sheng
3
, YU Chao-Xiu
1
( 1 Yunnan AgricultureUniversity, Kunming 650201 , China; 2 Hainan University, Haikou 570228 , China;
3 Yunnan Town Construction and Engineering Design, Ltd . Kunming 650224 , China)
Abstract : Microexamination were carried out onthe embryo growth of the seeds of theorchids of Cymbidiumhookerianum
× C. mastersii、 C. mastersii × C. hookerianum、 C. hookerianum× C. iridioides、 C. iridioides× C. hookerianum、
C. dayanum、Arundina graminifolia、 Arachnis labrosa、 Eria corneri、 Calanthe triplicate and Acampe multiflora . We
havefoundtherewere two routesfor theembryogrowths, carryingthrough at the sametime . Oneof the routewas the em-
bryobecome greenafter breakingthrough the seed coat, theother was theembryo turned green before breakingthrough the
seed coat . We also discovered that embryo broke through the seed coat through three ways: (1 ) the embryo becomes a
bare embryo becausethe seed coat disappears in growth; (2) the embryo breaks through the seed coat from oneaspect of
the seed; (3) the embryo breaks through the seed coat from profile, then it becomes a bare embryo . The globules grew
into seedlings in two ways: (1) The globules grew into seedlings through their protocorms . (2 ) The globules grew first
into rhizome, then into seedlings .
Key words: Orchid; Seed; Aseptic culture; Embryo growth
在细胞水平对杂交亲本进行遗传学分析对兰
花育种的亲本选择具有重要意义。日本学者 Tan-
aka 在 1971 年提出根据细胞分裂静止期 (间期核 )
的形态相似性可以预测兰花杂交亲本亲和力的理
论 , 他的这一理论在兰花育种的实践中得到较为
广泛的认可。在我国丰富的兰科植物中 , 被研究
云 南 植 物 研 究 2006 , 28 (4) : 399～402
Acta Botanica Yunnanica

?
?? ?通讯作者 : Author for correspondence . E - mail : LZL-YN@ sohu. com
收稿日期 : 2005 - 10 - 25 , 2006 - 02 - 14 接受发表
作者简介 : 王卜琼 (1981 - ) 女 , 硕士 , 主要从事植物形态学研究。 ?
