全 文 ： 叶绿体系统发育基因组学的研究进展*
张韵洁, 李德铢**
(中国科学院昆明植物研究所生物多样性与生物地理学重点实验室, 云南 昆明摇 650201)
摘要: 系统发育基因组学是由系统发育研究和基因组学相结合产生的一门崭新的交叉学科。 近年来, 在植
物系统发育研究中, 基于叶绿体基因组的系统发育基因组学研究优势渐显端倪, 为一些分类困难类群的系
统学问题提出了解决方案, 但同时也存在某些问题。 本文结合近年来叶绿体系统发育基因组学研究中的一
些典型实例, 讨论了叶绿体系统发育基因组学在植物系统关系重建中的价值和应用前景, 并针对其存在问
题进行了探讨, 其中也涉及了新一代测序技术对叶绿体系统发育基因组学的影响。
关键词: 系统发育基因组学; 叶绿体基因组; 新一代测序技术; 长枝吸引
中图分类号: Q 75, Q 949摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2011)04-365-11
Advances in Phylogenomics Based on Complete Chloroplast Genomes
ZHANG Yun鄄Jie, LI De鄄Zhu**
(Key Laboratory of Biodiversity and Biogeography, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650201, China)
Abstract: Phylogenomics is a new synthesized discipline which combines genomics with phylogenetics. Phylogenom鄄
ics based on chloroplast genomes has shown many great advantages in plant phylogenetic research in recent years,
providing resolutions for phylogeny of some taxonomically difficult groups of plants. However, there are some prob鄄
lems coming along with chloroplast phylogenomics as well. In this review, the application prospects and potential
problems of chloroplast phylogenomics in plant phylogenetic reconstruction were discussed based on recent phylog鄄
enomic case studies. The influence of next鄄generation sequencing on chloroplast phylogenomics was also discussed.
Key words: Phylogenomics; Chloroplast genome; Next鄄generation sequencing; Long鄄branch attraction
摇 地球上的生命形式多种多样, 它们因有着
共同的进化历史而有着或近或远的渊源。 正确理
解不同生物类群之间的关系不仅是进化生物学研
究的前提, 生物分类和命名的依据, 而且也是开
展生物学其它分支学科研究的基础。 因而构建可
靠的系统发育树 (即将各生物类群之间的关系形
象地以树的形式描绘出来) 不仅是系统发育研
究的重点, 也是生物学研究的重要内容之一。 早
期系统发育学家通过对化石记录、 比较形态学和
比较生理学的研究, 构建出了物种进化历史的主
要框架 (Nei 和 Kumar, 2000)。 20 世纪 80 年代
以后, 随着分子生物学的快速发展, 系统发育研
究开始由比较形态学转向分子系统学研究领域,
即利用生物大分子 (如 DNA 序列、 氨基酸序列
等) 所提供的信息来推断生物的进化历史 (Li和
Olmstead, 1997; Nei 和 Kumar, 2000; 田欣和李
德铢, 2002)。 分子系统学研究的出现使我们对
生命进化过程有了更深刻的认识。 然而随着分子
证据的不断积累, 基于不同分子片段对同一类群
所进行的分子系统学研究结果之间存在的差异,
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2011, 33 (4): 365 ~ 375
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 3724 / SP. J. 1143. 2011. 10202
*
**
基金项目: 中国科学院现代农业科技创新基地重要方向性项目 “重要野生禾本科植物的比较基因组学和重要功能基因的研究
(KSCX2鄄YW鄄N鄄029)冶
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: dzl@ mail. kib. ac. cn
收稿日期: 2010-11-15, 2010-12-01 接受发表
作者简介: 张韵洁 (1984-) 女, 在读硕士研究生, 主要从事植物系统发育基因组学研究。
也使人们逐渐认识到基因树虽然在一定程度能反
