全 文 ：高粱 LEA3 蛋白基因和启动子的克隆及序列分析*
孙晓娇, 汤晓倩, 于丽霞, 白摇 琼, 鄢摇 波**
(西南林业大学园林学院, 云南 昆明摇 650224)
摘要: 根据禾本科 LEA3 基因保守序列设计简并引物, 同时结合 RACE方法获得高粱 LEA3 基因全长 cDNA
序列 1 032 bp, 该序列含有一个 612 bp的阅读框, 编码 203 个氨基酸, 包含 7 个串联的 LEA3 蛋白的基元
序列。 通过与玉米、 小麦、 水稻、 大麦的 LEA3蛋白序列比较, 氨基酸序列同源性分别为 73. 8%、 53. 77%、
45. 63%和 53. 99% ; 其编码蛋白理论相对分子量为 21. 22 kD, 等电点 pI=8. 79; 蛋白质二级结构预测表明
2 段 琢螺旋结构占主导, 与目前已知的多种植物的 LEA3 蛋白具有相似的结构功能域。 通过热不对称交错
PCR (TAIL鄄PCR) 技术获得 LEA3 基因启动子 749 bp的 DNA序列, 该区域包含 ABA应答元件、 干旱胁迫
应答元件、 以及胚胎和胚乳特异表达元件; 通过 PHyML软件构建了禾本科植物 LEA3 基因 ML系统树。 这
些研究结果为深入了解该基因的功能和高粱抗旱的分子机理提供了基础数据。
关键词: 高粱; LEA3 蛋白; 克隆; 启动子; ML树
中图分类号: Q 78摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2013)05-585-09
Cloning and Characterization of the LEA3 Protein Gene
and Promoter from Sorghum bicolor
SUN Xiao鄄Jiao, TANG Xiao鄄Qian, YU Li鄄Xia, BAI Qiong, YAN Bo**
(Faculty of Landscape Architecture, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China)
Abstract: A pair of degenerate primers was designed according to reported fragments of LEA3 genes in GenBank. U鄄
sing these primers a new cDNA fragment of 1 032 bp was amplified by PCR and RACE from total RNA of Sorghum
bicolor, which indicated that the open reading frame region of the gene was 612 bp (GenBank accession number
GQ494000). It is predicted that the sequence encodes 203 amino acids with a molecular weight of about 21. 22 kD,
includes seven characteristic motifs of LEA3 and has a theoretical isoelectric point of 8. 79. The sequence shows a
similarity of 73. 8% , 53. 77% , 45. 63% and 53. 99% with Zea mays, Triticum aestivum, Oryza sativa and Hor鄄
deum vulgare LEA3 sequences, respectively. The secondary structure of the Sorghum LEA3 protein exhibited a quan鄄
tity of 琢鄄helix dominant structures that were similar to those found in many other plants. In addition, a 749 bp DNA
sequence was isolated from Sorghum genomic DNA by Thermal Asymmetric Interlaced PCR (Tail鄄PCR). This pro鄄
moter region was predicted to contain ABA and drought stress response elements of embryo and endosperm鄄specific
genes Sequences of Gramineae LEA3 genes were aligned using the profile alignment function of ClustalX, and maxi鄄
mum likelihood phylogenetic analyses were conducted using PHyML. The research forms part of an analysis of
drought鄄resistant mechanisms and gene function in Sorghum.
Key words: Sorghum bicolor; LEA3 protein; Clone; Promoter; ML tree
摇 LEA蛋白是一类在植物胚胎发育后期丰富表达, 与抗旱性密切相关的蛋白质, 尤其是第 3 组 LEA
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2013, 35 (5): 585 ~ 593
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 7677 / ynzwyj201312110
*
**
基金项目: 云南省应用基础研究面上项目 (2009ZC079M) 和云南省部级重点学科、 省高校重点实验室及校实验室共享平台资助
