全 文 ：农杆菌介导的甜菜碱醛脱氢酶基因转化甘蓝的研究?
周国雁1 ,2 , 杨正安3
??
, 张应华3 , 郭凤根3 , 周晓罡1 , 2 ,
张绍松1 , 2 , 孙茂林1 ,2 , 伍少云1 , 2 , 丁玉梅1 , 2???
( 1 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所 , 云南 昆明 650223; 2 云南省农业生物技术重点实验室 ,
云南 昆明 650223 ; 3 云南农业大学园林园艺学院 , 云南 昆明 650201 )
摘要 : 为获得抗旱和耐盐性提高的甘蓝植株 , 通过农杆菌介导法将来自菠菜的甜菜碱醛脱氢酶 ( Betaine
Aldehyde Dehydrogenase, BADH) 基因导入甘蓝品系 03079 , 并采用正交设计优化影响转化效率的参数 , 建
立了甘蓝高效转化体系 , 即以侵染液为 AA 液体培养基、乙酰丁香酮 200μmol L - 1 、侵染时间 20 min、共培
养天数 2 d为最佳转化参数 , 在该条件下转化率可达 54 .26 %。转基因甘蓝植株经 PCR 检测初步说明 BADH
基因已导入甘蓝中 , Southern杂交证明 BADH基因已稳定整合到甘蓝基因组中。甜菜碱脱氢酶活性测定结
果表明 , 经过聚乙二醇 (PEG)、NaCl 和干旱处理的转基因甘蓝植株的 BADH酶的平均比活力范围在 2 .1 U
mg
- 1 ～3 .6 U mg- 1 之间 , 不同处理的转基因株系酶比活力显著高于相应的未转基因株系。膜的相对电导率
测定结果说明 , 经过 PEG、NaCl 和干旱处理的转基因植株平均相对电导率在 16 .2% ～32 .6%之间 , 耐逆境
胁迫处理后的绝大多数转基因株系相对电导率显著低于相应对照。多数转 BADH基因甘蓝植株在干旱、盐
胁迫和 PEG胁迫条件下生长势强于未转基因植株 , 表现为大多数转基因株系株高增幅显著高于对照 , 说
明 BADH 基因的导入能提高转基因甘蓝植株的抗旱和耐盐性。我们获得的抗旱和耐盐能力明显提高的转基
因甘蓝植株 , 可作为培育耐盐、抗旱甘蓝品种的种质材料。
关键词 : 甘蓝 ; 农杆菌介导法 ; BADH基因 ; 抗旱 ; 耐盐 ; 转基因植株
中图分类号 : Q 943 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2009) 04 - 335 - 09
Agrobacterium tumefaciens-mediated Transformation of Cabbage
with Betaine Aldehyde Dehydrogenase Gene
ZHOU Guo-Yan1 , 2 , YANG Zheng-An3 ** , ZHANG Yin-Hua3 , GUO Feng-Gen3 ,
ZHOU Xiao-Gang
1 , 2
, ZHANG Shao-Song
1 , 2
, SUN Mao-Lin
1 , 2
,
WU Shao-Yun
1 , 2
, DING Yue-Mei
1 , 2 ** *
( 1 Biotechnology and Germplasm Institute, Yunnan Academy of AgricultureScience, Kunming 650223 , China;
2 Key Laboratory of Agricultural Biotechnology of Yunnan, Kunming 650223 , China;
3 Collegeof Horticulture and Landscape, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201 , China)
Abstract: Cabbage ( Brassica oleraceavar. capitata) isoneof themost popular andwidely cultivated vegetable crops in the
world . In this paper, BADH ( betainealdehydedehydrogenase) gene derived fromspinachwas transformed into thegenome
of cabbageline03079 mediated by Agrobacteriumtumefaciens . To establish the ideal transformationplatform, themainfac-
torswhich affect the transformation efficiencywereoptimizedthrough the orthogonal design of L9 (34 ) , including the type
of infectionmedium, concentration of acetosyringone, theperiodof infection time and co-culture time . Theresults indicat-
云 南 植 物 研 究 2009 , 31 (4) : 335～343
Acta Botanica Yunnanica DOI : 10 .3724?SP. J . 1143 .2009.09013
?
??
??? ?通讯作者 : Author for correspondence; E-mail : ymding@163 . com
收稿日期 : 2009 - 01 - 20 , 2009 - 03 - 28 接受发表
作者简介 : 周国雁 (1982 - ) 女 , 研究实习员 , 硕士 , 主要从事作物种质资源保存与创新研究。 E-mail : yanguozhou@ 126 . com ?
杨正安与周国雁对本论文有相同贡献 ?
基金项目 : 国家自然基金项目 (30571275 ) ; 云南省自然科学基金 (2008CD125; 2006C0062M )
ed that No . 9 was the best treatment combination, i. e, AA liquidmediumwas theoptimal infection mediumfor thecabba-
ge transformation, and co-culturing for 2 days after infection (20 min) would befavorablefor thetransformation . If supple-
mented with 200μmol L - 1 acetosyringone in infection medium, the transformation efficiency would be improved and the
transformed plant regenaration ratio reached at 54 .26% . Based on this optimal transformtion system, we obtained many
transgenic plants, and PCR analysis using BADH gene primers and Southern blot analysis indicated that the BADH gene
had been integrated intogenome of cabbage . The BADH enzymes activityof transgenic plantsweretested after treated with
NaCl, drought-tolerance and PEG stress . The results showed that the average values of the activity of BADH enzymes,
which varied from2 .1 U to3 .6 U per mgin transgenic plants, were1 to3 times higher thanthat of un-transgenic plants,
andthere was a significant difference between transgenic and un-transgenic plants using Duncan′s Multiple Range Test .