映物种的进化历史, 却不能等同于物种树 (de
Queiroz等, 1995; Wendel 和 Doyle, 1998)。 因此,
越来越多的学者试图将来自不同基因组 (如核基
因组、 线粒体基因组或叶绿体基因组) 和具有不
同功能的分子片段相结合, 或与形态学性状联合
起来进行分析。 虽然研究方法有所不同, 但系统
发育学家所做的努力最终目的只有一个, 即构建
能反映物种真实进化关系的可靠的系统发育树。
随着测序技术的日益完善, 越来越多的基因
组序列得到解析, 系统发育研究进入了一个崭新
的时代———系统发育基因组学时代。 系统发育基
因组学是进化生物学领域里由系统发育学和基因
组学结合形成的一门崭新的交叉学科 ( Eisen,
1998; Eisen和 Hanawalt, 1999)。 系统发育基因
组学的研究是围绕着系统发育学和基因组学展开
的, 主要研究内容包括在基因组水平上用大规模
的分子数据研究生物之间的系统发育关系以及利
用进化关系反过来研究基因组的进化机制 (如
DNA修复过程, 未知基因的功能注释等) (Eisen,
1998; Eisen和 Hanawalt, 1999; Delsuc等, 2005)。
在植物中由于核基因组的复杂性使得单拷贝
(或低拷贝) 基因的筛选比较困难, 而对植物核
基因组的测序工作目前仅局限在基因组相对较小
的模式物种或具有重要经济或生态价值的物种
中, 如拟南芥、 水稻、 高粱、 黄瓜等, 因此基于
大规模核基因的植物系统发育基因组学的发展相
对滞后。 而植物线粒体基因组具有的很多特性使
其在系统发育研究中的应用受到了限制, 如线粒
体基因组大小在各植物类群中变异很大 (大多数
被子植物线粒体基因组大小在 300 ~ 600 kb), 且
基因组中存在很多由基因组之间水平转移造成的
外源基因插入 (Palmer, 1992); 线粒体基因组进
化速率较慢, 其核苷酸替换率比叶绿体基因组慢
4 倍, 但在其基因组中却广泛存在分子内重组
( intramolecular recombination) 现象 ( Palmer 和
Herbon, 1988; Lonsdale 等, 1988)。 因此, 在植
物中, 线粒体基因组一般情况下不是系统发育基
因组学研究的理想资源。 植物叶绿体基因组序列
具有很多优点, 使之被广泛应用于分子进化及系
统发育研究。 首先, 叶绿体基因组包含大量的遗
传信息, 为比较研究提供了一个较大的数据基
础。 其次, 叶绿体 DNA 的核苷酸置换率适中,
在应用上很有价值。 叶绿体基因组的编码区和非
编码区的分子进化速度差异显著, 分别适用于不
同阶层的系统学研究 (Clegg 等, 1994)。 除此以
外, 叶绿体基因组大小适中, 便于测序, 且各植
物类群叶绿体基因组之间具有良好的共线性, 便
于比较分析。 因此, 近年来基于叶绿体基因组的
系统发育基因组学得到了较快的发展。 到 2010
年 10 月为止, 在 NCBI 数据库中收录的叶绿体
基因组已达 146 个, 其中 19 个为藻类, 其余均
为陆生植物, 为系统发育研究提供了大量可用的
数据。 本文拟结合研究中的具体例子, 探讨叶绿
体系统发育基因组学在植物系统发育重建中的应
用价值、 存在的优势和问题以及新一代测序技术
对叶绿体系统发育基因组学发展的促进作用。
1摇 叶绿体基因组的结构与功能
叶绿体是与光合作用直接相关的细胞器, 其
基因组的功能也跟光合作用密不可分, 一般认为
叶绿体是由蓝细菌通过内共生起源的。 叶绿体作
为植物细胞中一个独立的细胞器, 拥有自己的一
套完整的基因组。 它在在裸子植物中一般为父系
遗传, 而在被子植物中多为母系遗传。 双亲遗传
的现象较为罕见, 在被子植物中约占 14% (Cor鄄
riveau和 Coleman, 1988)。 叶绿体基因组一般为
共价闭合环状 DNA, 在细胞中以多拷贝的形式
存在, 高等植物的叶绿体基因组具有高度保守的
四分体结构 ( Jansen 等, 2005), 即由两个反向
重复序列 ( inverted repeat sequence, IR) 将整个
环状的叶绿体基因组分为大单拷贝区 ( large sin鄄
gle copy, LSC) 和小单拷贝区 (small single copy,
SSC)。 也有少数植物如豆科的地三叶草 (Trifoli鄄
um subterraneum)、 蒺藜苜蓿 (Medicago truncatu鄄
la) 和鹰嘴豆 (Cicer arietinum) 因一个反向重复
区完全丢失而具有特殊的叶绿体基因组结构
(Cai等, 2008)。 叶绿体基因组大小一般在 115
~ 165 kb范围内, 基因组大小变异主要受反向重
复区长度变异影响。 叶绿体中绝大多数蛋白复合
体是由核基因组和叶绿体基因组共同编码的。 叶
绿体基因组约编码 110 ~ 130 个基因, 这些基因
主要可分为三大类: 第一类是那些涉及叶绿体基
因表达的基因, 包括编码叶绿体 RNA 聚合酶三
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个亚基、 核糖体 RNA、 转运 RNA、 核蛋白体蛋
白及翻译起始蛋白等产物的基因; 第二类基因是
那些与光合作用有关的基因, 如 Rubisco 大亚基
基因, 光合电子传递链中各蛋白复合体 (PS玉,
PS域, 细胞色素复合体, ATP合成酶) 的几个亚
基基因等; 第三类包括据推测为 NADH 脱氢酶