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: yanbodr@ yahoo. com. cn
收稿日期: 2012-09-05, 2013-04-19 接受发表
作者简介: 孙晓娇 (1986-) 女, 硕士, 主要从事植物生物技术研究。 E鄄mail: sxj5127@ 163. com
基因编码的蛋白质在生物体内具有非常重要的生
理功能, 它们都具有串联的 11 个氨基酸基元序
列 (T / A A / T O / E A / T A / T K / R Q / ED K/ R A/ T
X E / DQ) 的重复排列 (Baker 等, 1988), 可形成
亲水的 琢-螺旋结构, 在植物受到干旱胁迫时,
能避免细胞内高浓度离子的积累引起的损伤, 同
时可以防止组织过度失水 (Dure, 1993)。 自分
离得到 LEA 蛋白 ( late embryogenesis abundant
protein) 以来, 对 LEA3 基因的研究报道越来越
多, 许多研究结果都表明 LEA3 基因的表达与植
物的抗旱性密切相关, 其表达量与植物的抗脱水
能力呈正相关。 Hong (2000) 发现大麦在冷驯
化过程中能诱导 HVA1 基因的表达, 产生 LEA3
蛋白。 Xu 等 (1996) 将 HVA1 蛋白基因转入水
稻中, 结果表明转基因水稻提高了对水分胁迫和
高盐胁迫的耐受性。 王瑛等 (2007) 将大麦的
LEA3 基因转入紫花苜蓿中, 获得耐盐能力增强
的转基因植株。 刘祥久等 (2005) 将 LEA3 基因
导入到稳定的玉米自交系中, 通过对其后代进行
抗旱鉴定, 发现各自交系的抗旱性能都有所提高。
Maqbool等 (2002) 将 LEA3基因导入燕麦中, 并
获得了具有耐旱、 耐盐的转基因燕麦。 钱刚等
(2007) 对比抗旱性不同的青稞品种之间 LEA3 蛋
白的抗旱单元保守基元拷贝数有差异。
LEA3 基因在胚胎或种子成熟过程中丰富表
达, 在种子萌发后的几小时内迅速减少, 且无组
织器官特异性 ( Zhang 等, 2002), 在根、 茎、
叶中均有表达。 其表达受 ABA 和脱水信号的诱
导, 在植物遭受水份胁迫时, 内源 ABA 的量会
升高, 脱水信号通过 ABA 诱导 LEA3 基因表达
(Shao 等, 2005)。 因此本实验采用施加外源
ABA的方法诱导高粱 LEA3 基因的表达。
染色体步移技术 (Genome Walking) 是以生
物基因组或基因组文库中的已知序列为依据逐步
探知其侧翼未知序列的技术 (Ochman 等, 1988;
Rosenthal 和 Jones, 1990; Lagerstrom 等, 1991;
Sarkar 等, 1993), 在此基础上 Liu 和 Whittier
(1995) 采用交错改变退火温度的方法改变 PCR
的 “严谨性冶 即热不对称交错 PCR ( Thermal
Asymmetric Interlaced PCR, TAIL鄄PCR) 技术,
增加 “特异带冶 的产量, 消除 “非特异带冶 的
干扰, 巧妙的解决了 “非特异带冶 的识别问题。
其主要原理是: 根据已知 DNA 序列, 设计 3 条
同向且退火温度较高的特异引物 (specific prim鄄
er, SP) 和 8 种退火温度较低的兼并引物 (arbi鄄
trary degenerate primer, AP), 然后进行 3 次巢式
的热不对称 PCR 反应以期获得某基因的侧翼序
列。 该技术简单快速、 高效特异、 可对产物直接
测序, 已经成为分子生物学研究中非常实用的基
因侧翼序列克隆技术 ( Benkel 和 Fong, 1996;
Jones 和 Winistorfer, 1992, 1997; Yan 等, 2003;
Parker等, 1991; Qin等, 2003; Antal等, 2004),
该技术在基因克隆、 寻找已知基因的启动子和调
控元件、 研究基因的内含子和外显子边界、 分析
转基因生物基因组中外源基因的插入位点等方面
已有广泛的应用。
高粱 ( Sorghum bicolor L. Moench) 是禾本
科重要的粮食作物和经济作物, 但目前还没有关
于高粱 LEA3 基因的报道, 本研究运用简并 PCR
和 RACE 相结合的方法克隆了高粱的 LEA3 基
因, 并对其推断的氨基酸序列进行了分析和功能
预测; 运用 Tail鄄PCR技术克隆高粱 LEA3 基因的
启动子, 该序列包含 TATA鄄box、 CAAT鄄box 及一
些重要的与抗旱相关以及与胚胎发育阶段相关的
作用元件, 暗示了 LEA3 基因在 ABA诱导中的作
用以及该基因在表达中可能具有的一些特点。
1摇 材料与方法
1. 1摇 供试材料摇 甜高粱雅 1 号
1. 2摇 实验方法
1. 2. 1摇 实验试剂摇 植物总 DNA提取试剂盒, 总 RNA提
取试剂盒, 胶回收试剂盒购于天根生化科技有限公司,
逆转录相关试剂, Taq DNA聚合酶, 末端转移酶 (TdT),
pMD18鄄T载体及相关试剂购于宝生物工程有限公司, 大
肠杆菌 DH5琢为本实验室保存菌种。
1. 2. 2摇 分离高粱 LEA3 基因
1. 2. 2. 1摇 RACE克隆高粱 LEA3 全长 cDNA序列
根据大麦 ( X13498 )、 小麦 ( AY148492 )、 雀麦
(AB181485)、 水稻 (OSU57641)、 玉米 (NM_001111828)
的 LEA3 基因序列, 设计一对简并引物 (Yu 等, 2010)
FP、 RP, 以 0. 1 mmol·L-1 ABA 低温避光处理 24 h 的高
粱幼苗 , 提取总 RNA, 以合成的 cDNA第一链为模板进
行 PCR扩增反应, 其 PCR 反应体系为: 模板 1 滋L, 引
物各 1 滋L, 10伊Buffer 2. 5 滋L, MgCl2 1. 5 滋L, 2. 5伊dNTP
2 滋L, 二甲基亚砜 (DMSO) 2 滋L, Taq酶 0. 15 滋L, ddH2O
685摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