Furthermore, the average value of relative electronic conductivity ( varying from 16 .2% to 32.6 % ) of transgenic plants
were significantly lower than that of un-transgenic plants, which indicated that the protection ability of membrane penetra-
tion was enhanced when BADH activity increasing and the stress resistance of thetransgenic plantswas improved by intro-
duction BADH gene into cabbage . At the same time, most of the transgenic cabbage plantswere vigrously growing under
drought 、salt and polyethylene glycol (PEG) stresses . The average height increasing percentage of transgenic plantswere
significantlyhigher than that of un-transgenic plants . Those results showed that the traits of drought or salt tolerance of
transgenic cabbage plantswere improved after transformed with BADH gene, and our transgenic plants would be used as
fundamental germplasm for stress-tolerant breeding of cabbage .
Key words: Brassica oleracea var. capitata; Agrobacterium tumefaciens-mediated; BADH gene; Drought-tolerance; Salt-
tolerance; Transgenic plant
干旱和土壤盐渍化是农作物减产的主要原
因之一 , 利用生物工程技术来培育抗旱、抗盐碱
的农作物品种被认为是解决问题的有效途径之
一。自然界中存在一些抗盐碱、抗旱植物 , 它们
在长期抵御外界干旱和盐碱胁迫环境下形成了一
定的适应机制。其中 , 最为常见的适应机制是积
累与代谢相容的渗透保护性物质 , 如多元醇类、
脯氨酸和季氨类化合物等 ( Yancey 等 , 1982 )。
植物甜菜碱是季氨类化合物的一种 , 被认为是生
物体中起无毒渗透保护作用的最主要的细胞相溶
性物质。在研究过的 150 多种代谢物中 , 甜菜碱
是最好的渗透调节剂 , 且合成途径简单 , 甜菜碱
醛脱氢 酶 ( BADH ) 是 合成 甜 菜 碱的 关 键 酶
(Hanson and Rhodes, 1983) , 甜菜碱合成酶基因是
最重要和最有希望的胁迫抗性基因之一。研究者
们已将不同来源的 BADH 基因转入烟草 ( 赵宇纬
等 , 2008) 、水稻 (Sakamoto and Murata, 1998; 刘
凤华等 , 1997 )、大麦 ( Ishitani 等 , 1995 )、小麦
(郭北海等 , 2000 ) 、番茄 ( J ia等 , 2002 )、豆瓣
菜 (李银心等 , 2000) 等作物中 , 得到了抗旱耐
盐能力提高的转 基因植株。最 近 , 罗晓 丽等
(2007 ) 将来源于山菠菜的 BADH 基因导入棉花
提高了其抗冻耐逆能力。胡冬南等 (2008) 证明
转 BADH 基因美丽胡枝子在 NaCl 胁迫下能积累
较多的甜菜碱。韩德俊等 ( 2007) 将来自山菠菜
的 BADH 基因导入甘蓝型油菜 ( Brassica nupas
L .) , 表明转化体植株的 BADH 酶活性明显高于
对照。
甘蓝 ( Brassica oleracea L . var. capitata L .)
属十字花科芸薹属植物 , 是广泛种植的一种重要
蔬菜 , 全国种植面积约 80 万公顷 , 是栽培最多
的蔬菜之一 ( 刘英和王超 , 2006 )。甘蓝根系较
浅 , 外叶多 , 水分蒸发量大 , 需水多 , 若在整个
生育期中遇到干旱或盐胁迫 , 会导致其产量和品
质的下降。本研究利用含菠菜 BADH 基因的植物
表达载体 , 采用农杆菌介导法将 BADH 基因导入
甘蓝 , 以期获得抗旱或耐盐性增强的甘蓝转基因
植株 , 为今后培育耐盐、抗旱甘蓝品种提供新种
质材料。
1 材料和方法
1 .1 实验材料、菌株和基因质粒
供试材料为甘蓝品系 03079 , 由西南大学园艺园林
学院提供。根癌农杆菌 ( Agrobacterium tumefaciens) 菌株
为 LBA4404 , 由本实验室保存 ; 含有 BADH 基因的转化
载体 pBIBB由甘肃农业大学张宁博士惠赠 , 在通用植物
表达载体 pBI121 基础上构建完成 , 筛选标记基因为卡那
霉素抗性基因。含 pBIBB 的农杆菌单菌落于 LB 液体培
633 云 南 植 物 研 究 31 卷
养基中过夜培养 , 以 1∶100 稀释培养 4 h, 达到对数生长
期后用于转化。
Taq酶和 DNA Marker购自 TIANGEN 公司 ; 引物由上
海生物工程公司合成 ; 6-BA、α-NAA、甜菜碱醛购自 Sig-
ma公司 ; 羧苄青霉素 ( Carb) 和卡那霉素 (Kan) 购自
Amersco公司 ; 其他常规化学试剂均为国产分析纯试剂。
1 .2 农杆菌法甘蓝高效遗传转化体系的建立
在无菌条件下用 0 .1 %升汞处理甘蓝种子 10 min, 接
于 MS0 培养基 (无任何添加物 ) 上 , 暗培养 7 d, 切取下
胚轴用于转化。采用正交设计法研究影响转化效率的各
种转化参数 (乙酰丁香酮浓度、侵染培养液选择、侵染
