全 文 ：利用 RAPD 技术分析云南兰属部分种的种间关系?
程少丽1 , 李枝林2 , 张俊祥1 , 范成明1 , 赵明富1 , 何月秋1
??
( 1 云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室 , 云南 昆明 650201;
2 云南农业大学园林园艺学院 , 云南 昆明 650201)
摘要 : 采用 RAPD技术对云南兰属的 11 个种和 3 个变种中的 39 个样本进行了相似性分析。在相似系数 0.58
水平上 , 大花亚属的虎头兰、西藏虎头兰、长叶兰和碧玉兰聚为一支 ; 建兰亚属的寒兰、墨兰、蜜蜂兰、蕙兰、
春兰、豆瓣兰、春剑、莲瓣兰和送春聚为另一支 , 兔耳兰与大花亚属关系更近。春剑和莲瓣兰相似性更高 , 它
们与春兰的关系较远 , 不支持送春作为蕙兰下的变种。这些结果可为开展兰属育种提供重要参考价值。
关键词 : 兰属 ; RAPD; 遗传多样性 ; 相似性
中图分类号 : Q 943 , Q 949 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700( 2006)06 - 565 - 05
Similarity Analyses of Some Species of Cymbidium (Orchidaceae)
from Yunnan Province Using RAPD Technique
CHENG Shao-Li1 , LI Zhi-Lin2 , ZHANG Jun-Xiang1 , FAN Cheng-Ming1 ,
ZHAO Ming-Fu
1
, HE Yue-Qiu
1 **
( 1 Key Laboratory of Agro-diversity and Pests and Diseases Control , Ministry of Education of China, Yunnan Agricultural University,
Kunming 650201 , China; 2 Collegeof Gardening and Horticulture, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201 , China)
Abstract: Thirty-nine accession of eleven species and threevarieties of Cymbidiumin Yunnan Province were analyzed by
usingRAPD technique . Sampled species in subgenus Cyperorchis, including C. hookerianum, C. tracyanum, C. ery-
thraeum, and C. lowianum are clustered into a clade; while species in the subgenus Jensoa, including C . kancan,
C. sinense, C. pumilum, C . faberi, C. goeringii, C . goeringii var. serratum, C . tortisepalum var. longibracteatum,
C. tortisepalum and C . cyperifoliumvar. szechuanicum areclassified into another clade . C. lancifoliumis closer to subge-
nus Jensoa than to theothers . C . tortisepalumvar. longibracteatumis closeto C . tortisepalumvar. tortisepalumand both of
them arefar from C . goeringii . It is not supported that C . cyperifoliumvar. szechuanicumbelongs to avarietyof C. faberi .
These findings may benefit to Cymbidiumbreeding .
Key words: Cymbidium; RAPD; Genetic diversity; Similarity
广义上的兰花是整个兰科植物 (Orchidace-
ae) 的总称 , 约有 1000 属 , 近 2 万种 , 人工杂
交种更在 4 万个以上。我国有 166 属 1019 种
(陈俊愉 , 2001)。云南由于地形地貌复杂 , 且位
于兰科植物分布中心———中国 - 喜马拉雅森林植
物亚区 , 兰科植物种类十分丰富 , 5 个亚科均有
分布 , 约 100 属 530 余种 , 又以兰属、兜兰属、
石斛属、杓兰属、万带兰属、鹤顶兰属、指甲兰
属、白芨属、独蒜兰属等分布相对集中 , 占全国
各属中的大多数种类 , 作为育种亲本的种质资
源 , 是全国乃至全球兰艺界瞩目的宝库 ( 王利民
等 , 2005) 。但狭义上的兰花 , 仅指兰科中的兰
云 南 植 物 研 究 2006 , 28 (6) : 565～569
Acta Botanica Yunnanica

?
?? ?通讯作者 : Author for correspondence E - mail : heyueqiu@ tom. com 电话 : 0871 - 5228532
收稿日期 : 2006 - 01 - 20 , 2006 - 04 - 18 接受发表
作者简介 : 程少丽 (1981 - ) 女 , 在读硕士研究生 , 主要从事植物系统发育学研究。 ?