14 滋L。 反应条件为: 94 益预变性 3 min; 35 个循环反应:
94 益 30 s, 53 益 30 s, 72 益 1 min, 72 益延伸 10 min。
PCR产物电泳、 回收、 连接、 转化测序。 引物合成及测
序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成 (表 1)。
采用末端脱氧核糖核酸转移酶 (TDT) 对高粱 cD鄄
NA进行末端加尾, 加尾后作为模板, 根据简并引物获
得的序列片段测序结果, 设计 2 对 3忆RACE (Liu 和 Gor鄄
ovsky, 1993; Ruberti 等, 1994) 引物 P5、 OuterP 和 P6、
InnerP, 进行套式 PCR, 反应体系同上。 以第 1 轮 PCR
产物做模板, 用 P6、 InnerP引物进行第 2 轮扩增。 同时
设计 1 对 5忆端引物 P1、 P2, 进行 PCR, 体系同上。 PCR
产物电泳、 回收、 连接、 转化测序。 并根据测序结果设
计特异引物, 以高粱 DNA 为模板, 进行 PCR 反应, 确
定高粱 LEA3 基因的内含子区域。
1. 2. 2. 2摇 Tail鄄PCR克隆高粱 LEA3 基因启动子序列
提取高粱总 DNA 作为模板, 以获得的高粱 LEA3 基
因测序结果设计 Tail鄄PCR引物 P7、 P8, 以 P2、 P7、 P8共
3个向外 (3忆-5忆) 引物分别作为第一轮、 第二轮、 第三
轮巢式特异引物, 顺次与 8 个随机引物 AD1鄄AD8 (表 1)
组合进行 Tail鄄PCR扩增, 反应体系: 模板 1 滋L, 引物各 1
滋L, 10伊Buffer 2. 5 滋L, MgCl2 1. 5 滋L, 2. 5伊dNTP 2 滋L,
二甲基亚砜 (DMSO) 2 滋L, Taq 酶 0. 15 滋L, ddH2 O 14
滋L。 简并引物的浓度是特异引物的 4 倍, 第 1 轮产物稀
释 10倍后作为第2轮 PCR的模板, 第2轮产物稀释10倍
作为第 3轮 PCR模板。 Tail鄄PCR条件 (罗丽娟和施季森,
1993; Xu等, 2007; Ying 等, 2002) (表 2)。 第 3 轮 PCR
产物进行电泳分离、 回收合适片段、 连接、 转化测序。
1. 3摇 LEA3 基因序列特征性分析
将获得的高粱 LEA3 基因翻译成氨基酸序列, 并与
玉米 (NM001111828)、 小麦 (AY148492)、 水稻 (DQ789359)、
大麦 (X78205) 的 LEA3 蛋白序列比较。
1. 4摇 高粱 LEA3 蛋白亲 /疏水特征性分析
在分析 LEA3 蛋白的疏水性时, 采用 Tom Hall 公司
开发的 BioEdit软件。
1. 5摇 高粱 LEA3 蛋白二级结构预测
高粱 LEA3 蛋白氨基酸序列利用 Protparam工具在线
http: / / www. expasy. org / tools / protparam. html 预测蛋白质
的基本理化性质, 以 http: / / www. ncbi. nih. gov / gorf / gorf.
html上的 OFR Finder 软件进行开放阅读框分析; 采用
SOPMA网络服务器在线分析软件 http: / / npsa鄄pbil. ibcp.
fr / cgi鄄bin / npsa_automat. pl? page = / NPSA / npsa_sopma. html
预测高粱 LEA3 蛋白的二级结构。
表 1摇 高粱 LEA3 基因扩增引物及序列
Table 1摇 Primers names and sequences of Sorghum bicolor LEA3 gene
名称 Primer name 缩写 Abbreviation 引物序列 (5忆寅3忆) Primer sequence (5忆寅3忆)
第一链 cDNA合成引物 dTP TACCGTCGTTCCACTAGTGATTTCACTATAGG (T) 15
简并引物 (上游) FP GCCGGCGAGRCCAAGGSMC
简并引物 (下游) RP GSCGGWYTTGTCCTTGCCGG
3忆race引物玉 (上游) P5 GCAGCTACCTTGGCCAGAAG
3忆race引物玉 (下游) OuterP TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT
3忆race引物域 (上游) P6 GACCACGGAGTCCACCAAGC
3忆race引物域 (下游) InnerP TCCACTAGTGATTTCACTATAGG
5忆race引物 (上游) P1 GGCCACGCGTCGACTAGTACCCCCCCCCCCCCCCCD
5忆race引物 (下游) P2 CCTCGGTCTTCTGGCCAAGG
Tail鄄PCR引物 P7 TTGCCGGCCTGGTAGCTGGCC
Tail鄄PCR引物 P8 CGATCAGTAGCTGTTTGAAGC
随机引物 AD1 NTCGASTWTSGWGTT
随机引物 AD2 NGTCGASWGANAWGAA
随机引物 AD3 WGTGNAGWANCANAGA
随机引物 AD4 TGWGNAGSANCASAGA
随机引物 AD5 AGWGNAGWANCAWAGG
随机引物 AD6 CAWCGWCNGANASGGA
随机引物 AD7 TCSTNCGNACNTWGGA
随机引物 AD8 NTCAGSTWTSGWGWT
G / A; S: C / G; M: C / A; W: A / T; Y: C / T; D: A / T / G; N: A / G / C / T
7855 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 孙晓娇等: 高粱 LEA3 蛋白基因和启动子的克隆及序列分析摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
表 2摇 Tail鄄PCR技术分离高粱 DNA侧翼序列