时间和共培养天数 ) 对甘蓝抗性芽分化率的影响 , 确定
最佳的转化参数。不同转化参数指标构成了四因素三水
平 L9 ( 34 ) 正交设计 , 共有 9 个处理 , 每个处理设 3 次
重复 , 具体方案见表 1、2。
转化率计算 : 转化率 = 分化的抗性外植体数?接种外
植数 100%
方差分析 : 运用 DPSv3 .01 专业版统计软件 , 对不同
处理间形成的转化率进行方差分析。
1 .3 转基因抗性植株的筛选和再生
经侵染后的下胚轴接种在筛选培养基上 , 筛选培养
基为 MS+ BA 3 mgL - 1 + NAA 0 .05 mgL - 1 + Kan50 mgL - 1
+ Carb 250 mg L - 1 + 蔗糖 30 g L - 1 + 琼脂粉 8 g L - 1 ,
pH5 .8。将每个处理材料置于 25℃培养箱中培养 , 每天
光照 10～12 h, 光强为 37 .5μmol m- 2 s- 1 , 经常观察外植
体的变化 , 5 周后统计分化的抗性外植体数。
1 .4 转基因初筛植株的生根和定植
当转基因初筛苗长到 4～5 cm时在超净工作台内选
取分化较好、生长健壮的甘蓝抗性芽进行分株 , 于生根
培养基 (MS+ NAA 0.02 mgL - 1 + Carb 250 mgL - 1 + 蔗糖 30
gL - 1 + 琼脂粉 8 gL - 1 pH5 .8) 内生根 , 置于 23℃培养箱
中培养 , 每天 10～12 h光照 , 待苗长到约 10 cm高时进行
练苗 , 打开瓶盖 2～3 d后 , 洗净培养基 , 定植于温室。
1 .5 转基因植株的 PCR 检测
用 CTAB 法 (Scott and Arnold, 1985) 提取转基因卡
那抗性植株 DNA , 未经转化植株作阴性对照 , 进行 PCR
检测。根据 BADH 基因序列 , 设计引物 B1: ATGGCGT-
TCCCAATTCCTGC 和 B2: AGTCAAGGAGACTTGTACC。以
未转化植株作阴性对照 , 质粒 pBIBB 作阳性对照 , PCR
反应体系的总体积为 25μl , ddH2 O 17μl , 10×buffer 2 .5
μl , 2 . 5 mmol L - 1 , dNTP 2μl , 10 mmmol L - 1 引物 1 0.5μl,
Taq酶 0 .5μl, 模板 DNA 2μl。PCR 扩增程序为 95℃ , 3
min; 94℃ , 1 min; 52℃ , 1 min; 72℃ , 2 min, 34 个循
环 ; 72℃延伸 10 min。取反应产物 10μl 进行电泳检测。
1 .6 Southern杂交检测
参照朱华晨等 (2004) 的方法 , 结合 Roche公司 DIG
High Prime DNA Libeling and Detection Starter Kit I 使用手册
进行 , 有部分改进 : (1 ) 凝胶转膜采用 JY-SCZ2 型垂直
电泳槽进行 ; (2) 使用地高辛非放射性检测系统取代放
射性检测。
表 1 甘蓝转化参数因子和水平设计表
Table 1 The design of three levels of different factors for cabbage transformation
水平
Level
A (侵染液类型 )
Typeof infection medium
B (乙酰丁香酮浓度 )
Concentration of Ace (μmol L - 1 s)
C (侵染时间 )
Infection time ( min)
D ( 共培养天数 )
Co- infection time ( d)
1 ?MS0 0 10 2 r
2 ?MS + BA 3 ?mg L
- 1 +
NAA 0 i. 05 mg L - 1
100 20 3 r
3 ?AA 200 30 4 r
表中 AA 侵染液成分参见 Hiei 等 (1994) The formula of AA medium is described as Hiei (1994 )
表 2 甘蓝转化参数 L9 ( 34 ) 正交试验设计表
Table 2 The orthogonal design L9 (34 ) of factors for cabbage transformation
因子 Factor
处理 Treatment
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ Ⅸ
A MS0 ?MS0 MS0 ?MS + BA 3 + NAA 0 .05 MS + BA 3 + NAA 0 2.05 MS + BA 3 M+ NAA 0 f.05 AA AA AA
B (μmol L - 1 x) 0 ?100 200 ?0 100 m200 0 |100 200
C ( min) 10 ?20 30 20 ?30 Z10 30 10 20
D ( d) 2 ?3 4 4 2 H3 |3 4 2
表中因子 A 代表侵染液类型 , B 为乙酰丁香酮浓度 , C 为侵染时间 , D 为共培养天数。下同
Thefactor A meanstypeof infection medium, B is the concentration of acetosyringone, C is infection time, and D represents co-culture time in Agrobacteri-
ummediated transformation of cabbage . The same as following
7334 期 周国雁等 : 农杆菌介导的甜菜碱醛脱氢酶基因转化甘蓝的研究
1 .7 转基因甘蓝生理生化指标测定
1 .7 .1 转基因甘蓝甜菜碱醛脱氢酶酶活性测定 测定
Southern检测为阳性的转基因株系植株 , 取耐胁迫处理后
的转基因甘蓝植株和未转基因植株叶片 2 g, 磨碎后加 3
ml蛋白提取液 (50 mmol L - 1 Tris-HCl ( pH8.0) + 1 mmol
L - 1 EDTA + 5 mmol L - 1 DTT) , 静置 15 min, 在 4℃下 12 000
