全 文 ：萱草花粉微管蛋白的体外聚合及电镜观察 ?
廖俊杰1 , 2 , 吴英杰1 , 阎隆飞1
(1 中国农业大学生物学院植物生理生化国家重点实验室 , 北京 100094;
2 广东轻工职业技术学院食品与生物工程系 , 广东 广州 510300 )
摘要 : 微管 (microtubule) 作为细胞骨架的主要成分 , 在植物体内 , 微管除决定细胞的形状
外 , 还参与很多重要的细胞功能。但有关微管蛋白生物化学的研究绝大多数来自动物脑组织
材料 , 对植物微管蛋白的研究除培养细胞外所知甚少 , 我们纯化了毫克数量的萱草 ( Hemer-
ocallis fulva L .) 花粉微管蛋白 , 利用紫杉醇作为促进剂 , 在 Mg2+ 、GTP 等存在下体外聚合成
功 , 并观察了其电镜下的形态。
关键词 : 萱草 ; 微管 ; 微管蛋白 ; 体外聚合 ; 电镜观察
中图分类号 : Q 946 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700(2005)06 - 0649 - 04
Polymerziton and Electron Microscopy of Tubulin of
Pollens from Hemerocallis fulva in vitro*
LIAO Jun-J ie
1 , 2
, WU Ying-J ie
1
, YEN Lung-Fei
1
(1 Collegeof Biological Sciences, China Agricultural University, State Key Labratory of Plant Physiology
and Biochemistry, Beijing 100094 , China; 2 Department of Food and Bio-technology,
Guangdong Light Industry Technologic College, Guangzhou 510300 , China)
Abstract: Microtubules are the components of thecytoskeleton in all eukaryotic cells . They are essential
for a widevarieties of cellular functions . Most of our knowledgeof biochemistry and pharmacologyof tubu-
lin has come fromextensive studies onmammalian brainmicrotubule systems, very little information exists
on the biochemical and pharmacological properties of plant tubulinandmicrotubules . Wedevelopedan ef-
ficient methodtoprepare enough tubulin in high purity fromday lily ( Hemerocallis fulva L .) pollen . Here
we reported the ultrastructural morphology of microtubule polymerzied by induction of tubulin taxol in the
presenceof Mg
2 +
and GTP with transmission electron microscopy .
Key words: Hemerocallis fulva; Tubulin; Microtubule; Polymerziton; Electron microscopy
微管蛋白 ( tubulin) 是所有真核生物细胞骨架蛋白的主要成分之一 , 在细胞内通过聚
合组装成中空的内径 15 nm, 外径 25 nm的微管 (microtubule, MT) 骨架 , 对维持细胞的形
状、细胞壁的构建、细胞器的运动、细胞的分裂等重要生命活动起着重要作用 ( Fosket,
云 南 植 物 研 究 2005 , 27 (6) : 649～652
Acta Botanica Yunnanica

? ?基金项目 : 国家自然科学基金资助 (39730280)
收稿日期 : 2005 - 05 - 08 , 2005 - 08 - 30 接受发表
作者简介 : 廖俊杰 (1965 - ) 男 , 副研究员 , 主要从事植物细胞研究工作。E - mail : junjie33@gdqy. edu. cn
1992)。微管的形成是自我组装的过程 , 首先发生依赖于微管组织中心 ( microtubule orga-
nizing centers, MTOC) 的成核反应 , 然后以核为基点生长 (Oakley等 , 1990) 。微管本身是
一种动态的结构 , 在与 MTOC 相连的 MT 末端 ( 正端 ) , 不断有微管蛋白组装 , 而远离
MTOC 的一端 (负端 ) , 则不断发生 MT 的解聚 , 这是微管所特有的 Treadmilling特性 , MT
两端的这种极性是遗传上所固有的 ( Hotani and Aorio, 1988 )。微管最显著的特征就是在一
定条件下既可由α, β异二聚体微管蛋白聚合形成 , 又可解聚为微管蛋白异二聚体或单体
(Margolis and Wilson, 1978; Gelfand and Bershadsky, 1991) 。Morejohn和 Fosket (1982 ) 利用
紫杉醇诱导玫瑰悬浮培养细胞微管蛋白体外聚合成微管。我们利用萱草花粉微管蛋白在
GTP、Mg2 + 存在下 , 利用紫杉醇诱导体外聚合形成了微管 , 从而证明我们纯化的微管蛋白
具有完整的生理功能。
1 材料与方法
1 .1 材料
萱草 ( Hemerocallis fulva L .) 花粉 : 采自中国医学科学院药用植物研究所及中国农业大学校园栽培的萱
草 , 将花药收集后置于 60 W灯光下照射 , 待花粉囊开裂后用分样筛收集花粉 , 干燥后贮于 - 80℃冰箱中。
1 .2 方法
萱草花粉微管蛋白的制备 : 花粉经破碎、提取制成丙酮粉后 , 重新溶解于 20 mmol?L BTP, pH 6 .8 ,
内含 0 .1 mmol?L EGTA , 0 .1 mmol?L MgCl2 , 0 . 1 mmol?L DTT, 0 . 1 mmol?L PMSF , 5μg?ml TAME 和 5μg?ml
TPCK 缓冲溶液中 , 再经硫酸铵分段盐析 , 透析后上 QAE-Sephadex A50 柱分段洗脱 , 收集 0 .8 mol?L KCl 洗
脱峰 2。再将 QAE-Sephadex A50 柱层析初步纯化的微管蛋白浓缩液上 FPLC Mono Q柱线性梯度洗脱 , 最后
得到纯化的萱草花粉微管蛋白 , - 70℃保存。
图 1 每一步纯化后的微管蛋白的 SDS-PAGE 电泳结果
1 . Sigma 标 准 蛋白 ; 2 . 丙 酮 粉法 提 取 的 花 粉 总 蛋 白 ; 3 .