Table 2摇 Using Tail鄄PCR to isolate the DNA flanking
sequence of Sorghum bicolor
反应 文件号
循环
次数 温度设定
1 1 94 益 1 min, 25 益 3 min,
以 0. 3 益 / s升至 72 益, 72 益 2. 5 min
第 1 轮 2 15 94 益 1 min, 58 益 1 min, 72 益 2. 5 min
94 益 1 min, 58 益 1 min, 72 益 2. 5 min
94 益 1 min, 44 益 1 min, 72 益 2. 5 min
3 1 72 益 5 min
4 1 94 益 1 min
第 2 轮 2 15 94 益 1 min, 58 益 1 min, 72 益 2. 5 min
94 益 1 min, 58 益 1 min, 72 益 2. 5 min
94 益 1 min, 44 益 1 min, 72 益 2. 5 min
3 1 72 益 5 min
4 1 94 益 1 min
第 3 轮 2 15 94 益 1 min, 58 益 1 min, 72 益 2. 5 min
94 益 1 min, 58 益 1 min, 72 益 2. 5 min
94 益 1 min, 44 益 1 min, 72 益 2. 5 min
3 1 72 益 5 min
1. 6摇 系统进化树构建
提取 GenBank 中已登录的植物 LEA3 基因序列和获
得的高粱 LEA3 基因序列, 通过分析研究 ( Schmidt 和
Schneider鄄Poetsch, 2002), 以豆科苜蓿Medicago truncatula
(XM鄄003590357. 1)、 大豆 Glycine max (NM鄄001251617. 1)
为外类群, 和高粱 Sorghum bicolor (GQ494000)、 冰草
Agropyron cristatum (JN007028. 1)、 短柄草 Brachypodium
distachyon (XM鄄003565927. 1)、 五芒雀麦草 Bromus inermis
(AB181485.1)、 大麦 Hordeum vulgare (AK372106. 1)、 金
发草 Pogonatherum paniceum (GU947649. 1)、 小麦 Triticum
aestivum (AY148492.1)、 玉米 Zea mays (NM鄄001153473.1)、
悬竹 Ampelocalamus calcareous (本实验克隆)、 发草 De鄄
schampsia caespitosa (NM鄄001146273.1)、 茭白 Zizania lat鄄
ifolia (GQ494017. 1) 以及水稻 Oryza sativa (DQ789359. 1)
14 种植物 LEA3 基因编码序列, 使用 jModelTest0. 1 软件
(Posada和 Crandall, 1998) 选择, 自展分析 1 000 次重
复, 采用 PHYML 软件构建 LEA3 基因 ML (Maximum
likelihood tree) 系统树。
2摇 结果与分析
2. 1摇 高粱 LEA3 基因核苷酸序列分析
利用简并引物 FP、 RP (表 1), 结合 RT鄄
PCR 和 5忆, 3忆鄄 RACE 方法扩增高粱 LEA3 基因
的全长 cDNA序列, 经过序列拼接, 最终获得了
1 032 bp全长 cDNA 序列。 该序列包含一个 612
bp的阅读框, 编码 203 个氨基酸残基的 LEA 蛋
白 (GenBank accession number: GQ494000)。
2. 2摇 高粱 LEA3基因启动子序列及应答元件分析
Tail鄄PCR方法扩增高粱 LEA3 基因启动子结
果如图 1 所示, 琼脂糖凝胶电泳结果选择超过
750 bp的片段, 回收产物测定结果为 790 bp, 其
中 41 bp与 DNA序列重叠。 用启动子在线分析软
件 http:/ / www鄄bimas. cit. nih. gov / molbio / proscan /分
析表明该序列具有预测的启动子区域, 大约位于
-426 bp至-175 bp。
利用 PLACE在线启动子元件预测程序 http:/ /
www. dna. affrc. go. jp / PLACE / signalscan. html 分
析表明 TATA鄄box位于-211 bp, CAAT鄄box位于-
333 bp, 还有一些重要的与抗旱相关以及和胚胎
发育阶段相关的作用元件 (图 2), 如 W鄄box、
G鄄box、 DREB、 脱落酸相应元件 ABRE (核心序
图 1摇 高粱 LEA3 基因启动子的 Tail鄄PCR扩增摇 M. DNA分子量标准; AD1 ~ AD8. PCR扩增产物
Fig. 1摇 Tail鄄PCR production of LEA3 promoter from Sorghum bicolor摇 M. DNA 2000 marker; AD1鄄AD8. PCR production
885摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
列是 ACGTG)、 Embryo and endosperm specific 等。
据报道, 已经鉴定出的 ABRE (ABA Responsive
Element) 元件是 LEA3 基因启动子应答 ABA 信
号的顺式元件, 证实了 LEA3 基因受 ABA 调控;
此外, 在 LEA3 基因启动子中还具有与基因表达
阶段有关的元件, 这些元件暗示了该基因的表达
特点 (孙立平和李德全, 2003; Ramanjulu, 2002)。
2. 3摇 高粱 LEA3 蛋白氨基酸序列分析及系统进
化树的构建
2. 3. 1 摇 高粱 LEA3 蛋白理化性质分析 摇 将高粱
LEA3基因的氨基酸序列与玉米 (NM001111828)、
小麦 ( AY148492 )、 水稻 ( DQ789359 )、 大麦
(X78205) 的 LEA3 蛋白序列通过 DNAMAN 软