r min
- 1 离心 10 min。甜菜碱醛脱氢酶酶活性反应总体积
为 400 μl , 含 有蛋 白 提取 液 ( 200 mmol L - 1 Tris-HCl
(pH8 .0)、4 mmol L - 1 EDTA、20 mmol L - 1 DTT) 75μl、10
mmol L - 1 甜菜碱醛 40μl、10 mmol L - 1 NAD 40μl、100μl 粗
蛋白及 H2 O 145μl。以煮沸 5 min 的酶提取液为空白对
照 , 反应在 37℃下进行 , 时间 10 min, 紫外分光光度计
340 nm处比色测定。上述条件下每分钟消耗 1 nmol L - 1
NAD为 1 个酶活力单位 U , 比活力为每毫克蛋白质中所
含的酶活力单位 (U mg- 1 )。
1 .7 .2 转基因植株相对电导率的测定 测定 Southern
检测为阳性的转基因株系植株 , 称取耐胁迫处理后的转
基因甘蓝植株和未转基因植株叶片 0 .2 g, 加 5 ml 超纯
水。每株准备两等份 , 一份于 25℃ , 100 r min- 1 振荡 4 h,
测定的电导率读数定为 Rc′; 另一份于沸水浴中加热 30
min, 测定的电导率读数定为 Rc。相对电导率按以下公
式计算 : 相对电导率 ( % ) = (Rc′?Rc)×100%。
1 .8 转基因植株抗旱性和耐盐性鉴定
定植的转基因苗和对照的株高 (Southern检测为阳性
的株系) 在 15～20 cm时 , 进行胁迫处理 , 转基因株系和
对照均取 3 个植株的平均值 , 每个株系设 3 次重复。第 1
组为不浇水干旱胁迫 , 处理 10 d; 第 2 组为盐胁迫 , 用
NaCl 溶液浇灌植株 , 浓度从 50 mmol L - 1 开始 , 每天提高
50 mmol L - 1 , 处理 10 d后至终浓度 500 mmol L - 1 ; 第 3 组
为 PEG-6000 模拟的干旱胁迫 , 连续 10 d用 15%PEG浇灌。
未转基因植株也同时处理。处理前测定株高 , 胁迫处理
10 d后测定相应株号的株高 , 对比得出株高增长数据 , 用
株高增长百分率表示植株生长情况 , 同时测定转基因苗
和对照正常管理 (每天浇水) 10 d后的株高增长数据。
2 结果与分析
2 .1 农杆菌法甘蓝高效转化体系的建立
为了探明转化参数对甘蓝转基因转化效率的
影响 , 我们进行了优化转化参数的正交试验设
计 , 不同处理的下胚轴接种在筛选培养基中约 2
周后开始白化 , 同时有分化能力的下胚轴先形成
米粒大小的绿色愈伤组织 , 3 周后有绿色芽点产
生 , 4～5 周可分化出抗性芽 , 而非转化甘蓝苗
发生白化 , 最后死亡。不同处理分化直观结果见
图 1 , 正交试验统计结果见表 3 , 正交试验直观
分析结果和 SSR 检验统计分析结果见表 4 , 5。
表 3 表明所有参试的处理均有抗性芽生成 , 不同
处理转化率在 24 .17%～54 .26%之间 , 其中Ⅸ号
处理的甘蓝转基因的平均转化率最高 , 达到了
54 .26% , 是其它处理的 1.4～2 .2 倍。以Ⅸ号为
最佳处理 , 以侵染液为 AA 培养基、乙酰丁香酮
200μmol L - 1 、侵染时间 20 min、共培养天数 2 d
为甘蓝高效转化体系的优化转化参数。
从表 4 可看出 , A 因素中 A3 的转化率最高 ,
B 因素中 B3 的转化率最高 , C 因素中 C2 的转化
率最高 , D 因素中 D1 的转化率最高 , 将各因素
的最 优 水平 结 合 在 一起 预 测 出最 优 处 理 为
A3 B3 C2 D1 , 即侵染液为 AA 培养基、乙酰丁香酮
200μmol L - 1 、侵染时间 20 min、共培养天数 2 d
为最佳甘蓝转基因获得高效转化体系的优化转化
参数 , 与实际试验的优处理相符。根据极差 R
的大小排列出各因子的影响主次顺序为 C > A >
B > D, 即侵染时间对转化率的影响最大 , 侵染
液类型影响次之 , 乙酰丁香酮和共培养天数的影
响最小。通过对各处理间差异显著性 SSR 检验 ,
表 3 甘蓝转化参数 L9 (34 ) 正交试验统计结果
Table 3 The results of the orthogonal design L9 ( 34 ) of factors for cabbage transformation
处理
Treatment
外植体数
Number of explants
i ii iii
分化的抗性外植体数
Number of differentiation of resistance explants
i ii iii
平均转化率 ( % )
The average transformation rate
Ⅰ 40 m40 ?42 O15 6 ?14 28 .61
Ⅱ 50 m62 ?62 O9 22 ?22 29 .66
Ⅲ 45 m42 ?56 O11 11 ?19 28 .19
Ⅳ 44 m41 ?30 O19 14 ?11 38 .00
Ⅴ 41 m42 ?39 O6 19 ?14 31 .92
Ⅵ 40 m39 ?49 O16 10 ?12 30 .04
Ⅶ 44 m41 ?43 O15 18 ?15 37 .63
Ⅷ 38 m41 ?51 O14 9 ?7 q24 .17
Ⅸ 45 m51 ?36 O27 17 ?25 54 .26
833 云 南 植 物 研 究 31 卷
图 1 正交试验设计 9 个处理甘蓝转基因抗性苗分化情况
Fig . 1 Regeneration of antibiotic-resistant shoots of cabbage by the orthogonal design in selection medium
表 4 甘蓝转化参数 L9 ( 34 ) 正交试验直观分析结果
Table 4 Thevisual analysis of theorthogonal design L9 ( 34 ) of different factors for the cabbage transformation
因子
Factor
总和 sum
水平 1 ;
level 1
水平 2 ?