基金项目 : 国家自然科学基金项目、云南省科学基金重点项目“云南野生兰花遗传资源研究及利用” ( 30160074 , 2002C0003P)
属 ( Cymbidium) 植物 , 全世界约 48 种 , 云南约
29 或 30 种 ( 含变种 ) (陈心启 , 1999; 潘光华和
潘蕾 , 2003; 王卜琼等 , 2005 ) , 它们具有重要
的药用和观赏价值 , 涵盖了温带 (高山 )、亚热
带、热带 3 大气候区的多种生活习性的地生兰、
阴生兰和腐生兰类。兰花的分类方法很多 , 如根
据花期或者生态类型的分类方法 , 但依据形态特
征是国际上通用的分类方法。现有的兰属分类系
统是基于植株根、茎、叶片、花的各部分细微构
造上的差异 , 制定检索表 , 进行种和变种查询
(刘金和潘光华 , 1998) 。由于兰属植物种间有杂
交现象 , 呈现出中间类型多样 , 部分种的界限不
清 , 给属内种的分类带来了一定的困难 , 因而导
致各研究者所得到的分类系统不尽相同 ( 刘金和
潘光华 , 1998; 陈心启 , 1999; 吴应祥 , 1993) 。
RAPD (RandomAmplification Polymorphic DNA)
技术因所需 DNA 较少、快速、费用低及操作简
单 , 已被广泛地用于植物亲缘关系分析 (Williams
等 , 1990)。在兰花的亲缘关系研究中 , Grünanger
等 (1998) 用 RAPD 技术分析意大利产的 Ophrys
bertolonii ( 眉 兰 ) 及两个近 缘种 O. sphegodes 和
O. fuciflora, 有效地将 O. bertolonii 同这两个近缘
种区分开来。梁红健等 (1996, 1997) 和王慧中等
(2004) 分别利用 RAPD 技术对中国部分兰属植物
进行了研究 , 明确了部分种内品种间的亲缘关系 ,
并指出 , 兰属各种间的聚类结果与形态学分类的
结果不完全一致。尽管云南省兰属植物种类多 ,
但有些种在分类关系上不甚清楚。本研究采用
RAPD 技术 , 以采自云南省不同生态条件下的野
生兰花为材料开展基因组水平上分析 , 旨在揭示
云南省兰属中 10 个种和 3 个变种间的相关性 ,
并为兰花育种提供理论依据。
1 材料和方法
1 .1 材料
所有 39 个兰花样本均为云南省野生兰花 , 包括 11
个种和 3 个变种 , 并栽培于云南农业大学园林园艺学院温
室苗圃中。样本的中文名和拉丁学名 (表 l ) 以陈心启
(1999)、陈心启和刘仲健 (2003) 的分类系统为依据。
1 .2 方法
1 .2 .1 DNA 的提取 采用 CTAB 法 ( Doyle and Doyle,
1987) 提取基因组总 DNA。
表 1 材料名称及采集地点
Table 1 Names and locality of Cymbidium
序号 种类 采集地 序号 种类 采集地
Code Species Collection site Code Species Collection site
T1 2虎头兰 CymbidiumhookerianumRchb . f 大理市宾川县 T23 ?蕙兰 C M. faberi Rolfe 大理市
T2 2虎头兰 C ?. hookerianum Rchb . f 思茅市西盟县 T24 蕙兰 C M. faberi Rolfe 大理市
T10 D虎头兰 C ?. hookerianum Rchb . f 大理州南涧县 T25 蕙兰 C M. faberi Rolfe 昆明市
T3 2碧玉兰 C ?. lowianumRchb . f 文山州西畴县 T22 蜜蜂兰 C . pumilumRolfe 保山市龙陵县
T11 D碧玉兰 C ?. lowianumRchb . f 思茅市西盟县 T37 蜜蜂兰 C . pumilumRolfe 文山州马关县
T4 2西藏虎头兰 C ?. tracyanum L . Castle 迪庆州中甸县 T26 墨兰 C M. sinenseWilld 文山州麻栗坡县
T5 2西藏虎头兰 C ?. tracyanum L . Castle 临沧市凤庆县 T27 墨兰 C M. sinenseWilld 文山州麻栗坡县
T6 2西藏虎头兰 C ?. tracyanum L . Castle 大理州南涧县 T28 墨兰 C M. sinenseWilld 文山州麻栗坡县
T7 2长叶兰 C ?. erythraeumLindl 思茅市 T29 送春 C M. cyperifoliumvar \. szechuanicum 大理市