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (3060074) ; 云南省自然科学基金重点项目 (2002C003P)
过胚胎发育的种共有 100 多个 , 其中兰属只有 2～
3 种 (吴应祥 , 1994)。通过对兰花自交和杂交种
子的结构、胚的发育、种子萌发过程中植株的形
态发生进行显微观察 , 从胚胎学水平了解兰花各
种间的亲缘关系 , 为兰花种子无菌萌发提供参
考 , 也为选择合适的杂交亲本提供科学依据。
1 材料与方法
1 .1 材料
供试材料为虎头兰 (黄色素花 ) ( Cymbidiumhookeri-
anumRchb . f .) ×大雪兰 ( C. mastersii Griff .)、大雪兰×
虎头兰 (黄色素花 )、虎头兰 ( 黄色素花 ) ×黄蝉兰
( C. iridioides D . Don)、黄蝉兰×虎头兰 (黄色素花 )、
冬凤兰 ( C. dayanum Rchb . f )、竹叶兰 ( Arundina gra-
minifolia (D . Don) Hochr .)、窄唇蜘蛛兰 ( Arachnis labrosa
(Lindl .) Rchb . f)、半柱毛兰 ( Eria corneri Rchb . f)、三
褶虾脊兰 ( Calanthetriplicata (Willem .) Ames)、多花脆兰
( Acampe multiflora) 的成熟蒴果 , 前 4 个杂交种蒴果由云
南农业大学花卉研究所提供 , 后 6 种为野生兰花蒴果。
1 .2 方法
1 .2 .1 种子无菌培养 中间繁殖体的诱导 : 取兰花杂交
和自交的蒴果 , 用 75% 的酒精擦洗干净 , 放入装有 5%
洗洁精溶液的培养瓶中充分摇洗后用自来水冲洗干净。
沥干水后 , 用 75 %的酒精消毒 5 min, 再用 0 .2 %的升汞
灭菌 15 min, 无菌水冲洗 4 次 , 取其内部种子接种到初
代培养基上培养。其培养基为 : 1?2MS + 肌醇 100 mg?L +
烟酸 0 .5 mg?L + 盐酸硫胺素 2 .0 mg?L + 盐酸吡哆素 1 .0
mg?L + 甘氨酸 2 .0 mg?L + 6-BA 1 .0～3.0 mg?L + NAA 0 .5～
2 .0 mg?L + 蔗糖 2 .5% + 琼脂粉 0 .8 % ; pH 5 .8。培养条件
为 (25±2)℃ , 日光灯照明 , 光照强度约为 1 500 lx, 每
天 11 h光照。
中间繁殖体继代培养 : 将种子萌发后形成的原球茎
转移到继代培养基上。其成分为 : MS (1?2MS; 1?3 MS;
H 大量元素 + MS微量元素 ; SJ-1 ) + 肌醇 100 mg?L + 烟酸
0 .5 mg?L + 盐酸硫胺素 2.0 mg?L + 盐酸吡哆素 1 .0 mg?L +
甘氨酸 2 .0 mg?L + NAA 0 .5～1 .0 mg?L + 蔗糖 2 .5% + 琼脂
粉 1 .2% + AC 0 .1% + 香蕉泥 10 % ; pH 6 .0。培养条件与
中间繁殖体的诱导相同。
褐化材料的处理 : 容易褐化的兰花种子采用 3 种方
法进行处理 , (1) 将褐化种子转接到含有抗氧化剂的液
体培养基上振荡培养一段时间后再转移到固体培养基上
培养 ; (2) 直接将容易褐化的兰花种子接种到含有抗氧
化剂的培养基上培养 ; ( 3) 将容易褐化的兰花种子直接
接种到含有抗氧化剂的液体培养基上用摇床培养 , 该培
养基为 : 1?2MS+ 肌醇 100 mg?L + 烟酸 0 .5 mg?L + 盐酸硫
胺素 2 .0 mg?L + 盐酸吡哆素 1.0 mg?L + 甘氨酸 2 .0 mg?L +
6-BA 1 .0～3 .0 mg?L + NAA 0 .5～1 .0 mg?L + 蔗糖 2 .5% +