level 2
水平 3 o
level 3
均值 average
水平 1 2
level 1
水平 2
level 2
水平 3 f
level 3
极小值
minimum
极大值
maximum
极差 R
margin R
调整 R’
adjustment R′
A 86 ?. 46 99 T. 96 116 ?. 06 28 .82 33 K. 32 38 .69 28 .82 38 k. 69 9 .87 8 .89
B 104 ?. 24 85 T. 75 112 ?. 49 34 .75 28 K. 58 37 .50 28 .58 37 k. 50 8 .91 8 .03
C 82 ?. 82 121 g. 92 97 .74 27 .61 40 K. 64 32 .58 27 .61 40 k. 64 13 ?. 03 11 .74
D 114 ?. 79 97 T. 33 90 .36 38 .26 32 K. 44 30 .12 30 .12 38 k. 26 8 .14 7 .33
Ⅸ处理和其余处理差异差均达到了显著水平 ; 处
理Ⅸ的甘蓝转基因转化率 54 .26%最高 , 和Ⅷ处
理组合比较 , 差异达到极显著水平 ( 表 5 )。
2 .2 ?转基因甘蓝植株 PCR 检测和 Southern-blot
分析
用 BADH 基因两端引物 , 将 200 株甘蓝卡那
抗性植株进行 PCR 扩增检测 , 结果有 50 株有 1 .5
kb的特异扩增带 , PCR 检测阳性率为 25.0% , 部
分抗性植株的 PCR 扩增结果见图 2。PCR 结果初
步表明 , BADH基因已整合到甘蓝基因组中。
提取 PCR 检测为阳性的转化植株的 DNA ,
分别用 Sac I 进行酶切 9 h以上 , 电泳分离后进
行 Southern 杂交。图 3 结果显示 , 阴性对照、2
号 , 3 号株系没有出现杂交信号 , 阳性对照和 Kan
9334 期 周国雁等 : 农杆菌介导的甜菜碱醛脱氢酶基因转化甘蓝的研究
表 5 甘蓝转化参数不同处理组合 SSR 检验
Table 5 SSR analysis of different treatment of factors of cabbage transformation
处理 Treatment Ⅸ Ⅳ Ⅶ Ⅴ Ⅵ Ⅱ Ⅰ Ⅲ Ⅷ
均值 average 54 ?. 26 38 .00 37 t. 63 31 7. 92 30 . 04 29 .66 28 .61 28 C. 19 24 ?. 17
P < 0 z. 05 a ab ab b b b b b b
P < 0 z. 01 A AB AB AB AB AB AB AB B
P < 0 .05 表示 5 %显著水平 ; P < 0 .01 表示 1 %显著水平。
P < 0 .05 means significant level at 5 % ; P < 0 .01 represents very significant level at 1 % .
图 2 甘蓝转基因植株的 PCR 检测
M : DNA 标准分子量 ; 1 . 质粒阳性对照 ;
2 . 未转化植株 ; 3～12 . 阳性植株
Fig . 2 Confirmation of the transgenic cabbage plants by PCR amplification
M : DL2000 marker; 1 . plasmid pBIBB; 2 . untransformed
plants; 3-12: transgenic plants
图 3 转 BADH 基因植株的 Southern杂交
-CK . 未转化植株 ; 1～6 . PCR 阳性植株 ; + CK . 质粒对照
Fig . 3 Southern bloting analysis of BADH gene
in transgenic plants
-CK . untransformed plants; 1-6 . PCR-positive plants;
+ CK . plasmid pBIBB
抗性的 1 号 , 4 号、5 号、6 号株系出现了一条
杂交带 ( 4 号杂交信号相对较弱 ) , 说明目的基
因 BADH 已稳定整合到 1、4、5 号和 6 号 4 个株
系的基因组中 , 并且是单拷贝插入。
2 .3 转基因甘蓝生理生化指标测定结果
2 .3 .1 转基因甘蓝甜菜碱醛脱氢酶酶活性测定
为了检测外源 BADH 基因在甘蓝中的表达情
况 , 对干旱盐碱胁迫的受试植株进行 BADH 酶活
性测定 , 并对株系间酶活性差异进行显著性检验 ,
结果如表 6。可以看出 , 经过 PEG、NaCl 和干旱
处理的转基因植株的 BADH 酶平均比活力范围在
2.1 U mg- 1 ～3.6 U mg- 1 之间 , 不同处理的转基因
株系酶比活力与相应的未转基因株系差异均达到
了显著水平 , PEG 和干旱处理的不同株系之间酶
活性差异较大 , 而 NaCl 处理的转基因株系间的酶
活性无显著差异。这说明转基因甘蓝在受到逆境
胁迫时 , 能促进 BADH 基因的表达 , 合成更多甜
菜碱脱氢酶 , 从而提高植株的抗盐和耐旱能力 ,
但不同的胁迫处理和不同株系中的 BADH 表达量
存在差异。此外 , 未转基因植株中的 BADH 酶的
比活力范围在 1.3 U mg- 1 ～1.6 U mg- 1 左右 , 甘蓝
本身含有内源的 BADH基因 , 但活力较低。
2 .3 .2 甘蓝转基因植株相对电导率测定结果
相对电导率测定结果及差异显著性分析见表
7 , 经过 PEG、NaCl 和干旱处理的转基因植株平
均相对电导率在 16 .2%～32 .6%之间 , 而未转基
表 6 转基因甘蓝 BADH 酶活性测定
Table 6 The results of the BADH enzyme activity assay of transgenic cabbage
处理 Treatment TBC1 ?TBC2 TBC3 9TBC4 wTBC5 WT Un-transgenic line P
PEG 2 ?. 3±0 .10c 2 ?. 3±0 .35c 3 L. 7±0 .21a 2 .9±0 I. 10b 3 .6±0 . 26a 1 .6±0 @. 10d < 0 G. 001
NaCl 3 ?. 5±0 .20a 3 ?. 6±0 .23a 3 L. 6±0 .12a 3 .1±0 K. 15a 3 .0±0 . 23a 1 .3±0 @. 15b < 0 G. 001
不浇水 Drought 2 ?. 8±0 .15b 2 ?. 5±0 .10bc 2 L. 1±0 .21c 3 .0±0 G. 10ab 3 .5±0 . 15a 1 .4±0 @. 26d < 0 .001
表中数据为 3 个重复的平均值±标准误 ; 采用 Duncan 法比较 , 不同字母表示在 5 % 水平上差异显著 ; 下同
Thedatawere the means±SE of 3 separate measurements . Different letters mean significant at 5 % level using Duncan′s Multiple Range Test . The same
as following .