件分析比较, 氨基酸序列同源性分别为 73. 8% 、
53. 77% 、 45. 63%和 53. 99% ; 与禾本科以外的
其他植物 LEA 蛋白比较, 同源性较低, 与油菜
和棉花的同源性分别为 30% 和 31% ; 对高粱
LEA3 基因全序列进行开放阅读框分析, 发现仅
在 184 ~796 bp之间有一个开放阅读框, 编码 203
个氨基酸, 计算其理论相对分子量为 21. 22 kDa,
等电点 pI =8. 79。
另外, 高粱 LEA3 蛋白序列包含串联的保守
基元序列 (T / A A / T O / E A / T A / T K / R Q / ED
K / R A / T X E / DQ), 这属于 LEA3 蛋白的典型结
构特征 (赵咏梅等, 2006)。 该基元序列可以形
成亲水的 琢鄄螺旋结构, 与植物抗旱性密切相关,
但由于物种不同, 所以在重复次数上也存在变
异。 图 3 是高粱 LEA3 基因的核苷酸序列, 其中
存在 5忆UTR (起始密码子 ATG上游) 183 bp、 3忆
UTR (终止密码子 TAG 下游) 237 bp。 开放阅
读框编码的 203 个氨基酸残基中, 包含了 7 个串
联的保守基元序列 (下划线部分表示), 其中有
6 个基元序列属于重复序列。
2. 3. 2摇 高粱 LEA3 蛋白亲 /疏水性分析摇 对高粱
LEA3 蛋白序列进行分析, 其多数特征与 LEA3
蛋白的特征相符合 (赵咏梅等, 2006), 高粱
LEA3蛋白含丙氨酸 (18. 2%)、 赖氨酸 (14. 3%)、
苏氨酸 (14. 8% )、 谷氨酸 (9. 4% )和谷氨酰胺
(9. 4% ) 等亲水性氨基酸, 并且不含脯氨酸、
色氨酸、 半胱氨酸和苯丙氨酸。 如图 4 示, 该蛋
白仅从大约第 136 位氨基酸到 174 位氨基酸区间
形成疏水区域, 其余均为亲水性区域。
2. 3. 3摇 蛋白质二级结构分析与功能预测摇 高粱
LEA3 蛋白的二级结构分析 (图 5) 显示, 该蛋
白二级结构中有占 75. 37%的 琢鄄螺旋结构, 其百
分比大于 45% , 是主导结构, 故高粱 LEA3 蛋白
属于全 琢 蛋白, 符合 Chou 等 ( 1995 ) 研究
LEA3 蛋白特征结构特点, 此外, 高粱 LEA3蛋白
二级结构中无规卷曲占 17. 24%、 延伸链 5. 42%、
茁鄄转角 1. 97% , 而 茁鄄折叠仅占 0. 03% <5% , 这
图 2摇 高粱 LEA3 基因启动子区域序列及预测的转录因子结合位点
Fig. 2摇 Promoter region sequence gene rated and its transcriptional factor of LEA3 homologue from Sorghum bicolor
9855 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 孙晓娇等: 高粱 LEA3 蛋白基因和启动子的克隆及序列分析摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
与 LEA 蛋白质序列二级结构主要由 琢鄄螺旋组成
有关 (Tolleter等, 2007)。
2. 3. 4摇 系统树的构建摇 图 6 是基于 Genebank 刊
登出来的所有禾本科植物 LEA3基因构建的 ML进
化树, 从图 6中可以看到, 苜蓿、 大豆以及 12 种
禾本科植物各聚为一支, 在禾本科植物 LEA3基因
的聚类分支中, 高粱与金发草同时和玉米聚为一
支, 其余 LEA3基因的禾本科植物聚为一支。
图 3摇 高粱 LEA3 基因核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列
下划线代表基元序列; 波浪线表示加尾信号; 阴影部分表示起始密码子;*表示终止密码子
Fig. 3摇 Nucleotide and deduced amino acid sequence of LEA3 proteins from Sorghum bicolor
The motif sequences was underline; poly A signal was waved; the initiation codon sequence was shade; *was termination codon
图 4摇 高粱 LEA3 基因片段的亲水性分析
Fig. 4摇 Hydrophilicity analysis of LEA3 gene fragment in Sorghum bicolor
095摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
图 5摇 高粱 LEA3 蛋白二级结构的预测
Fig. 5摇 Secondary structure analysis of LEA3 protein
图 6摇 高粱 LEA3 基因片段与 13 个 LEA3 基因的聚类分析结果
Fig. 6摇 Phylogenetic tree based on alignment of the deduced amino鄄acid sequences of LEA3 homologoue 13 known genes
3摇 讨论
不同物种的 LEA3 蛋白, 其大小差异很大,
基元序列的拷贝数也有较大的差异, 如棉花的
LEA蛋白只有 5 个 (罗克明等, 2002), 李乐等
(2011) 研究中大豆则超过 30 个, 高粱 LEA3 蛋
白只有 7 个串联的保守基元序列, 该基元序列能
形成兼性 琢鄄螺旋结构, 在植物细胞脱水时提供
疏水区的亲水表面 (Dure, 1993; 俞嘉宁和山
仑, 2002; Choi等, 1999), 推测该基因保守基元
序列拷贝数的差异可能与植物的抗旱性机制相
关, 具体机制有待进一步研究。
对高粱 LEA3 蛋白氨基酸序列和蛋白质的结
构预测, 可以推测 LEA3 蛋白具有较强的亲水
性。 高粱的 LEA3 蛋白含有 11 个氨基酸残基组
成的重复基元序列, 可能形成螺旋结构, 其中疏
水氨基酸形成螺旋蛋白质的疏水界面, 其余的形