各个亚基的基因和开放阅读框架, 它们的功能目
前尚待查明。 陆生植物的叶绿体基因组在基因数
目及基因排列顺序上相对保守, 但一些类群的叶
绿体基因组也具有其独特的特征, 使其与其它植
物区分开来。 如松属植物叶绿体基因组的 ndh基
因家族全部丢失 (Wakasugi 等, 1994), 而列当
科寄生植物 Epifagus virginiana 的叶绿体基因组
仅包含 42 个基因, 丢失了与光合作用和叶绿体
呼吸作用有关的所有基因以及叶绿体编码的
RNA聚合酶基因 (Wolfe等, 1992)。
2摇 叶绿体基因组在植物系统发育研究中
的应用及优势
系统发育基因组学中所涉及的研究方法主要
包括: (1) 基于序列分析的方法, 该方法与传统
分子系统学研究方法一致, 因而被广泛应用。
(2) 基于非序列的分析方法, 主要包括全基因组
特征分析 (whole鄄genome features, WGFs), 即对
基因组成成分, 基因排列顺序及寡核苷酸串在基
因组中排布方式等的分析; 稀有基因组变异
(Rare genomic changes, RGCs), 如插入缺失,
内含子的有无, 转座子插入, 基因的融合和断裂
等事件, 这些稀有基因组变异可用于一些节点的
支持, 也可根据他们的有无构建系统树 (Delsuc
等, 2005; 于黎和张亚平, 2006)。 叶绿体系统发
育基因组学属于系统发育基因组学的范畴, 因此
它的研究方法同系统发育基因组学研究方法一致。
2. 1摇 非序列分析方法
藻类植物的叶绿体基因组常发生基因组重
排、 基因含量和结构等变化, 因此非序列分析方
法多用于藻类植物的叶绿体系统发育基因组学研
究。 如利用基因组结构、 基因含量及基因排列顺
序推断原始绿藻 Mesostigma viride 和轮藻类的
Chlorokybus atmophyticus 在绿色植物界 ( Viri鄄
diplantae) 的系统位置 (Lemieux等, 2007) 或是
利用叶绿体基因组中的基因丢失情况研究叶绿体
在整个植物界中的进化过程 (Nozaki等, 2003 )。
而陆生植物叶绿体基因组结构、 基因含量和基因
排列顺序相对保守, 因此在陆生植物的叶绿体系
统发育基因组学研究中, 全基因组特征和稀有基
因组变异两种分析方法的应用相对较少, 目前仅
局限在叶绿体基因组经历了大规模重排的类群
中。 例如早期的研究表明桔梗科中一些植物的叶
绿体基因组与烟草 (茄科) 基因组相比经历了
大量的基因重排 ( Cosner 等, 1997; Knox 等,
1993, 1999)。 基于此, Cosner等 (2004) 通过对
桔梗科 18 个种叶绿体基因组的基因排列顺序进
行分析, 并以此构建系统树, 从一个全新的角度
阐述了桔梗科内部 18 个属间的系统发育关系。
虽然以上非序列分析方法的单独使用受到了
一定程度的限制, 但一般认为全基因组特征和稀
有基因组改变较少受到平行演化和回复突变的影
响, 并且这种非序列分析方法受序列比对算法的
内在影响较小, 因此可与分子序列数据结合起来
进行分析。 从基因组特征和稀有基因组变异的角
度挖掘基因组中的有用信息, 可用于对基于序列
分析的研究结果进行验证, 或是用以确定某些争
议类群的系统学位置。 如 Pombert 等 (2005) 基
于叶绿体基因组 58 个蛋白质编码基因的核苷酸
序列和氨基酸序列对绿藻门中绿色鞭毛纲 (Pra鄄
sinophyceae)、 石莼纲 (Ulvophyceae)、 共球藻纲
(Trebouxiophyceae) 及绿藻纲 (Chlorophyceae) 之
间的系统发育关系进行研究, 结果产生了具有两
种不同拓扑结构的系统发育树, 一种支持石莼纲
和共球藻纲为姊妹关系, 另一种支持石莼纲和绿
藻纲为姊妹关系, 而通过对叶绿体基因组中的基
因排列顺序、 基因丢失的情况及基因组重排断裂
点进行分析, 认为后一种系统发育关系更为合理。
基因组特征和稀有基因组变异是叶绿体基因组中
的宝贵资源, 对正确理解物种之间的关系有着不
可忽视的作用, 但目前在叶绿体系统发育基因组
学中, 没有一套统一成熟的非序列分析方法。 虽
然也有少数基于非序列分析的方法学报道 (Cosner
等, 2000; Chu等, 2004; Yu等, 2005), 但这些方
法的有效性有待于在实践中进行进一步考证。
2. 2摇 序列分析方法
基于序列分析的方法与传统的分子系统学研
究方法一致, 因而在叶绿体系统发育基因组学中
7634 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 张韵洁和李德铢: 叶绿体系统发育基因组学的研究进展摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
应用较为广泛。 受数据获得较为困难的限制, 叶
绿体系统发育基因组学多用于较高阶元的系统学
研究。 最初多通过对某个或少数几个系统学位置
具有争议的关键类群的叶绿体基因组进行测序,
并结合数据库中已有的叶绿体基因组数据, 用以
研究这些类群在植物界中的系统学位置。 例如葡
萄科在被子植物中的系统学位置一直存在争议,
基于一个或多个分子片段所进行的系统发育研究
结果非常不一致, 且支持率均较低 ( Savolainen
等, 2000; Chase等, 1993; Hilu等, 2003)。 Jan鄄
son等 (2006) 对葡萄 (Vitis vinifera) 全叶绿体基