043 云 南 植 物 研 究 31 卷
表 7 甘蓝转基因植株相对电导率测定结果
Table 7 The results of the relative electronic conductivity of transgenic cabbage
处理 Treatment TBC1 ?TBC2 TBC3 9TBC4 wTBC5 WT Un-transgenic line P
PEG 24 ?. 6±2 .22bc 25 ?. 4±0 .92bc 27 \. 4±0 .52b 28 .1±1 [. 45b 22 .2±0 .80c 50 .0±0 T. 47a < 0 G. 001
NaCl 16 ?. 3±1 .31c 24 ?. 5±0 . 89b 22 \. 4±1 .50b 23 .4±1 [. 39b 21 .4±1 .55b 51 .0±2 T. 18a < 0 G. 001
不浇水 Drought 16 ?. 2±0 .61c 23 ?. 5±1 . 39b 32 ^. 6±1 . 44a 20 .2±2 \. 43bc 20 .7±2 .58bc 31 . 1±2 X. 5a < 0 G. 001
表 8 转基因甘蓝抗旱及耐盐性胁迫株高增长百分率
Table 8 The results of plant height increasing percentageof transgenic cabbage at drought and salt tolerances
处理 Treatment TBC1 ?TBC2 TBC3 9TBC4 wTBC5 WT Un-transgenic line P
PEG 4 ?. 5±0 .60a 4 ?. 5±0 .50a 0 L. 0±0 .03c 4 .0±0 K. 36a 2 .0±0 .46b 1 n. 0±0 /. 29bc < 0 G. 001
NaCl 10 ?. 0±1 .41a 5 ?. 0±0 .50b 5 J. 3±1 .52b 5 .5±0 I. 79b 7 .2±0 .40b 1 . 2±0 B. 20c < 0 G. 001
不浇水 Drought 4 ?. 0±0 .58a 1 ?. 2±0 .38b 1 J. 0±0 .25b 5 .0±0 K. 46a 2 .0±0 .38b 1 .5±0 @. 29b < 0 G. 001
正常生长
Normally growth
8 T. 9 8 ?. 0 7 .1 8 ?. 5 8 L. 8 9 .0 ———
因植株相对电导率在 31 .1%～51 .0%之间 , 经过
PEG、NaCl 处理的转基因株系相对电导率显著低
于相应对照 , 而干旱处理后除株系 3 外 , 其余转
基因株系相对电导率与对照差异达显著水平 , 说
明转 BADH基因甘蓝在受盐碱和干旱胁迫时 , 大多
数植株能合成较多的甜菜碱来维持细胞正常渗透
压 , 使细胞膜损害程度降低 , 反映为相对电导率
低 , 植株抗旱耐盐性较对照有所提高。而不同株系
间的相对率差异较大 , 耐胁迫能力也存在差异。
2 .4 甘蓝转基因植株株高增长鉴定结果
5 个转基因株系和对照在正常生长状态下 ,
10 d后的株高增幅在 7 .1%～9 .0%之间 , 而逆境
胁迫下 , 转基因株系和对照植株生长均受到抑
制。但在干旱胁迫、盐胁迫和 PEG 胁迫下 , 大
多数转基因株系株高增幅显著高于对照 , 甘蓝生
长状态比未转基因甘蓝植株良好 , 说明 BADH 基
因的导入确实提高了转基因植株的抗旱耐盐性。
需要说明的是 , 由于株高增幅是一个综合指标 ,
影响株高增幅的因素较多 , 出现了转基因株系与
对照差异不显著的情况。
3 讨论
在高等植物中 , 甜菜碱的合成途径相对简
单 , 主要包含两步氧化反应 , 涉及到由胆碱单加
氧酶 ( CMO) 催化胆碱形成甜菜碱醛 , 而后由甜
菜碱醛脱氢酶 ( BADH) 催化形成甜菜碱 , 其中
BADH是合成甜菜碱的关键酶。 BADH 基因被认
为是植物耐盐抗旱基因工程中的有效基因 , 广泛
用于植物的耐盐转基因研究。韩俊德等 ( 2007)
将来源于山菠菜的 BADH 基因导入同属作物的甘
蓝型油菜 ( Brassica nupas L .) 中 , 得到耐 100
mmol L
- 1
NaCl 的转 基因 植株。Bhattacharya 等
(2004 ) 已经将来源于大肠杆菌的 BADH 基因转
化到甘蓝的栽培品种‘Golden Acre’中 , 提高了
植株的耐盐能力 , 获得的转基因甘蓝能在 NaCl
浓度为 300 mmol L - 1 的条件下生长。本研究利用
来自菠菜的 BADH 基因增强了甘蓝的抗旱耐盐能