成亲水界面, 通过疏水界面, LEA3 蛋白形成同
型二聚体, 而带电荷的氨基酸残基可以束缚带电
离子, 从而避免干旱胁迫时高浓度的离子积累损
伤细胞, 同时也保护细胞不受高渗透压的损害。
这可能是高粱 LEA3 蛋白的重要功能之一。
LEA3 基因是在种子成熟后期丰富表达的一
类基因, 其表达或蛋白积累与植物的渗透胁迫抗
性正相关 (Jayaprakash 等, 1998; Suprunova 等,
2004)。 LEA3 基因启动子具有较强的发育阶段和
组织特异性, 其表达一般受与水势有关的因子的
1955 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 孙晓娇等: 高粱 LEA3 蛋白基因和启动子的克隆及序列分析摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
诱导。 而受 ABA诱导的大多数的 LEA3 基因启动
子都具有 ABRE 和 DREB 等作用元件 (裴金玲
等, 2012)。 本研究分离克隆的高粱 LEA3 基因启
动子中存在 ABRE (应答 ABA 信号元件) 和
DREB (逆境胁迫应答元件) 作用元件, 而这些
元件是如何与多种转录因子相结合, 并能准确和
多样调控高粱 LEA3 基因的表达需要作进一步详
细研究。
目前, 从禾本科克隆的 LEA3基因的启动子还
比较少, 以禾本科大麦为例, 对比高粱的 LEA3 基
因和大麦的HVA1基因的启动子序列 (Li和Wang,
1998), 高粱 LEA3 基因启动子含 2 个 ABRE 作
用元件、 1 个 DREB作用元件、 3 个 ABA作用元
件; 大麦 HVA1 启动子中包含 3 个 ABRE作用元
件和一个 C鄄box, 这些作用元件的种类、 数量与
功能可能与植物对胁迫的反应有关, 这也暗示了
植物抗旱性机制的可能作用机理。
也参摇 考摇 文摇 献页
Antal Z, Rascle C, Fevre M et al., 2004. Single oligonucleotide nes鄄
ted PCR: a rapid method for the isolation of genes and their flan鄄
king regions from expressed sequence tags [ J] . Current Genet鄄
ics, 46: 240—246
Baker J, Steele C, Dure L, 2007. Sequence and characterization of
6Ita proteins and their genes from cotter [ J] . Plant Molecular
Biology, 11: 277—291
Benkel BF, Fong Y, 1996. Long range鄄inverse PCR ( LR鄄IPCR):
extending the useful range of inverse PCR [J] . Genetic Analy鄄
sis: Biomolecular Engineering, 13 (5): 123—127
Choi W, Zhu B, Close TJ, 1999. The barley (Hordeum vulgare L. )
dehydrin multigene family: sequence, allele types, chromosome
assignment and expreesion characteristics of 11 Dhn genes of ov
Dicktoo [J] . Theoretical and Applied Genetics, 98: 1234—1247
Chou KC, 1995. A novel approach to predicting protein structural
classes in a (20鄄1)鄄D amino acid composition space [J] . Pro鄄
teins, 21 (4): 319—344
Donald RGK, Cashmore AR, 1990. Mutation of either G box or l box
sequences profoundly affects expression from the Arabidopsis rbcs鄄1
A promoter [J] . The EMBO Journal, 9: 1717—1726
Dure L, 1993. Structural motifs in Lea proteins of higher plants
[A]. In: Close TJ, Bary EA (eds.), Plant Reponse of to Cel鄄
lular. Dehydration during Environments Strees. Current Yopics in
Plant Physilogy, Vol 10 [M]. Rockville, Maryland, USA: A鄄
merican Society of Plant Physiologists, 91—103
Dure L, 1993. A repeating 11鄄mer amino acid motif and plant desic鄄
cation [J] . Plant Molecular Biology, 3 (3): 363—369
Hong Z, 2000. Removal of feedback inhibition of 吟I鄄pyrroling鄄5鄄car鄄
boxylate synthase results in increased praline accumulation and
protection of plants from osmotic stress [J] . Plant Physiology,
122: 1129—1136
Jayaprakash TL, Tamamohan G, Krishnaprasad BT et al., 1998.
