全 文 ：内生真菌与两种兜兰共培养过程中的相互作用*
朱鑫敏1,2, 胡摇 虹1**, 李树云1, 严摇 宁1
(1 中国科学院昆明植物研究所资源植物与生物技术实验室, 云南 昆明摇 650201;
2 中国科学院研究生院, 北京摇 100049)
摘要: 由硬叶兜兰 (Paphiopedilum micranthum) 和杏黄兜兰 (P. armeniacum) 根中分别分离得到瘤菌根菌
属 (Epulorhiza) 真菌 PM鄄1 和美孢胶膜菌 (Tulasnella calospora) PA鄄1。 在 DE培养基上, PM鄄1 分别与硬叶
兜兰和杏黄兜兰共培养, 两种兜兰接菌苗的生物量以及 Ca、 Mn 元素含量比对照组显著增加, 表明 PM鄄1
能促进两种兜兰生长; PA鄄1 对两种兜兰生长的影响不显著, 但从干物重增长的百分率来看, PA鄄1 对杏黄
兜兰有一定的促进作用。 PM鄄1 对硬叶兜兰的影响高于杏黄兜兰, PA鄄1 对杏黄兜兰的影响高于硬叶兜兰,
表明真菌对宿主植物生长的促进作用更强。 PM鄄1 和 PA鄄1 在 Harvais 培养基上与杏黄兜兰共培养, 两种真
菌均对杏黄兜兰幼苗产生不利影响。 结果表明, 不同培养基养分水平能显著影响内生真菌与杏黄兜兰的共
生关系, 营养相对贫瘠的 DE培养基有利于两者共生, 而营养丰富的 Harvais培养基不利于共生。
关键词: 硬叶兜兰; 杏黄兜兰; 内生真菌; 瘤菌根菌; 美孢胶膜菌; 共培养; 相互作用
中图分类号: Q 948. 12, Q 945摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2012)02-171-08
Interaction between Endophytic Fungi and Seedlings of Two
Species of Paphiopedilum during Symbiotic Culture
ZHU Xin鄄Min1,2, HU Hong1**, LI Shu鄄Yun1, YAN Ning1
(1 Key Laboratory of Economic Plants and Biotechnology, Kunming Institute of Batany, Chinese Academy of Sciences,
Kunming 650201, China; 2 Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)
Abstrate: Two fungi PM鄄1 and PA鄄1 were isolated from P. micranthum and P. armeniacum, respectively, the for鄄
mer belonged to Epulorhiza while the latter belonged to Tulasnella calospora. In this study, seedlings of P. armenia鄄
cum and P. micranthum were inoculated with PM鄄1 on DE medium, the biomass and the content of Ca, Mn of both
P. armeniacum and P. micranthum seedlings were higher than those in the control seedlings, which indicated that
PM鄄1 could improve the growth of those species. Seedlings of P. armeniacum and P. micranthum were inoculated
with PA鄄1 on DE medium, the biomass in both species was no difference with those in the control ones. But PA鄄1
enhanced the dry weight of P. armeniacum according to the rate of dry weight increase. The impact of PM鄄1 on P.
micranthum was higher than on P. armeniacum, while PA鄄1 impacted conversely, which demonstrated that fungi had
stronger improving effect only on its own host plants instead of any other orchids. P. armeniacum seedlings were
inoculated with PM鄄1 and PA鄄1 on Harvais medium. The growth of seedlings was inhibited by fungi. The results in鄄
dicated that nutrient level of medium played an important role in affecting the symbiotic relationship between P. ar鄄
meniacum seedings and endophytic fungi. Poor鄄nutrient medium was beneficial to the symbiotic relationship and nu鄄
trient鄄rich medium was not conducive to the symbiosis.