T8 2长叶兰 C ?. erythraeumLindl 临沧市永德县 Y .S. Wu et S.C O. Chen
T9 2长叶兰 C ?. erythraeumLindl 临沧市永德县 T30 送春 C M. cyperifoliumvar \. szechuanicum 昆明市安宁县
T12 D兔耳兰 C ?. lancifolium Hook 思茅市 Y .S. Wu et S.C O. Chen
T13 D兔耳兰 C ?. lancifolium Hook 文山州西畴县 T34 送春 C M. cyperifoliumvar \. szechuanicum 怒江州贡山县
T14 D莲瓣兰 C ?. tortisepalumY .S ?.Wu et S.C l.Chen 昆明市安宁县 Y .S. Wu et S.C O. Chen
T15 D莲瓣兰 C ?. tortisepalumY .S ?.Wu et S.C l.Chen 怒江州贡山县 T31 春兰 C M. goeringii Rchb . f . 大理市宾川县
T16 D莲瓣兰 C ?. tortisepalumY .S ?.Wu et S.C l.Chen 怒江州贡山县 T32 春兰 C M. goeringii Rchb . f . 大理市宾川县
T17 D莲瓣兰 C ?. tortisepalumY .S ?.Wu et S.C l.Chen 怒江州福贡县 T33 春兰 C M. goeringii Rchb . f . 大理市宾川县
T19 D春剑 C ?. tortisepalumvar. longibracteatum 文山州西畴县 T35 豆瓣兰 C . goeringii var P. serratum 文山州西畴
Y ?.S ;. Wu et S ^.C .Chen Y .S. Wu et S.C O. Chen
T20 D春剑 C ?. tortisepalumvar. longibracteatum 文山州麻栗坡县 T36 豆瓣兰 C . goeringii var P. serratum 文山州西畴
Y ?.S ;. Wu et S ^.C .Chen Y .S. Wu et S.C O. Chen
T21 D春剑 C ?. tortisepalumvar. longibracteatum 大理市 T38 寒兰 C M. kancan Makino 思茅市
Y ?.S ;. Wu et S ^.C .Chen T39 寒兰 C M. kancan Makino 思茅市
T18 D蕙兰 C ?. faberi Rolfe 昆明市禄劝县
665 云 南 植 物 研 究 28 卷
1 .2 .2 RAPD分析 采用 25μl 反应体系 : 1 . 0μl DNA 模
板 (10 ng?μL ) , 2μl MgCl2 (25 mmol ) , 2 .0μl dNTP ( 2 .5
mmol ) , 2 . 5μl 10×Buffer, 1 . 5 U Taq DNA 聚合酶 (晶美公
司产品) , 2μl 引物 (10μmol , 上海申友生物技术有限责
任公司合成 ) ; 反应程序 : 95℃ 5 min, 94℃ 1 min, 36℃
1 min, 72℃ 2 min, 循环 40 次 , 72℃延伸 10 min。
1 .2 .3 数据处理 PCR 反应产物在 1 .5%的琼脂糖凝胶
上检测 , 经溴化乙锭溶液染色后 , 显影照相。每一条亮
带视为一个位点 , 存在者计“1”, 不存在者计“0”, 将
结果制成 0?1 矩阵。用统计软件 Statistic 聚类分析方法中
的 UPGMA 联结规则 , 采用 Percent disagreement 方法 , 得
到各样本的分析聚类图。
2 结果
2 .1 遗传多样性
从 200 条随机引物中筛选出多态性好、稳定
性高的 15 条引物 , 共扩增 140 条带 (表 2) , 但
各引物对扩增的条带数存在一定的差异 , 最多的
为引物 BA0402 , 扩增出 13 条 , 最少的为引物
BA0374 和 BA0344 , 仅扩增出 6 条带 ( 表 2 )。平
均每条引物的扩增带数为 9 .3 条 , 扩增条带的大
小主要集中在 300 bp～1600 bp之间 , 每条引物的
多态率均为 100% , 表明供试的云南省国兰中的
兰属样品具很高的遗传多样性。
表 2 15 条引物序列及统计结果
Table 2 Sequences of 15 primers and amplification data
引物名称 序列 扩增条 多态带数 多态率 ( % )