力。可见 , 不同来源的 BADH 基因可以在甘蓝中
得到表达 , 异源转基因的方式可以应用于甜菜碱
醛脱氢酶抗旱耐盐基因工程。
十字花科芸薹属作物的遗传转化研究已取得
重大进展 , 但在甘蓝遗传转化中存在转化率低、
有假阳性植株等问题 , 如何大幅度提高转化率是
利用基因工程进行遗传改良的关键问题。在前人
的研究中 , 遗传转化体系的优化大都集中在农杆
菌种类、菌液浓度、外植体的预培养时间、农杆
菌侵染时间、共培养时间等几个因素 , 很少涉及
侵染液类型这一因子 , 本实验的研究结果表明 ,
除共培养时间外 , 侵染液类型是对转化效率影响
较大的因素。AA 侵染液在植物基因工程中应用
首见于对水稻的遗传转化 ( Hiei 等 , 1994 )、 ( 翟
文学等 , 2000 ) , 我们将它运用于甘蓝后 , 可明
显提高转化效率 , 其抗性植株再生率最高达到了
54 .26% , 由于 AA 培养基含有多种氨基酸 , 可
能促进了农杆菌和甘蓝下胚轴生长。此外 , 酚类
物质可以诱导农杆菌 vir 基因的活化 , vir 基因的
1434 期 周国雁等 : 农杆菌介导的甜菜碱醛脱氢酶基因转化甘蓝的研究
表达控制着 T-DNA 的转移。本研究中 , 在甘蓝
转化侵染时添加乙酰丁香酮是农杆菌介导的甘蓝
转化率提高的一个因素 , 以乙酰丁香酮 200μmol
L
- 1 为最适浓度。张宁等 ( 2004 ) 和梁慧敏等
(2005) 的研究也表明 , 菌液中加入乙酰丁香酮
能提高转化率。
本研究通过 PCR 和 Southern杂交分子检测 ,
证明 BADH 基因已整合到甘蓝基因组中。转基因
株系中的 BADH 酶比活力显著高于野生型植株 ,
在未转基因的甘蓝植株中也检测到 BADH 酶活
性 , 这可能与其本身含有内源 BADH 基因有关 ,
在余爱丽等 ( 2005) 的研究中 , 在 16 种植物的
18 个甜菜碱醛脱氢酶基因的系统进化树中 , 有
十字花科的作物含有此基因 , 十字花科甘蓝属作
物也可能含有内源的 BADH 基因 , 受试植株由于
经过干旱和盐碱胁迫后自身会产生甜菜碱再加上
导入外源 BADH, 这时甜菜碱会超量积累 , 作为
渗透调节物质发挥功能 , 也作为细胞的酶和蛋白
质的保护物质发挥其非渗透调节功能 , 这样双效
功能增强了转化植株的抗逆能力。同时 , 绝大多
数转基因株系相对电导率显著低于野生型植株 ,
经过逆境胁迫的转基因植株膜损伤小于未转基因
植株 , 多数转基因株系的生长势强于野生型植株。
本研究通过正交设计优化了农杆菌法甘蓝最
佳的转化参数 , 证明侵染时间对转化率影响最
大 , 侵染液次之 , 乙酰丁香酮和共培养天数的影
响最小 , 为利用农杆菌法将其它基因导入甘蓝提
供了有价值的参考。同时 , 本文通过 BADH 基因
的转化 , 创造了抗旱耐盐能力提高的甘蓝新种
质 , 为培育抗旱耐盐新品种奠定了材料基础。我
们已将 Southern杂交阳性且抗旱耐盐性增强的甘
蓝植株移植大田 , 收获了 T1 代种子 , 下一步将
进行 T1 代植株的遗传稳定性和抗性检测。
致谢 甘肃农业大学张宁博士惠赠的转化载体 pBIBB;
西南大学宋洪元博士提供高分化率的甘蓝品系 03079。
〔参 考 文 献〕
Bhat ?tacharya RC, Maheswari M, Dineshkumar V et al. , 2004 . Transfor-
mation of Brassica oleracea var. capitata with bacterial betA gene en-
hances tolerance to salt stress [ J ] . Scientia Horticulturae, 100:
215—227
Guo ?BH ( 郭北海 ) , Zhang YM ( 张艳敏 ) , Li HJ ( 李洪杰 ) et al. ,
2000 . Transformation of wheat with a gene encoding for the betaine
aldehyde dehydrogenase ( BADH ) [ J ] . Acta Botanica Sinica ( 植物
学报 ) , 42 ( 3) : 279—283
Han ?JD ( 韩德 俊 ) , Chen YF ( 陈 耀锋 ) , Li CL ( 李 春莲 ) et al. ,
2007 . Agrobacterium mediated transformation with a gene encoding
for betaine aldehydedehydrogenase (BADH) in Brassica napus [ J ] .