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2012, 34 (2): 171 ~ 178
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 3724 / SP. J. 1143. 2012. 11144
*
**
基金项目: 国家自然科学基金 (30870239); 云南省社会发展科技计划 (2009CD116); 国家林业局 “极小种群回归冶 项目 “杏
黄兜兰回归自然及种群重建冶
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: Huhong@ mail. kib. ac. cn
收稿日期: 2011-10-18, 2012-01-17 接受发表
作者简介: 朱鑫敏 (1986-) 女, 在读硕士研究生, 主要从事兰科植物菌根研究。
Key words: Paphiopedilum micranthum; P. armeniacum; Endophytic fungi; Epulorhiza; Tulasnella calospora;
Symbiosis; Interaction
摇 兰科植物是典型的内生菌根植物, 其种子
微小且没有胚乳, 合适的真菌侵染对于其种子萌
发乃至幼苗的生长至关重要, 约有一百多种无叶
绿素的兰科植物在整个生活史中完全依赖真菌提
供营养 (Dearnaley, 2007)。 与兰科植物共生的
真菌主要是担子菌类 ( Basidiomycetes) 真菌,
包括胶膜菌科 ( Tulasnellaceae) ( Shefferson 等,
2008 ), 角担菌科 ( Ceratobasidiaceae ) ( Otero
等, 2004 ), 腊壳耳科 ( Sebacinaceae) ( Taylor
等, 2003), 红菇科 (Russulaceae) ( Taylor 等,
2004) 等。 其中, 胶膜菌科的胶膜菌属 (Tulas鄄
nella) 和瘤菌根菌属 (Epulorhiza) 是兜兰属植
物主要的共生真菌 ( Athipunyakom 等, 2004;
Nontachaiyapoom 等, 2010; Yuan 等, 2010)。 近
年来, 兰科菌根在园艺学和植物保护学中的应用
引起了专家的高度重视 (Rasmussen 和 Rasmus鄄
sen, 2007; Zettler等, 2007), 在内生真菌与兰科
植物共生关系的研究工作中, 培养基的养分水平
对真菌与兰科植物的共生十分重要。 于雪梅和郭
顺星 (2000) 认为高浓度的碳源和氮源不利于
真菌与金线莲 (Anoectochilus roxburghii) 形成共
生关系; 低碳浓度有利于兰科植物与内生真菌共
生, 低氮情况下内生真菌能促进兰科植物生长
(Dijk和 Eck, 1995)。
硬叶兜兰 (Paphiopedilum micranthum) 和杏
黄兜兰 ( P. armeniacum) 同属于兰科 ( Orchi鄄
daceae) 兜兰属 (Paphiopedilum), 为多年生常
绿草本, 地生或半附生。 它们花形奇特, 花期
长, 是极具观赏价值的世界级花卉名品, 被并称
为 “金童玉女冶 (龙波和龙春林, 2006)。 由于人
为的过度采挖和生境破坏, 所有兜兰属植物都已
被收入 《中国植物保护条例》 附录, 受到法律
的保护 (罗毅波等, 2003)。 硬叶兜兰和杏黄兜
兰均生长在石灰岩壁积土或多石而排水良好的草
坡上 (陈心启和吉占和, 1998), 土层浅薄, 土
壤中的石砾含量较高 (董艳莉等, 2008), 两者
都能耐受恶劣的土壤环境, 这可能与内生真菌能
够为其提供营养有关。 目前, 对于兜兰属植物菌
根的研究主要集中在内生真菌的分离、 鉴定
(Nontachaiyapoom等, 2010; Athipunyakom等, 2004)、
专一性和多样性 (Yuan 等, 2010) 等方面, 而
内生真菌与兜兰属植物共生的研究鲜有报道。 本
研究拟通过从硬叶兜兰和杏黄兜兰中分离内生真
菌, 并将分离得到的真菌与两种兜兰无菌幼苗在
DE培养基上共培养, 探讨内生真菌对两种兜兰
生长的影响; 同时, 将内生真菌在不同培养基上
与杏黄兜兰共培养, 探讨在不同营养水平的培养
基上内生真菌与杏黄兜兰的共生关系, 为兜兰属
植物的繁育和保护提供理论基础, 并为促进兜兰
快速生长发育提供技术支撑。
1摇 材料与方法
1. 1摇 材料
内生真菌分离实验以野外移栽至昆明植物所温室三
年以上健康成年硬叶兜兰和杏黄兜兰根为材料, 将分离
得到的内生真菌菌株用于共培养实验。 硬叶兜兰共培养