PVP 0 .02% + Vc 20 mg?L ; pH 5 .8 , 在 60 r?min的摇床上培
养 20 d后转接到固体培养基上培养 , 培养基为 : 1?2MS
+ 肌醇 100 mg?L + 烟酸 0 .5 mg?L + 盐酸硫胺素 2 .0 mg?L +
盐酸吡哆素 1 .0 mg?L + 甘氨酸 2 .0 mg?L + 6-BA 1 .0～ 5 .0
mg?L + NAA 0 .5～1 .0 mg?L + 蔗糖 2 .5% + PVP 0 .02% + Vc
20 mg?L ; pH 5.8。上述培养基中加入的抗氧化剂属于热
分解化合物溶液 , 不耐高温灭菌 , 故采用过滤灭菌法进
行灭菌 , 在无菌环境下 , 溶液先用 0 .65μm的滤膜进行
初滤 , 然后再用已消毒的 0.45μm的滤膜过滤器过滤 ,
将滤液加到高压灭菌后的培养基中。
1 .2 .2 离体培养过程中 , 未接种的种子取样一次 , 以后
每隔 7 d取一次样 , 进行种胚及幼苗的发育动态观察。
所取样用醋酸洋红染色制片 , 在 Motic B5 数码生物显微
镜上进行观察 , 并用电脑拍照保存图片资料。当胚突破
并脱离种皮形成原球茎后 , 改用 Motic 数码体视显微镜
观察 , 并拍照保存。
2 结果与分析
2 .1 种胚的发育过程
供试兰花种子的颜色为乳白色 , 其形态和大
小各异 , 种子具有透明、无色的种皮。种皮内含
有大量的空气 ( 吴应祥 , 1994) , 不易吸收水分 ,
易于随风和水流传播。种子呈纺锤形 , 种子无胚
乳 , 只有胚。包裹胚的种皮只有一层细胞构成。
种皮细胞的周壁很厚 , 相互连接 , 连接处略凸起 ,
有时会产生貌似刺状的外观。种皮细胞的细胞壁
有纵横交错的条纹。种皮有薄有厚。兰花种子的
胚具有分化不完全的特点 , 有的只是一团未分化
的胚细胞。兰花种子几乎没有贮藏营养物质 , 而
且种子也未发现有贮藏营养物质的组织。所以在
自然条件下很难萌发 , 并且幼苗生长缓慢。
在虎头兰 (黄色素花 ) ×大雪兰、大雪兰×虎
头兰 (黄色素花 ) 和虎头兰 (黄色素花 ) ×黄蝉兰
的杂交种子萌发过程观察到非常严重的褐化现象 ,
在进行褐化材料处理过程中发现 , 在培养基中加入
PVP和 Vc对褐化种子效果不明显 , 但液体振荡培
养对解决褐化问题效果显著。其次 , 褐化程度很
严重的材料 , 在没有进行任何处理的条件下 , 也
有部分能够萌发。具体原因有待于进一步研究。
种子接种到初代培养基上后 , 开始吸水膨胀 ,
种胚和种皮都不断胀大。在这一过程中 , 胚的发
004 云 南 植 物 研 究 28 卷
育途径也不完全一致 , 主要有两种方式 : 一种是
在胚还未转绿时就突破种皮 (图 1: a) , 虎头兰
(黄色素花 ) ×大雪兰和窄唇蜘蛛兰种胚主要以该
途径发育。但窄唇蜘蛛兰突破种皮的胚发育到一
定阶段就停止生长 , 未发育成转绿的小球体; 另
一种是胚转绿后再突破种皮 , 形成原球茎 (图 1:
b) , 大雪兰×虎头兰 (黄色素花 )、虎头兰 (黄色
素花 ) ×黄蝉兰、黄蝉兰×虎头兰 (黄色素花 )、
冬凤兰、竹叶兰和多花脆兰则主要遵循该发育途
径。在种子的发育过程中 , 胚的发育以其中一种
为主导 , 其中少数种胚以另一发育途径同时进行。
所有的供试材料中 , 半柱毛兰和三褶虾脊兰的种
胚没有转绿 , 也没有突破种皮 , 生长发育到一定
阶段后就停止生长 , 出现这种现象的原因可能是
提供的培养基不适合 , 也可能是培养的时间不够。
不同种的种子其形态学结构及发育方式差异很大 ,
不同属间的差异更大 , 可作为分类学上的依据之
一。如窄唇蜘蛛兰的胚所占种子的体积比较大 ,
约 3?4 , 而其他几个种的体积比就小很多 ; 窄唇蜘
蛛兰和半柱毛兰的胚是长柱形的 , 而其他几个种
的胚是圆球形或椭圆形的; 其次种子的形状及大
小的区别也很显著。4 个杂交种的种子最大 , 种