因组进行测序, 结合数据库中已有的 26 种被子
植物叶绿体基因组序列进行系统发育研究, 结果
强烈支持葡萄科为其余蔷薇分支 ( rosids) 植物
的姊妹群。
随着叶绿体基因组数据的不断累积, 使得分
类学家可以利用大量叶绿体基因组对整个被子植
物的系统发育关系进行重建, 这些研究结果也使
得被子植物系统发育的基本框架逐渐清晰。 例如
在被子植物中, 虽然以 Amborella、 Nymphaeales
和 Austrobaileyales为核心的 “ANITA阶冶 (ANI鄄
TA grade) 构成被子植物基部分支这一观点已形
成共识, 但究竟哪一个类群才是被子植物最基部
的类群一直存在争议 ( Barkman 等, 2000;
Leebens鄄Mack 等, 2005; Qiu 等, 2005)。 Jansen
等 (2007) 根据 64 个叶绿体基因组的 81 个基
因, 成功的解决了这一分类学上的争议问题。 研
究结果强烈支持 Amborella 为被子植物的最基部
类群, 随后依次是 Nymphaeales 和 Austrobailey鄄
ales。 再如在被子植物中, Pentapetalae 分支包含
除洋二仙草目 (Gunnerales) 以外的所有核心真
双子叶植物分支。 长期以来基于多个基因片段的
系统学研究仍然没有解决 Pentapetalae 分支内部
主要分支之间的关系 (Soltis 等, 2003; Burleigh
等, 2009), 这与 Pentapetalae分支内部一些主要
分支可能由快速分化形成有关, 而这一假说也得
到了化石证据的支持 ( Magall佼n 等, 1999;
Magall佼n和 Castillo, 2009)。 Moore 等 (2010) 选
取了 86 个种子植物叶绿体基因组的 83 个蛋白质
编码基因和 rRNA 基因, 对 Pentapetalae 分支做
了比较全面的分析, 很好的解决了该分支内部很
多主要分支间的系统学关系。 对于一些用大规模
分子数据仍未解决其系统关系的类群, 如唇形亚
纲 (Lamiidae) 内部关系, 昆栏树目 (Trochoden鄄
drales), 黄杨目 ( Buxales) 和洋二仙草分支
(Gunneridae) 之间的关系, 作者也指出这些类群
可能经历了快速分化的过程。
在较高分类阶元的系统发育基因组学研究中
多利用来自叶绿体基因组编码区的信息, 而对于
较低阶元分类群, 如亚科下、 属下分类阶元等,
叶绿体基因组具有的良好共线性使基于全叶绿体
基因组的序列比对成为可能, 而非编码区的参与
分析为解决低阶元分类群之间的系统关系提供了
庞大的数据基础。 对于因研究类群之间分子差异
较小而使其分子系统发育研究显得较为困难的类
群, 利用叶绿体系统发育基因组学手段将会是一
个较好的解决方案。 Parks 等 (2009) 运用新一
代测序技术测序了 37 个松属植物及其近缘种的
叶绿体基因组, 用以研究松属植物内部的系统学
关系。 与以往基于多个分子片段的研究结果相
比, 采用系统发育基因组学的手段, 大大提高了
松属植物内部分支的分辨率和支持率。 这一研究
成果首次证实了全叶绿体基因组序列用于低分类
阶元系统发育研究的可行性及优势。
禾本科是叶绿体基因组研究比较集中的一个
科, 但竹亚科, 特别是木本竹类的叶绿体基因组
研究比较少。 木本竹类种类丰富、 形态多样、 分
布广泛, 其漫长的开花周期使得收集完整的花
序、 子房和果实等十分困难, 而分子系统学研究
结果表明木本竹类的分子变异率较低, 能提供的
系统发育信息较少, 因此无论从形态上还是分子
水平上, 都被认为是分类学中的一个困难类群。
基于以上研究背景, Zhang 等 (2011) 利用新一
代测序技术对六种木本竹类的叶绿体全基因组进
行了测序, 并结合已测序的 18 个禾本科叶绿体
全基因组进行系统发育分析, 以此评估叶绿体系
统发育基因组学在竹亚科植物系统发育重建中的
有效性。 研究结果在叶绿体基因组水平上证实了
禾本科 BEP分支中竹亚科和早熟禾亚科为姊妹
关系。 与传统的分子系统学研究结果相比 (Zeng
等, 2010), 利用叶绿体全基因组序列所构建的
系统发育树在竹亚科内部具有更高的分辨率和支
持率。 由此可见, 对于木本竹类这样一个分子变
异率极低的类群来说, 利用全叶绿体基因组数据
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对其系统发育进行重建是较为有效的, 更多木本
竹类的叶绿体基因组全序列的测定, 将有助于竹
亚科植物系统发育关系的重建。 相信伴随着测序
技术的发展, 叶绿体系统发育基因组学在低阶元
分类系统中的应用价值将得到更多的体现。
2. 3摇 叶绿体系统发育基因组学在植物系统发育
研究中的优势
从近年来的研究进展中不难看出, 叶绿体系
统发育基因组学已成为植物进化生物学的重要研
究趋势之一。 虽然基于核基因组数据的系统发育
基因组学在植物系统发育研究中也扮演着重要的
角色 (Zou等, 2008), 但目前由于很多植物类群
的基因组背景尚不清楚, 而核基因组结构较为复
杂, 对于直系同源 (orthology) 基因的选择显得
较为困难, 因此使得基于核基因组的系统发育基
因组学在植物的进化研究中受到了很大的限制。
而叶绿体系统发育基因组学作为植物系统发育的
新型研究手段之一, 存在很多优势: (1) 叶绿体