Genotypic variability in differential expression of LEA2 and LEA3
genes and proteins in response to salinity stress in finger millet
(Eleusine coracana Gaertn) and rice (Oryza sativa L. ) seedlings
[J] . Annals of Botany, 82: 513—522
Jones DH, Winistorfer SC, 1992. Sequence specific generation of a
DNA panhandle permits PCR amplification of unknown flanking
DNA [J] . Nucleic Acids Research, 20 (3): 595—600
Lagerstrom M, Parik J, Malmgeren H et al., 1991. Capture PCR: ef鄄
ficient amplification of DNA fragments adjacent to a known se鄄
quence in human and YAC DNA [J] . PCR Methods and Appli鄄
cations, 1: 111—119
Li YK, Wang JF, 1998. Advance of the studies on plant promoter
[J] . Chinese Bulletin of Botany (植物学通报) , 15 (Suppl. ):
1—6
Li Le (李乐), Xu HL (许红亮), Yang XL (杨兴露) et al.,
2011. Genome鄄wide identification, classification and expression
analysis of LEA gene family in soybean [J] . Scientia Agricultura
Sinica (中国农业科学), 44 (19): 3945—3954
Liang CZ (梁成真), Zhang R (张锐), Sun GQ (孙国清) et al.,
2010. Cloning of stree鄄related transcription factors gene from cot鄄
ton by optimized TAIL鄄PCR [J] . Cotton Science (棉花学报),
22 (3): 195—201
Liu X, Gorovsky MA, 1993. Mapping the 5忆 and 3忆 ends of Tetrahy鄄
mena thermophila mRNAs using RNA ligase mediated amplifica鄄
tion of cDNA ends (RLM鄄RACE) [ J] . Nucleic Acid Research,
21: 4954—4960
Liu YG, Whittier RF, 1995. Thermal asymmetric interlaced PCR:
Automatable amplification and sequencing of insert end fragments
from P1 and YAC clones for chromosome walking [ J] . Genom鄄
ics, 25: 674—681
Liu XJ (刘祥久), Jiang M (姜敏), Zhang XH (张喜华) et al.,
2005. With open import method will drought resistance to salt
gene transfer maize inbred line preliminary research [ J] . Rain
Fed Crops (杂粮作物), 25 (3): 134—135
Loake CJ, Faktor O, Lamb CJ et al., 1992. Combination of H鄄box
[CCTACC ( N) 7 CT] and G鄄box ( CACGTG) cis elements is
necessary for feed鄄forward stimulation of a chalcone synthase pro鄄
moter by the phenylpropanoid鄄pathway intermediate p鄄coumaric
acid [J] . Proceeding of the National Academy of Sciences of the
United States of America, 89 (19): 9230—9234
Lu J (路静), Zhao HY (赵华燕), He YY (何奕曳) et al., 2004.
Advance and progresses of hign promoter research and its appli鄄
cation [J] . Progress in Natural Science (自然科学进展), 14
(8): 856—862
295摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
Luo LJ (罗丽娟), Shi JS (施季森), 2003. TAIL鄄PCR: a simple
and efficient method to isolated DNA segments adjacent to know
sequence [J] . Journal of Nanjing Forestry University ( Natural
Sciences Edition) (南京林业大学学报: 自然科学版), 27
(4): 87—90
Luo KM (罗克明), Guo YL (郭余龙), Xiao YH (肖月华) et al.,
2002. Cloning and characterization of D鄄113 gene promoter from cot鄄
ton [J]. Acta Genetica Sinica (遗传学报), 29 (2): 161—165
Maqbool B, Zhong H, El鄄Maghraby Y, 2002. Chapter 16 functional
genomics for tolerance to a biotic stress in Avena sativa Linn
[J] . Theoretic and Applied Genetics, 105: 201—208
Ochman H, Gerber AS, Hartl DL, 1988. Genetic applications of an
inverse polymerase chain reaction [ J] . Genetics, 120: 621—
623
Parker JD, Rabinovitch PS, Burmer GC, 1991. Targeted gene walk鄄
ing polymerase chain reaction [J] . Nucleic Acids Research, 19:
3055—3060
Pei JL (裴金玲), Yang HL (杨红兰), Zhang DW (张大伟) et al.,
2012. Transgenic cotton with late embryogenesis abundant protein
(LEA) gene and its drought tolerance [ J] . Molecular Plant
Breeding (分子植物育种) , 10 (3): 331—337
Posada D, Crandall KA, 1998. Modeltest: testing the model of DNA
substitution [J] . Bioinformatics, 14 (9): 817—818
Posada D, 2008. jModelTest: phylogenetic model averaging [ J] .