子的种宽与种长比明显大于其他几个自交种 , 其
中以虎头兰 (黄素 ) 为母本的杂交种子的种宽与
种长比小于以虎头兰 (黄素 ) 为父本的杂交种子。
冬凤兰种子的形状是典型的纺锤形 , 其种胚非常
小 , 大约是种子的 1?6, 竹叶兰的种子也是纺锤
形 , 但种子及胚都明显比冬凤兰大 , 其次冬凤兰
的胚是原球形 , 竹叶兰的胚是椭圆形 , 两者在种
子形态上很容易区别 , 三褶虾脊兰种子非常长 ,
在 10 倍物镜的视野中常常看不到一个完整的种
子 , 并且种子质地脆弱 , 很容易折断。
图 1 a . 种胚未转绿就突破种皮 ; b . 种胚转绿后再突破种皮 ; c . 粘连有种皮的裸胚 ; d . 种胚从种子的一端突破种皮 ;
e . 种胚从种子的一侧突破种皮 ; f . 裸胚及指状突起物 ; g . 丝状体 ; h . 双胚种子 ; i . 原球茎途径 ; j . 根状茎途径
Fig . 1 a . seeds that embryo becamegreen after breaking through the seed coat; b . seeds that embryo turned green before breaking through the
seed coat; c . naked embryo with little seed coat; d . seeds that embryo breaks through the seed coat from one aspect; e . seeds that embryo
breaks through the seed coat from profile; f . naked embryo and digitatevesicula aerifera; g . protonema; h . two embryos seed;
i . growth way from protocorm; j . growth way from rhizome
培养过程中 , 种胚突破种皮的方式也有差
异。窄唇蜘蛛兰的种皮逐渐消失 , 变成裸露的
胚 , 胚转绿时 , 还能观察到少数胚粘连有种皮
(图 1: c) ; 黄蝉兰×虎头兰杂交种的胚在培养
过程中 , 向种子的某一端移动 , 然后从种子的一
端突破种皮形成裸胚 ( 图 1: d) ; 虎头兰×黄蝉
兰、虎头兰×大雪兰、大雪兰×虎头兰、竹叶
兰、半柱毛兰的胚则是从种子的一侧突破种皮的
1044 期 王卜琼等 : 几种兰花种子无菌萌发及胚胎发育过程的几种途径
(图 1: e) , 种胚形成小球体时 , 还能观察到多
数粘连有种皮。在这几种种子发育形成的原球茎
上都能观察到指状突起物 ( 图 1: f) , 这可能与
种子萌发过程中 , 根毛的形成有关。4 组杂交种
种子接种 2 周后观察到从胚柄处长出丝状体 (图
1: g) , 从种子的顶端伸出 , 随着种胚的发育转
绿 , 丝状体消失。
在虎头兰与黄蝉兰互为父母本的杂交蒴果中
观察到双胚种子 ( 图 1: h) , 但比例很小。黄蝉
兰×虎头兰杂交蒴果中的双胚种子是虎头兰×黄
蝉兰杂交蒴果中的双胚种子的 2～3 倍。两个胚
在种子中的位置没有规律性 , 多数双胚种子中两
个胚的大小相差不大。出现这种双胚现象 , 是由
于合子胚在发育过程中 , 又分裂成两部分 , 每一
部分又独立发育成胚。
2 .2 幼苗的发育过程
种胚转绿后 , 3 周左右可长到油菜籽大小成
为小 球 体 , 然 后 发 育 成 小 苗 , 这 与 罗 士 伟
(1988) 和 Rao ( 1977 ) 报道的结果基本一致。不
同种的小球体形成所需时间差异也很大 , 培养 2
周可以肉眼观察到竹叶兰转绿的小球体 , 窄唇蜘
蛛兰在显微镜下能观察到 90%的裸胚 , 半柱毛兰、
三褶虾脊兰和冬凤兰没有明显变化 , 其余 6 个种
也能观察到突破种皮的胚。培养 3 周后可以观察