基因组结构及基因含量较为保守, 易于测序, 且
除了反向重复区外所有基因均为单拷贝, 几乎不
存在 (或很少受) 旁系同源 (paralogy) 基因的
干扰。 (2) 叶绿体基因组中除包含大量的核苷酸
和氨基酸序列信息, 其基因组特征也可作为系统
发育分析的有效资源, 对正确理解物种之间的亲
缘关系有着巨大的潜在价值。 (3) 对于一些低分
类阶元类群, 或由于分子进化速率较慢, 分化时
间较短的类群, 往往因为分子水平的变异较低,
能提供的信息位点较少, 而成为分类学上的困难
类群。 而利用叶绿体系统发育基因组学, 能提供
大量的数据信息, 对于这样一些分类困难的类群
不失为一种很好的选择。 (4) 传统的分子系统学
往往采用少数几个分子片段和密集取样的策略进
行系统学研究, 而叶绿体系统发育基因组学作为
传统分子系统学的 “对立面冶 (一般采用大规模
基因组数据和较少分类群代表), 可以从另一个
全新的角度对传统分子系统学研究结果 (特别
是在分辨率低和基于不同片段建立的分子树存在
冲突的情况下) 进行补充和评估。
3摇 叶绿体系统发育基因组学存在的问题
基于分子序列推断系统发育关系时, 因为随
机误差 (即由于基因片段较短或信息含量较低所
造成的取样误差) 和系统误差 (因系统分析方法
与分子数据实际的进化模式不一致而带来的误差,
是系统分析方法的固有误差) 的存在, 会导致基
于不同分子片段或不同取样策略所进行的系统发
育研究结果的不一致或者说是基因树与物种树之
间的冲突。 虽然叶绿体系统发育基因组学能尽可
能的减少由随机误差带来的影响, 但与传统的系
统发育研究一样, 它同样无法避免系统误差带来
的影响。 而这种系统误差不会因为数据量的增加
而减小, 在某些情况下还会因为数据量的增加而
被不断放大。 因此, 系统发育基因组学带来的一
个新的问题是, 所构建的基因组树具有很高的支
持率, 却不一定反映真实的系统发育关系。 因而
相较于用较少基因片段所构建的系统发育树来说,
用系统发育基因组树来判断物种之间的真实进化
关系需更为谨慎 (Phillips 等, 2004; Soltis 和 Sol鄄
tis, 2004; Stefanovi c等, 2004; Lockhart等, 2005)。
近年来关于叶绿体系统发育基因组学的争议
主要围绕由系统误差导致的长枝吸引假象展开。
长枝吸引 ( long鄄branch attraction, LBA) 假象是
指在使用系统发育分析方法分析一个有限的数据
集时, 由于高频的平行突变、 回复突变或快速进
化等因素的存在使亲缘关系较远的序列达到相似
状态, 而分析方法中存在的固有偏差却错误的将
这些不是来自共同祖先的序列聚在一起的现象
(Bergsten, 2005)。 引起长枝吸引假象产生的原
因很多, 其中一个典型的原因就是由于取样不全
所造成的长枝吸引。 系统发育基因组学一般是基
于大规模和多个基因数据信息, 通常只有较少分
类群代表的一种分析方法, 因而相较于传统的系
统发育研究方法, 系统发育基因组学更容易出现
因取样不全而导致的长枝吸引假象 ( Soltis 等,
2004; Philippe等, 2005)。 关于被子植物基部类
群的争议, 是叶绿体系统发育基因组学研究中因
取样不当造成长枝吸引假象的典型例子。 在对被
子植物基部类群的研究中, 基于一个或多个基因
片段的分子系统学研究结果表明 Amborella 或
Amborella鄄Nymphaeales为被子植物的基部类群。
然而 Goremykin 等 (2003, 2004) 在对 Amborella
trichopoda和 Nymphaea alba的叶绿体全基因组测
序后, 结合数据库中 12 个叶绿体基因组的 61 个
蛋白质编码基因进行系统学研究, 指出单子叶植
9634 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 张韵洁和李德铢: 叶绿体系统发育基因组学的研究进展摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
物才是被子植物的基部类群。 这一研究结果引起
了学术界的强烈关注。 此后, Soltis 和 Soltis
(2004), Stefanovi c 等 (2004) 在 Goremykin的数
据基础上增加了一个关键类群后得出的结果表示
Amborella或 Amborell鄄Nymphaeales 仍然为被子植
物的基部类群。 且这一研究结果在增大取样量后
所进行的叶绿体系统发育基因组学研究中也得到
了证实 ( Leebens鄄Mack, 2005; Jansen 等, 2007;
Moore等, 2010)。 Goremykin 等的研究结果主要
是由于取样不当造成的, 禾本科植物在起源过程
中经历了一个快速进化的过程 (Chaw 等, 2004;
Zhong等, 2009), 因而仅以禾本科植物叶绿体基
因组作为单子叶植物的代表, 就造成了禾本科植
物因显著加快的进化速率而被 “吸引冶 到基部
的长枝吸引假象。
长枝吸引现象一直是系统发育研究中的热点
和难点, 众多研究结果指出避免长枝吸引产生的
方法主要有以下几种: (1) 选用对长枝吸引较不
敏感的系统分析方法, 如改良的简约分析法
(Lake, 1987; Willson, 1999 ) 或最大似然法
( Swofford 等, 1996; Huelsenbeck, 1997 ) 等。