40 % ～70 % 硫酸铵沉淀蛋白 ; 4～6 . 通过 QAE-Sephadex A50 柱
纯化蛋白 ; 7 . 通过 Mono Q 柱纯化蛋白
Fig . 1 SDS-PAGE of the tubulin of in each step of purification
lane 1 . Sigma Mr . standard protein; lane 2 . Total pollen proteins of
acetonepowder ; lane3 . Fraction of 40 % -70 % ( NH4 )2 SO4 precipi-
tate; lane 4-6 . Proteins obtained by QAE-Sephadex A50 column;
lane 7 . Proteins obtained by Mono Q column
?1 .2 .1 花粉微管蛋白的体外聚合 在纯化的
花粉微管蛋白溶液中加入 3 mmol?L GTP, 2
mmol?L EGTA , 4 mmol?L MgCl2 , 1 mmol?L
PMSF , 5μg?ml Leupeptin, 5μg?ml Pepstatin A ,
20μmol?L Taxol, 在 30℃恒温水浴中放置 30
min, 使微管发生体外聚合。
1 .2 .2 体外聚合微管的电镜观察 将在体外
聚合的萱草花粉微管溶液 1 滴 ( 3μl ) 铺在
180 目喷碳的 Formvar 膜铜网上 , 1 min后用滤
纸吸干 , 水洗 1 min再用滤纸吸干 , 2 %醋酸
铀负染 1 min, 灯光下烘干 , 在 JEOL-200X 透
射电子显微镜上观察微管的聚合状况。
1 .2 .3 微管蛋白的电镜观察 将纯化的微管
蛋白溶液稀释后经 20 000 r?min 4℃离心 30
min, 取 3μl 上清液铺在经特殊处理的 180 目
喷碳的 Formvar 膜铜网上 , 1 min后用滤纸吸
干 , 用 2%醋酸铀负染 1 min, 干燥后用 JEOL-
200X 电子显微镜观察微管蛋白分子的形状。
056 云 南 植 物 研 究 27 卷
2 结果与分析
2 .1 萱草花粉微管蛋白的纯化
利用萱草花粉为材料分步采用丙酮粉法、QAE-Sephadex A50 离子交换层析及 FPLC 技术
作为主要分离纯化手段 , 获得了纯化的毫克数量微管蛋白。图 1 为纯化过程的 SDS-聚丙烯
酰胺电泳结果。
从图 1 可见 , 经过 QAE-Sephadex A50 柱 , 微管蛋白得到了部分纯化 , 经凝胶扫描分析 ,
其纯度约为 66 .4%。再经过 Mono Q 柱纯化可得到电泳纯的微管蛋白样品。
2 .2 萱草花粉微管的体外聚合
向纯化的花粉微管蛋白溶液中加入 taxol、GTP、EGTA、MgCl2 使其终浓度分别为 20
μmol?L、3 mmol?L、2 mmol?L、4 mmol?L 及蛋白酶抑制剂 1 mmol?L PMSF , 5μg?ml Leupeptin,
5μg?ml Pepstatin A, 在 30℃恒温下放置 30 min, 使微管蛋白自发聚合组装成微管 , 醋酸铀
负染后电子显微镜观察结果如图 2。
图 2 萱草花粉微管蛋白体外聚合成微管的电镜照片 A : 45 000 倍 ; B : 80 000 倍
Fig . 2 Electron micrographs of microtubule polymerized in vitro from tubulin highly purefied from day lily pollen
A : 45 000 time; B : 80 000 time
图 3 萱草花粉微管蛋白分子的电镜照片
(×200 000)
Fig . 3 Electron micrographs (200 000 time) of
isolated tubulin molecules from day lily pollen
? 从电镜照片 A 上可见由微管原丝组成的微管 ,
其直经为 25 nm ( 箭头所示 )。与动植物细胞体内
微管的直径一致 , 也与紫杉醇诱导动物、植物悬
浮细胞微管蛋白体外聚合的微管结构十分相似 ,
表明它们具有相同的聚合机制。
电镜照片 B 是正在聚合的微管 , 可见原丝正
在逐渐合拢形成微管 (箭头所示 )。推测可能是原
丝形成的片状结构变宽时 , 它们折叠形成微管。
这可能为微管组装的模型之一———原丝片折叠成
微管 (Sheet folds into tube) ( Dustin, 1984) 提供了
一个佐证。
2 .3 微管蛋白的电镜观察
3μl 纯化的微管蛋白滴于铜网经醋酸铀负染
后 , 通过电子显微镜观察结果见图 3。
从图 3 可见微管蛋白呈两个球状物连在一起
1566 期 廖俊杰等 : 萱草花粉微管蛋白的体外聚合
的结构。直径约 5 nm, 可能是α、β微管蛋白的两个亚基 ( 箭头所示 )。由于未固定包埋 ,
分辩率低 , 这里所示的只是一个初步的微管蛋白鉴定结构。