Agricultural Research in theArid Areas (干旱地区农业研究 ) , 25
( 4) : 6—11
Hans ?on AD, Rhodes D, 1983 . 14 C Tracer evidence for synthesis of cho-
line and betaineviaphosphoryl base intermediates in salinized sugar-
beet leaves [ J ] . Plant Physiology, 71 : 692—700
Hiei ?Y , OhtaS, Komari T et al. , 1994 . Efficent transformation of rice ( Ory-
za Sativa L .) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the
boundaries of the T-DNA [ J ] . Plant Journal , 6 (2) : 271—282
Hu D ?N (胡冬南 ) , Chen XY (陈晓阳 ) , Li W ( 李伟 ) et al. , 2008 .
Transformation of Lespedeza formosa with BADH gene mediated by
Agrobacterium tumefaciens [ J ] . Scientia Silvae Sinicae ( 林 业科
学 ) , 44 ( 3) : 76—80
Ishi ?tani M, Nakamura T, Han SY et al. , 1995 . Expression of thebetaine
aldehyde dehydrogenase gene in barley in response to osmotic stress
and abscisic acid [ J ] . Plant Molecular Biology, 27 : 307—315
J ia ?GX , Zhu ZQ, Chang FQ et al. , 2002 . Transformation of tomato with
the BADH gene fromAtriplex improves salt tolerance [ J ] . Plant Cell
Reports, 21 : 141—146
Li Y ?X ( 李银心 ) , Chang FQ ( 常 凤启 ) , Du LQ ( 杜 立群 ) et al. ,
2000 . Genetic transformation of watercress with a gene encoding for
betaine-aldehyde dehydrogenase ( BADH ) [ J ] . Acta Botanica Sinica
( 植物学报 ) , 42 (5 ) : 480—484
Lian ?g HM ( 梁慧敏 ) , Xia Y (夏阳 ) , Sun ZX (孙仲序 ) et al. , 2005 .
Establishment of genetic transformation systemof Medicago safiva me-
diated by Agrobacterium tumefaciens [ J ] . Journal of Agricultural
Biotechnology ( 农业生物技术学报 ) , 13 ( 2) : 152—156
Liu ?FH (刘凤华 ) , Guo Y ( 郭岩 ) , Gu DM ( 谷冬梅 ) et al. , 1997 .
Salt toleranceof transgenic plants with BADH cDNA [ J ] . Acta Ge-
netica Sinica ( 遗传学报 ) , 24 : 54—58
Liu ?Y (刘英 ) , Wang C (王超 ) , 2006 . Brief description theorigin and
classification of Cabbage ( Brassica oleracea) [ J ] . Northern Horticul-
ture (北方园艺 ) , 4 : 57
Luo ?XL (罗晓丽 ) , Xiao JL (肖娟丽 ) , Wang ZA ( 王志安 ) et al. ,
2008 . Overexpression of spinacia oleracea betaine aldehyde dehydro-
genase ( SoBADH ) gene confers the salt and cold tolerant in Gossypi-
um hirsutumL . [ J ] . Chinese J ournal of Biotechnology ( 生物工程
学报 ) , 24 ( 8) : 1464—1469
Saka ?moto A , Murata NA, 1998 . Metabolic engineering of rice leading to
biosynthesis of glycinebetaine and tolerance to salt and cold [ J ] .
Plant Molecular Biology, 38 : 1011—1019
Scot ?t OR , Arnold JB, 1985 . Extraction of DNA from milligram amounts
of fresh herbarium and mummified plant tissues [ J ] . Plant Molecular
Biology, 5 : 69
243 云 南 植 物 研 究 31 卷
Yanc +ey PH , Clark ME, Hand SC et al. , 1982 . Living withwater stress:
Evolution of osmolyte systems [ J ] . Science, 217: 1214—1222
Yu A 6L (余爱 丽 ) , Yao W ( 姚 伟 ) , Zhou H ( 周会 ) et al. , 2005 .
Cloning and sequencing of BADHI gene from Sorghum vulgare [ J ] .
Journal of Agriculturial Biotechnology (农业生物技术学报 ) , 13
(2 ) : 256—257
Zhai *WX ( 翟文学 ) , Li XB ( 李晓兵 ) , Tian WZ ( 田 文忠 ) et al. ,
2000 . Regeneration of fiveChinesericevarietiesafter trans-formation
of a bacterial blight resistance gene Xa21 by using Agrobacterium-
mediated system [ J ] . Science in China ( Series C) (中国科学 ( C
辑 ) ) , 30 ( 2) : 200—206
Zhan ?g N (张宁 ) , Si HJ (司怀军 ) , Li XC ( 李学才 ) et al. , 2004 . An
efficient transformation syetemof potatomediated by Agrobacteriumtu-
mefaciens [ J ] . Chinese Potato ( 中国马铃薯 ) , 18 ( 3) : 132—135
Zhao ?YW (赵宇玮 ) , Hao JG ( 郝建国 ) , Bu HY ( 步 怀宇 ) et al. ,
2008 . Cloning of HvBADH1 gene from hulless barley and its trans-
formation in Nicotiana tabacum [ J ] . Acta Agronomica Sinica ( 作物
学报 ) , 34 (7 ) : 1153—1159
Zhu ?HC (朱华晨 ) , XuXP ( 许新萍 ) , Li BJ ( 李宝健 ) , 2004 . A sim-
ple rapidmethod of southern blot analysis [ J ] . Acta ScientiarumNat-
uraliumUniversitatis Sunyatseni ( 中山大学学报 ( 自然科学版 ) ) ,
43 (4) : 128—130
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3434 期 周国雁等 : 农杆菌介导的甜菜碱醛脱氢酶基因转化甘蓝的研究