(2) 在分析时选取进化速率较慢的物种代表该物
种所在的类群 (Aguinaldo 等, 1997; Brinkmann
和 Philippe, 1999; Kim 等, 1999) 或相应的去除
长枝类群, 即进化速率显著加快的类群。 (3) 去
除进化速率较快的序列位点, 如第三位密码子
(Lyons鄄Weiler和 Hoelzer, 1997)。 (4) 密集取样
以打断长枝, 该方法目前被认为是避免长枝吸引
假象产生的最有效办法 (Hendy 和 Penny, 1989;
Hillis, 1996; Swofford 等, 1996; Graybeal, 1998;
Hillis, 1998)。 然而对系统发育基因组学而言,
由于获得基因组信息相对较难, 因而目前阶段很
难做到密集取样。 而大量基因组数据的产生在增
加了系统发育信号的同时, 进化过程中的 “噪
音冶 (如回复突变、 趋同突变、 平行突变等) 也
随之被放大。 为尽量减少这些 “噪音冶 带来的
影响, 有学者提出在系统发育基因组学研究中,
应适当的选取基因组数据信息 (如使用氨基酸序
列以减少由密码子简并性带来的进化 “噪音冶)
或者适量的舍弃基因组数据信息中的 “噪音冶
成分 (如第三位密码子) (Jeffroy 等, 2006)。 这
一理论也在近期的叶绿体系统发育基因组学研究
中得到了证实。 例如, 买麻藤目的系统学关系一
直以来备受争议, 分子系统学研究结果主要存在
三种假说: (1) 买麻藤目与整个松柏类植物为姊
妹关系 (Chaw等, 1997); (2) 买麻藤目位于松
柏类中, 与松科植物为姊妹群 (Bowe 等, 2000;
Chaw 等, 2000; Hajibabaei 等, 2006; Wu 等,
2007); (3) 买麻藤目位于松柏类中, 与杉科植
物为姊妹群 (Nickrent 等, 2000; Doyle, 2006)。
各种研究证据表明在关于买麻藤目的研究中可能
存在长枝吸引的影响 (Felsenstein, 1978; Hendy
和 Penny, 1989; Lockhart 和 Steel, 2005; Hajib鄄
abaei等, 2006) 。 Zhong 等 (2010) 利用叶绿体
系统发育基因组学的手段对买麻藤目的系统学位
置进行了研究。 这一研究最初使用 13 个种的 56
个基因的氨基酸序列进行分析, 结果表明买麻藤
目与杉科更近, 但买麻藤目和杉科的枝长均显著
长于其他分支, 有可能是受到长枝吸引的作用。
因此该研究进一步结合多种取样手段及去除一些
快速进化或受平行氨基酸替换影响的蛋白质序列
和位点后, 指出买麻藤目与松科关系更近这一假
说更为合理。 同时, 这一研究中也对原有的
cpREV模型进行了改进, 并证明新的模型可相
对减轻长枝吸引带来的影响。 在这一研究基础
上, 作者指出在叶绿体基因组数据中长枝吸引及
平行核苷酸替代 (parallel substitutions) 可能导致
买麻藤目的系统学位置出现严重的偏差, 而增加
取样量和移除一些快速进化的基因能有效的避免
长枝吸引带来的影响。 基于目前非松科的松柏类
植物仅有柳杉 (Cryptomeria japonica) 的叶绿体
基因组作为代表种, 作者也认为更多非松科的松
柏类植物的叶绿体基因组测序将会为买麻藤目的
系统学位置带来更好的解释。
以上两个例子可以说明在实际应用中, 对于
叶绿体系统发育基因组学因取样不全而带来的长
枝吸引假象, 应加以小心判断, 通过不同的取样
策略和不同的研究方法, 可将这种影响降到最
低。 同时, 随着系统发育基因组学的发展, 对系
统发育研究方法也提出了新的要求。 如概率分析
方法中应使用能尽量反映真实核苷酸替代模式的
模型, 以减少由模型不适带来的影响 ( Steel,
2005)。 用于动物线粒体蛋白质的氨基酸替代模
型很多, 但对于植物叶绿体蛋白质的氨基酸替代
073摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 33 卷
模型目前却只有 cpREV 一种报道 (Adachi 等,
2000)。 随着叶绿体系统发育基因组学的迅速发
展, 对新的氨基酸或核苷酸替代模型的需要也迫
在眉睫。
虽然叶绿体基因组在系统发育研究中具有众
多的优点, 但是必须认识到的一点是叶绿体系统
发育基因组学并不是解决植物系统学问题的万能
药。 例如对于一些在进化过程中经历了快速分化
的类群, 有研究表明全叶绿体基因组数据仍然不
足以完全解决这些类群的系统发育关系 (Parks
等, 2009; Moore 等, 2010)。 对于这样一些类
群, 结合大量核基因组数据进行分析仍然是必要
的。 其次, 叶绿体在大多数植物类群中是单亲遗
传, 来自叶绿体基因组的信息一般情况下仅能反
映母系或父系进化历程, 并不能完全揭示植物生
命进化的全部过程。 但对叶绿体基因组树的正确
认识是研究物种进化的前提, 结合来自核基因组
的数据, 能更全面的揭示植物生命进化的全过
程, 并发现一些生命进化过程中有趣的现象, 如
杂交、 渐渗等。
4摇 新一代测序技术对叶绿体系统发育基
因组学发展的促进作用
在新一代测序技术尚未出现以前, 叶绿体全
基因组的测序一般采用以下三种策略: (1) 先分
离纯化叶绿体基因组, 并构建质粒文库, 采用全
基因组鸟枪法 (Whole Genome Shotgun Sequen鄄
cing) 进行测序。 该方法的一大难点在于分离纯