3 讨论
植物花粉在萌发后 , 花粉管生长速度非常快 , 细胞质运动非常旺盛 , 是研究细胞运动
的良好材料之一。Morejohn和 Fosket (1982 ) 用悬浮培养的植物细胞微管蛋白完成了体外
聚合。我们从萱草花粉中得到电泳纯化的微管蛋白 , 在体外条件下 , 能聚合成微管 , 表明
我们纯化的花粉微管蛋白具有完整的生物学活性。同时也表明 , 花粉微管蛋白与植物细胞
脱分化产生的悬浮细胞微管蛋白具有相同的聚合机制 , 表现了遗传上的保守性。
微管蛋白体外组装成微管需要一定的条件。加入蛋白酶抑制剂 PMSF、TAME、Pepsta-
tin A、Leupeptin或乳清蛋白水解物、牛血清白蛋白等植物蛋白酶抑制剂能够抑制蛋白酶对
微管组装的破坏 ; 加入紫杉醇用来作为微管聚合的促进剂 , 一个分子的紫杉醇与一个二聚
体微管蛋白结合能够聚集微管蛋白形成“核种”, 促进微管聚合的发生 ( Shibacka and Na-
gai , 1994; Lamberf, 1993 ) , 紫杉醇稳定微管需要 GTP 的参与 ( Diaz and Andreu, 1993 ) ;
Mg2 + 可能参与微管生长的调控 (Mizuno, 1993 )。总之 , 掌握微管蛋白聚合的条件是实现
体外组装成功的先决因素。
〔参 考 文 献〕
Diaz )JF , Andreu JM , 1993 . Assembly of purified GDP tubulin into microtubules induced by taxol and taxotrer: reversibility, ligand
stoichiometry and competition [ J ] . Biochemistry, 32 : 2747—2755
Dustin P , 1984 . Microtubules 2nd [M ] . New York: Springer Verlag, 47—77
Fosk ?et DE, 1992 . Structural and functional organization of tubulin [ J ] . Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol , 43 : 201—240
Gelf ?andVI , Bershadsky AD, 1991 . Microtubule dynamics: Mechanism, regulation, and function [ J ] . Annu Rev Cell Biol , 7 :
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Hota ?ni H , Aorio T , 1988 . Dynamics of microtubules visualized by dark field microscopy treadmilling and dynamic instability [ J ] .
Cell Motil Cytoskeleton, 10 : 229—236
Lamberf AM , 1993 . Microtubale organizing centers in higher plant [ J ] . Curr Opin Cell Biol , 5 : 116—112
Mandelkow E , Mandelkow EM, 1994 . Microtubule structure [ J ] . Curr Opin Struc Biol , 4 : 171—179
Marg olis RL , Wilson L , 1978 . Opposite end assembly and disassembly of microtubules as steady state in vitro [ J ] . Cell , 13 : 1—8
Mizu no K , 1993 . Microtubule nucleation site on nuclei of higher plant cells [ J ] . Protoplasma, 173: 77—85
More john LC , Fosket DE , 1982 . Higher plant tubulin identified by self-assembly into microtubules in vitro [ J ] . Nature, 297:
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Shibacka H , Nagai R , 1994 . The plant cytoskeleton [ J ] . Curr Opin Cell Biol , 6 : 10—15
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