Primer Sequence 带数 Polymorphic Polymorphic
Band band rate
BA0402 ?ACAACGCCTC 13 813 100
BA0422 ?ACCAGGGGCA 10 810 100
BA0399 ?GAGTGGTGAC 9 &9 100
BA0384 ?GACTGCACAC 8 &8 100
BA0374 ?CCCGCTACAC 6 &6 100
BA04 yO4 GGCGGTTGTC 10 810 ?100
BA0425 ?ACTGAACGCC 12 812 100
BA0353 ?CCACACTACC 12 812 100
BA0405 ?GGGAACGTGT 12 812 100
BA0324 ?AGGCTGTGCT 9 &9 100
BA0331 ?CTCAGTCGCA 9 &9 100
BA0347 ?CCTCTCGACA 8 &8 100
BA0344 ?CCGAACACGG 6 &6 100
BA0337 ?CCTTCCCACT 8 &8 100
BA0330 ?CCGACAAACC 8 &8 100
总数 Total 140 K140 ?-
平均 Mean 9 ?. 3 9 .3 100
2 .2 种间关系分析
从图 1 可以看出 , 所研究的种类关系清楚 ,
39 个样本的种间相似系数在 0 .54～0 .82 之间。
在相似系数 0 .58 的水平上 , 39 个兰花样品可分
成两支。第一支 ( A 支 ) : 虎头兰 ( 样本号 T1 ,
T2 , T10 )、碧 玉 兰 ( T3 , T11 )、西 藏 虎 头 兰
(T4 , T5 , T6)、长叶兰 (T7 , T8 , T9 )、兔耳兰
(T12 , T13 ) ; 第二 支 ( B 支 ) : 莲瓣 兰 ( T14 ,
T15 , T16 , T17) 、春剑 ( T19 , T20 , T21 )、惠兰
( T18 , T23 , T24 , T25 )、蜜蜂兰 ( T22 , T37 )、
送 春 ( T29 , T30 , T34 )、 春 兰 ( T31 , T32 ,
T33)、豆瓣 兰 ( T35 , T36 ) 、墨兰 ( T26 , T27 ,
T28)、寒兰 (T38 , T39)。第一支和第二支的相
似系数为 0 .54。
3 讨论
依据陈心启 ( 1999 ) 的分类系统 , 大花亚属
包括虎头兰、西藏虎头兰、长叶兰和碧玉兰; 建
兰亚属包括兔耳兰组和建兰组 , 其中兔耳兰自成
一组 , 建兰、墨兰、寒兰、蕙兰、春兰和莲瓣兰
属建兰组。依据吴应祥 (1993 ) 的分类系统 , 将
国产兰属划分为兰组和蕙组。兰组仅春兰 1 种 ,
含豆瓣兰变种; 蕙组分为 5 个亚组 , 建兰、墨兰、
寒兰、蕙兰和莲瓣兰划为小花亚组 ; 兔耳兰划入
兔耳兰亚组; 将虎头兰、西藏虎头兰、长叶兰和
碧玉兰作为大花亚组。张明永等 ( 2000 ) 运用
PCR 扩增和直接测序的方法分析了兰属 27 种、3
个栽培品种以及 3 个外来群体 nrDNA 的 ITS 区段
序列。结果表明兰属的 3 个亚属 (兰亚属、大花
亚属和建兰亚属 ) 可能均是不自然的类群。大花
亚属不是一个单系群 , 兰亚属的冬凤兰隐藏于其
中; 建兰亚属为一并系群 , 它的成员之一免耳兰
偏离出去 , 成为兰属的一个最基部分支 ; 兰亚属
为一复系群 , 它分为几支 , 分别与另两个亚属组
合在一起。但由于 ITS 序列的信息量不充分 , 未
能将亚属的界限划分清楚。本研究的 RAPD 聚类
结果表明 , 除兔耳兰之外 , 其它种兰花与陈心启
(1999) 的分类系统一致 , 即所有大花亚属的品种
聚为第一支 (A 支 ) , 所有建兰亚属的品种聚为第
二支 ( B 支 )。在兔耳兰的划分上 , 王慧中等
(2004) 用 RAPD 技术分析的结果表明 , 兔耳兰与
大花亚属材料属于同一组 , 但 AFLP 技术分析的
结果则表明兔耳兰与建兰亚属聚在同一支。张明
永等 (2002) 的结果表明兔耳兰位于兰属植物的
7656 期 程少丽等 : 利用 RAPD技术分析云南兰属部分种的种间关系
一个最基部分支。我们的 RAPD 结果与王慧中等
(2004) 的 RAPD 分析结果一致 , 即兔耳兰与大花
亚属关系更近。由此看来 , 兔耳兰的系统分类定
位还有待于采用更多样本做进一步确证。
图 1 39 个样本的 RAPD 聚类分析
Fig . 1 Dendrograph of the 39 samples based on RAPD data
莲瓣兰、送春和春剑是兰属中广为栽培但颇