Molecular Biology and Evolution, 25 (9): 1253
Qian Gang (钱刚), Zhai XG (翟旭光), Han ZX (韩兆雪) et al.,
2007. Tibet highland barley LEA3 protein new drought resist鄄
ance gene cloning and sequence analysis [J] . Journal of Crops
(作物学报) , 33 (2): 292—296
Qin GJ, Kang DM, Dong YY et al., 2003. Obtaining and analysis of
flanking sequences from T鄄DNA transformant of Arabidopsis [J] .
Plant Science, 165 (5): 941—949
Ramanjulu S, Bartels D, 2002. Drought and desiccation鄄induced
modulation of gene expression in plants [ J] . Plant Cell and
Environment, 25: 141—151
Rosenthal A, Jones DSC, 1990. Genomic walking and sequencing by
oligo鄄cassette mediated polymerase chain reaction [ J] . Nucleic
Acids Research, 18 (10): 3095—3096
Ruberti F, Cattaneo A, Bradbury A, 1994. The use of the RACE
method to clone hybridoma cDNA when V region primers fail
[J] . Journal of Immunol Methods, 173 (1): 33—39
Sarkar G, Turner RT, Bolander ME, 1993. Restriction鄄site PCR: a
direct method of unknown sequence retrieval adjacent to a know
locus by using universal primers [J] . PCR Methods and Applica鄄
tions, 2: 318—322
Schmidt M, Schneider鄄Poetsch HAW, 2002. The evolution of gymno鄄
sperms redrawn by phytochrome genes: The Gnetatae appear at
the base of the gymnosperms [ J] . Journal of Molecular Evolu鄄
tion, 54: 715—724
Shao HB, Liang ZS, Shao MA, 2005. LEA proteins in higher plants:
Structure, function, gene expression and regulation [ J ] .
Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 45: 131—135
Sun LP (孙立平), Li DQ (李德全), 2003. Progress in molecular
biology of LEA protein [ J] . Biotechnology Bulletin (生物技术
通报), 6: 5—13
Suprunova T, Krugman T, Fahima T, 2004. Differential expression of
dehydrin genes in wild barley, Hordeum spontaneum, associated
with resistance to water deficit [J] . Plant, Cell & Environment,
27: 1297—1308
Tolleter D, Jaquinod M, Mangavel C et al., 2007. Structure and
function of a mitochondrial late embryogenesis abundant protein
are revealed by desiccation [ J ] . The Plant Cell, 19 ( 5 ):
1580—1589
Wang Ying (王瑛), Zhu BC (朱宝成), Sun Yi (孙毅) et al.,
2007. Transformation of barely Lea3 gene into alfalfa (Medica鄄
go sativa L. ) [J] . Journal of Nuclear Agricultural Sciences (核
农学报), 21 (3): 249—252
Xu D, Duan X, Wang B et al., 1996. Expression of a late embryo鄄
genesis abundant protein gene, HVAI, from barley confers tol鄄
erance to water deficit and salt stress in transgenic rice [ J] .
Plant Physiology, 110: 249—257
Xu Feng, Cheng SY, Wang YH et al., 2007. Efficient amplification
and sequence analysis of chalcone synthase gene from Ginkgo bi鄄
loba by thermal asymmetric interlaced PCR [ J] . Journal of
Fruit Science, 24 (2): 237—243
Yan YX, An CC, Li L et al., 2003. T鄄linker Specific Ligation PCR
(T鄄linker PCR): an advanced PCR technique for chromosome
walking or for isolation of tagged DNA ends [ J] . Nucleic Acids
Research, 31 (12): 1—7 e68
Ying G, Wu W, He CZ, 2002. Cloning of Xanthomonas campestris
pv. campestris Pathogenicity related gene sequences by TAIL鄄
PCR [J] . Chinese Journal of Biotechnology, 18 (2): 182—
186
Yu L, Wu X, Tang X, Yan B, 2010. Simple and efficient method for
isolating cDNA fragments of lea3 genes with potential for wide
application in the grasses (Poaceae) [J] . Genetics and Molecu鄄
lar Research, 9 (3): 1321—1325
Yu JN (俞嘉宁), Shan L (山仑), 2002. The relationship of LEA
protein to drought tolerance in plants [ J] . Progress in Biotech鄄
nology (生物工程进展), 2: 10—14
Zhang JF, Deng XP, Mu XQ, 2002. Plant aquaporin [ J] . Plant
Physiol Commun, 38 (1): 88—91
Zhao YM (赵咏梅), Yang JX (杨建雄), Yu JN (俞嘉宁), 2006.
Research progress in Group 3 LEA protein and gene [ J] . Jou鄄
ranl of Xi爷an University of Arts and Science (Narural Science E鄄
dition) (西安文理学院学报), 9 (4): 27—30
3955 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 孙晓娇等: 高粱 LEA3 蛋白基因和启动子的克隆及序列分析摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