化叶绿体基因组在实际操作中较为困难, 叶绿体
基因组的含量和纯度直接影响需挑取测序的克隆
数目。 对于一些高纤维含量的植物, 分离纯化其
叶绿体基因组相当困难 ( Jansen 等, 2005), 且
分离纯化叶绿体基因组需要新鲜幼嫩的材料, 这
在一定程度上限制了该方法的应用。 (2) 全基因
组构建 BAC (Bacterial Artificial Chromosome, 细
菌人工染色体) 文库, 利用叶绿体探针在 BAC
文库中挑取含叶绿体基因组的克隆, 再进一步采
用鸟枪法进行测序。 该方法一般是在已建立
BAC文库的基础上进行的, 因为成本较高, 对
于没有建立 BAC 文库的物种, 想要获得其叶绿
体基因组序列一般不采用这种方法。 (3) 利用叶
绿体基因组的相对保守性设计引物, 采用长
PCR (Long PCR) 或 PCR的方法进行测序, 这是
目前运用的比较多的方法, 但仍然存在工作量
大, 耗时长等问题。
新一代测序技术 ( next鄄generation sequen鄄
cing, NGS) 是相对于传统的 Sanger 测序法 (即
末端终止法) 而言的, 又称第二代测序技术。 它
是对在末端终止法、 连接酶测序法 ( sequencing
by ligation, SbL)、 焦磷酸测序法 ( pyrosequenc鄄
ing) 和杂交测序法 ( sequencing by hybridization,
SbH) 的基础上进行改良的测序技术的统称。 新
一代测序平台的典型代表有罗氏 (Roche) 公司
的 454 测序平台, Illumina 公司的 Solexa 测序平
台以及 ABI (Applied Biosystems) 公司的 SOLiD
测序平台 (Shendure 和 Ji, 2008)。 新一代测序
技术的诞生, 使基因组学和功能基因组学进入了
一个低成本、 大规模、 高通量测序的时代, 同时
也为叶绿体系统发育基因组学带来了新的契机。
新一代测序技术的测序长度一般较短, 根据测序
平台不同, 读长从 25 ~ 450 bp 不等, 适用于结
构及成分较为简单的基因组的测序。 叶绿体基因
组因大小适中, 且基因含量及基因组结构相对保
守, 基因组中重复序列含量相对较少, 对于单个
个体而言叶绿体基因组无变异或仅有极少量变
异, 因此新一代测序技术完全适用于叶绿体基因
组的测序。
利用新一代测序技术获得叶绿体基因组数据
相对于传统方法的优势在于成本较低, 可在短时
间内同时获得多个叶绿体基因组数据, 测序深度
(Sequencing Depth) 为传统方法的 2 ~ 10 倍。
Moore等 (2006) 首次应用 454 测序平台, 对南
天竹 (Nandina domestica) 和一球悬铃木 (Plata鄄
nus occidentalis) 进行测序, 两个基因组均获得
了高于 99. 75%的基因组覆盖度, 测序深度分别
为 24. 6伊 (南天竹) 和 17. 3伊 (一球悬铃木)。 最
近该方法也成功用于绿豆 (Vigna radiata) 叶绿
体基因组的测序 (Tangphatsornruang 等, 2010)。
Cronn等 (2008) 首次利用 Solexa 测序平台同时
测序了 8 个针叶树叶绿体基因组, 基因组覆盖度
为 88% ~94% , 测序深度为 55伊到 186伊, 证实
了利用 Solexa测序平台能高效快速的获得叶绿体
基因组数据。 随后该方法继续用于 37 个松属植
物及其近缘种的叶绿体基因组测序, 并在此基础
1734 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 张韵洁和李德铢: 叶绿体系统发育基因组学的研究进展摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
上对松属植物的系统发育关系进行了进一步探讨
(Parks等, 2009)。 得益于新一代测序技术的发
展, 叶绿体全基因组数据不仅可用于研究较低分
类阶元的系统关系, 最近的研究还指出全叶绿体
基因组数据在研究分布于不同地理位置的同一物
种的种内变异中也存在着巨大的潜力 (Whittall
等, 2010)。 叶绿体基因组在居群水平的应用可
为研究种内分化时间和分化强度提供线索。 结合
核基因组数据进行分析还可为植物的花粉传播、
迁移途径及物种进化动力等有更全面的了解。
由于叶绿体基因组数据在以前获得较为困
难, 使得基于叶绿体基因组的系统发育基因组学
发展受到了很大程度的限制。 随着新一代测序技
术的日趋成熟以及序列拼接软件的不断完善, 叶
绿体基因组数据的获得变得高效快速, 且大大降
低了测序成本。 这为同时获取多个叶绿体基因组
数据提供了坚实的技术支持, 随着叶绿体基因组
数目的增加, 因取样不全而带来的长枝吸引现象
也能最大限度的避免。 不仅如此, 新一代测序技
术的发展, 将大大促进叶绿体系统发育基因组学
在较低级分类阶元中的应用。 从近年来新一代测
序技术在叶绿体基因组数据获得中的成功运用不
难看出, 这一新技术的出现将大大推动叶绿体系
统发育基因组学的发展, 从而为植物的系统发育
研究带来新的曙光。
也参摇 考摇 文摇 献页
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473摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 33 卷