有争议的分类群 ( 陈心启和刘仲健 , 2003 )。陈
心启和吴应祥 ( 1980) 将春剑和莲瓣兰作为春兰
种下的两个变种。由于春兰叶的下部有关节 , 花
序通常只具 1 朵花 , 而春剑与莲瓣兰叶的下部无
关节 , 花序通常具 3～5 朵花 , 陈心启和刘仲健
(2003) 又将春剑与莲瓣兰从春兰中移出来作为
莲瓣兰下的两个变种。我们的 RAPD 聚类结果表
明 , 莲瓣兰和春剑相似性较高 , 都被聚类到第 2
支的 B1a分支中 , 而这个分支与被划分到 B2b2
分支内部的春兰相距较远。我们的 AFLP 结果
(待发表 ) 也表明莲瓣兰和春剑关系最近 , 与春
兰关系较远。陈心启 ( 1980) 将送春作为蕙兰的
变种 , 并一直为国内兰花分类界所接受。尽管
Du and Cribb (1988) 承认送春变种 , 但他们指出
送春与莎叶兰 ( C . cyperifolium) 更为相似。陈心
启和刘仲健 ( 2003) 再次比较了送春、蕙兰和莎
叶兰的许多形态特征 , 认为送春的根毛、假鳞
茎、叶的特征均明显接近莎叶兰 , 并将其移入莎
叶兰 下 作为 一个 变 种 ( C . cyperifolium var. sze-
chuanicum)。本研究也支持将送春从蕙兰中移出。
如送春 ( T29 , T30 和 T34 ) 与蕙兰 ( T18 , T21 ,
865 云 南 植 物 研 究 28 卷
T23 和 T25) 在相似系数为 0 .61 水平上被分为不
同的类群中 , 前者属于 B2 亚支的 B2b1 支系 , 后
者属于 B1 亚支中的 B2b支系。
尽管 RAPD 技术自身存在某些不足 , 但已被
广泛应用于种、亚种、变种、品种或不同基因组
的亲缘演化关系和分类等方面的研究 ( Demeke
等 , 1992; Kazan等 , 1992; Susan等 , 1993) 。从
我们的结果来看 , 筛选出稳定性高、多态性好的
引物 , 且样本足够多的条件下 , RAPD 技术亦能
用于种间的相似性关系分析。本文采用 RAPD 技
术 , 进一步明确了云南兰属主要种间的相似关
系 , 特别是明确了常见的国兰中的春兰、蕙兰、
寒兰、墨兰、莲瓣兰等的亲缘关系 , 并澄清了部
分变种的归属 , 故这些结果能为兰花育种和研究
其系统发育提供一些参考价值。
〔参 考 文 献〕
刘金 4, 潘光华 . 兰花 [M ] . 北京 : 中国农业出版社 , 34—35
吴应 3祥 , 1993 . 中国兰花 ( 第 2 版 ) [M ] . 北京 : 中国林业出版
社 , 26—64
陈俊 4愉 , 2001 . 花卉品种分类 [ M] . 北京 : 中国林业出版社
陈心 3启 , 1999 . 兰科 , 中国植物志 ( 第 18 卷 ) [ M ] . 北京 : 科
学出版社 , 191—227
陈璋 4, 2004 . 大花蕙兰 [ M] . 北京 : 中国林业出版社
潘光 4华 , 潘蕾 , 2003 . 云南名兰宝鉴 [M ] . 海口 : 海南出版社
Chen ?SC (陈心启 ) , Liu ZJ (刘仲健 ) , 2003 . Critical notes on some
taxa of Cymbidium [ J ] . Acta Phytotax Sin ( 植物 分类学报 ) ,
41 ( 1) : 79—84
Doyl ?e JJ , Doyle JL , 1987 . A rapid DNA isolation procedure for small
quantities of fresh leaf tissue [ J ] . Phytochem Bull , 19 : 11—15
Du P 5uy D, Cribb P, 1988 . The Genus Cymbidium [ M ] . London,
Portland, Oregan: Christophor HelmTimber Press, 1—204
Deme ;ke T, Adama RP, Chibbar R , et al , 1992 . Potential taxonomic
use of random amplified polymorphic ( RAPD ) : A case study in
Brassica [ J ] . Theor Appl Genet, 84 : 990—994
Grün ?anger P , Caporali E , Marziani G, et al , 1998 . Molecular
(RAPD) analysis on Italian taxa of the Ophrys bertolonii aggregate