到冬凤兰的胚开始转绿 , 但没突破种皮。培养 40
～45 d后肉眼可以观察到 4 个杂交种及多花脆兰
已形成小球体。小球体以两条途径发育成小苗:
一是原球茎途径 , 即在小球体顶端长出第一片叶 ,
同时小球体增大成圆球茎 , 随后第二、三片叶长
出 , 圆球茎伸长 , 基部长出根来 , 形成完整的植
株 (图 1: i )。虎头兰 ( 黄色素花 )×大雪兰、大
雪兰×虎头兰 ( 黄色素花 )、虎头兰 (黄色素花 )
×黄蝉兰、黄蝉兰×虎头兰 (黄色素花 )、冬凤兰
以及多花脆兰的种胚形成的小球体是以该途径发
育成小苗的 ; 二是根状茎途径 , 该途径的小球体
先形成根茎 , 在根茎顶端分化出芽 , 形成叶 , 根
茎的下部分化出根形成完整的植株 (图 1: j )。竹
叶兰的种胚则是以根状茎途径形成小苗。
3 讨论
兰花杂交亲和性主要取决于杂交亲本的亲缘
关系 , 亲缘关系较远的杂交不易成功。目前 , 我
们可以从形态学及分子水平上对兰花进行分类 ,
以确定不同种间的亲缘关系。以形态特征作为分
类依据时 , 我们发现 , 同属、同种的某些特征性
状在不同地区或在同一地区因生态环境不同变化
很大 , 这给我们选择杂交亲本带来了很大麻烦。
在分子水平上 , 物种的遗传物质是相对稳定的 ,
受环境因素的影响较小 , 可靠性较高 , 但目前兰
科植物中做过分子鉴定的种、属很少。前人对兰
花胚胎学的研究也不是很多 , 目前大约有一百多
种兰花做过胚胎学研究 , 不同物种的显微结构差
异显著 (从所做实验可以看出 )。胚胎学研究受
外界环境的影响较小 , 且费用不高 , 作为分类的
依据之一 , 是比较经济和科学的。在兰花杂交育
种过程中 , 选择杂交亲本时 , 应从多个角度来考
证亲本间的亲缘关系 , 以确保杂交组合的成功。
兰花种子在无菌培养萌发过程中的形态发生
也存在差异。附生兰的种子萌发初始 , 形成白色
的圆球形的原球茎。随着原球茎体积的增大 , 其
上出现毛状假根 , 继而原球茎体转为绿色 , 但原
球茎不伸长 , 在原球茎顶端出现芽 , 长大分化出
茎和叶。地生兰的种子萌发时 , 种子中的胚突破种
皮后 , 开始呈白色圆球形 , 但很快就伸长 , 形成长
柱形 , 成为地下茎或根状茎。在根状茎表面有间隔
地长出一丛丛毛状假根 , 根状茎的顶芽分化出芽。
小球体以两种途径发育成幼苗 , 这和杨宁生 (1994)
报道的结果基本一致。兰花胚及幼苗发育的深层
研究 , 可以为兰花的组织培养中选择合适的培养
基提供参考。但对兰花胚胎学及种子发育的微观
研究 , 目前所做的工作很少。尤其是杂交种子以
及亲本自交种子的系统研究 , 它将为杂交育种以
及种子无菌培养提供细胞水平的参考。
〔参 考 文 献〕
吴应 ?祥 , 1994 . 第 2 版 . 中国兰花 [M] . 北京 : 中国林业出版社
罗士 ?伟等 , 1988 . 经济植株组织培养 [M ] . 北京 : 科学出版社 ,
170—175
Rao ?AN , 1977 . Tissue culture in the Orchid industry [ A ] . In: J .
Reinert, Y . P . S . Bajaj , Applied and Fundamental Aspects of
Plant Cell , Tissue and Organ Culture [ M ] . Berlin-Heidelberg,
New York : Springer-Verlang, 52—58
Yang ?NS (杨宁 生 ) , Yang BY ( 杨 柏云 ) , Zhong QP ( 钟青 萍 ) ,
1994 . Study on seed aseptic culture of Cymbidium faberi Rolfe
[ J ] . J iangxi Science (江西科学 ) , 12 (2 ) : 80—84
204 云 南 植 物 研 究 28 卷