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筌 筌 筌 筌 筌 筌 筌 筌 筌 筌 筌 筌 筌 筌 筌
书评 A review of Bamboos at TBGRI by K. C. Koshy
Koshy, K. C. (2010). Bamboos at TBGRI. Pp. 104, 128 colour photographs, 1 painting, 1 graph, 1 map. India:
Kerala, Tropical Botanic Garden and Research Institute (TBGRI), Palode, Thiruvananthapuram 695562. Price
Rs. 600; US $ 30 (postage & handling free). ISBN 978-81-920098-0-3 (soft cover).
摇 摇 This book tells the story of the establishment of a bambusetum at the Tropical Botanic Garden and Re鄄
search Institute in the state of Kerala in southern India. Started in 1987 by the author, it could be held up as
a model of thoroughness in building up a living bamboo collection. Scrupulous care was taken to document all
introductions and their location in the Garden. Although only 68 species are represented, great effort was
taken to acquire a diversity of genotypes within them amounting to 933 different accessions. This diversity is
valuable for understanding specific variability, flowering cycles, and selecting the best clones for different u鄄
ses. It is also indispensable for bamboo breeding which they have ventured into and have successfully pro鄄
duced 12 hybrids. For each species, the information on nomenclature, description, distribution, live collec鄄
tions, location, planting date, propagule and provenance, dried specimens are given in detail. The species
descriptions are focused on the vegetative characters, which are very useful for identification. Many photo鄄
graphs are helpful but some species don忆t have close鄄up pictures of the new shoots which are so important in i鄄
dentifying species in a vegetative state. A number of species of Pseudoxytenanthera and Ochlandra, native to
south India, which are seldom illustrated in bamboo books, are depicted here. This book is a wonderful record
of the live bamboo collection at TBGRI and a useful reference for understanding the conservation of the bamboo
genetic diversity. It is a very useful handbook for bamboo researchers, collectors, growers as well as amateurs.
Prof. Dr. Xia Nianhe
Curator of the Living Collection
South China Botanical Garden
Chinese Academy of Sciences
5734 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 张韵洁和李德铢: 叶绿体系统发育基因组学的研究进展摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