( Orchidaceae) [ J ] . Plant System Evol , 212 (3 - 4 ) : 177—184
Kaza ?n K , Manners JM, Cameron DF , et al , 1992 . Genetic relation-
ships and variation in the Stylosanthes guianensis species complex as-
sessed by random amplified polymorphic DNA [ J ] . Genome, 36
( 1) : 43—49
Lian ?g HJ ( 梁红健 ) , Liu M (刘敏 ) , Zhong ZY ( 钟志宇 ) , et al ,
1996 . Identification and classification of Chinese Cymbidium with
RAPD [ J ] . Acta Hort Sin (园艺学报 ) , 23 (4 ) : 365—370
Lian ?g HJ ( 梁红健 ) , Liu M (刘敏 ) , Zhang CH ( 张纯花 ) , et al ,
1997 . Chinese Cymbidium cultivars classification with leaf isozyme
polymorphism [ J ] . Acta Biolog Experimen Sin (实验生物学报 ) ,
3 ( 30) : 343—348
Susa ?n EW, Peter GI , Robert JS, 1993 . Randomamplified polymorphic
DNA (RAPD) markers for genetic analysis in Allium [ J ] . Theor
Appl Genet, 86 (4) : 497—504
Wang ?BQ (王卜琼 ) , Li ZL ( 李枝林 ) , Yu CX ( 余朝秀 ) , 2005 .
Progress on orchid breeding study [ J ] . Acta Hort Sin ( 园艺学
报 ) , 32 (3) : 551—55
Wang ?HZ ( 王慧中 ) , Wang YD ( 王 玉东 ) , Zhou XY ( 周 晓云 ) ,
et al , 2004 . Analysis of genetic diversity of 14 species of Cym-
bidium based on RAPDs and AFLPs [ J ] . Acta Biolog Experimen
Sin (实验生物学报 ) , 37 (6) : 482—486
Wang ?LM ( 王 利民 ) , Wang SQ ( 王 四清 ) , Yang YF ( 杨 玉锋 ) ,
2005 . Germplasmresources and breeding of orchids [ J ] . J An-
yang Institute Technol (安阳工学院学报 ) , ( 14) : 5—10
Will ?iams JG, Kubelik AR , Livak KJ , et al , 1990 . DNA polymor-
phisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers
[ J ] . Nucleic Acids Res, 18 : 6531—6535
Wu Y ?S ( 吴应祥 ) , Chen SC ( 陈心启 ) , 1980 . A taxonomic review
of the orchid genus Cymbidium in China [ J ] . Acta Phytotax Sin
( 植物分类学报 ) , 18 : 292—307
Zhan ?g MY (张明永 ) , Sun CY ( 孙彩云 ) , Hao G ( 郝刚 ) , et al ,
2000 . A preliminary analysis of phylogenetic relationships in Cym-
bidium ( Orchidaceae) based on nrITS sequencedata [ J ] . Acta Bot
Sin (植物学报 ) , 2002 , 44 (5 ) : 588—592
9656 期 程少丽等 : 利用 RAPD技术分析云南兰属部分种的种间关系