实验采用 15 月龄大小均一无菌幼苗 (株高 3 ~ 5 cm, 叶
4 ~ 5 片, 根 2 ~ 4 条, 根长约 1. 5 cm 左右)。 杏黄兜兰
共培养实验采用 9 月龄大小均一无菌幼苗 (株高 2 ~ 3
cm, 叶 4 ~ 5 片, 根 2 ~ 4 条, 根长约 1 cm左右)。
1. 2摇 方法
(1) 菌株分离方法: 剪取成年健壮兜兰完整根段,
流水下冲洗干净后, 以 0. 1% HgCl2表面消毒 4 min, 无菌
水冲洗 4次, 在无菌操作台中将材料切成 2 ~ 3 mm 的薄
片, 平铺于 PDA培养基上, 27 益黑暗培养, 待菌丝长出
后转接至新的 PDA培养基上, 4 益保存。 诱导产孢方法:
菌株在 4 益的冰箱中保存 6个月诱导产孢; 将菌株接种在
水琼脂培养基上, 37 益培养一个月诱导产孢。 培养特征
观察: 菌株接种于 PDA平板上, 27 益黑暗培养, 记录菌
株生长速度, 观察菌落特征及菌丝体光学显微特征。
(2) 分子鉴定方法: 采用改良的 CTAB 法提取新鲜
菌丝的 DNA (Doyle 和 Doyle, 1987)。 ITS 扩增引物为
ITS4 / ITS5 (White, 1990)。 PCR扩增反应体系采用 25 滋L
反应体系, 包括: 10伊PCR Buffer 2. 5 滋L, 25 mmol·L-1
Mg2+ 2. 5 滋L, 2. 5 mmol·L-1 dNTP 1. 5 滋L, TaqE 0. 3 滋L
(0. 75 unit), DNA 2 滋L, 10 mmol·L-1 ITS4 2 滋L, 10
mmol·L-1 ITS5 2 滋L, ddH2O (双蒸水) 补充至 25 滋L。
PCR扩增反应条件: 94 益变性3 min, 然后进入32个反应
循环: 94 益变性 30 s, 52 益退火 30 s, 72 益延伸 55 s, 循
环结束后 72 益再延伸 7 min。 1. 5%的琼脂糖胶上样 2 滋L
检测。 将 PCR产物送至上海生工生物工程技术服务有限
271摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 34 卷
公司, 割胶纯化后检测。 序列分析: 得到的序列文件用
ContigExpress软件进行校对, 仔细核查每一个碱基以确保
所得序列的准确性。 然后通过 BLAST 搜索在 NCBI (Na鄄
tional Center for Biotechnology Information) 的GenBank中进
行序列比对, 从 GenBank 中选择相关的序列一起分析,
并用 PAUP beta 10 软件构建内生真菌的系统发育树。
摇 摇 (3) 共培养选用 DE 培养基 (Dijk 和 Eck, 1995)
和改良 Harvais培养基 (Harvais, 1982)。 DE培养基配方:
CaCl2 1. 0 mmol·L-1, MgSO4 0. 5 mmol·L-1, K2 SO4 1. 0
mmol·L-1, KH2PO4 0. 4 mmol·L-1, FeSO4 100 滋mol·L-1,
H3BO4 25 滋mol·L-1, MnCl2 33 滋mol·L-1, ZnSO4 2. 8
滋mol·L-1, NaMoO4 1. 0 滋mol·L-1, Na2EDTA 140 滋mol·
L-1, 酵母浸膏 1. 0 g·L-1, 琼脂 8. 5 g·L-1, pH值 6. 0。
改良 Harvais 培养基配方: Ca (NO3 ) 2 ·4H2 O 200
mg·L-1, NH4 NO3 140 mg·L-1, KH2 PO4 100 mg·L-1,
MgSO4·7H2O 100 mg·L-1, KNO3 100 mg·L-1, KCl 50
mg·L-1, H3BO3 0. 5 mg·L-1, CuSO4·5H2O 0. 025 mg·L-1,
ZnSO4·7H2O 0. 5 mg·L-1, Na2MoO4·2H2O 0. 02 mg·L-1,
Co (NO3)2·6H2O 0. 025 mg·L-1, KI 0. 1 mg·L-1, MnSO4
·H2 O 1. 54 mg·L-1, (NH4 ) 3 C6 H5 O7 19 mg·L-1, Fe
(NH4) 3 (C6H5O7 ) 2 25 mg·L-1, 烟酸 10 mg·L-1, 泛酸
钙 5 mg·L-1, 维生素 B1 5 mg·L-1, 蔗糖 20 g·L-1, 活性
炭 0. 3 g·L-1, 土豆 30 g·L-1, 切片煮熟取汁, 琼脂 8. 5
g·L-1, pH值 5. 8。
摇 摇 两种培养基的主要差异: DE培养基每升含有 1 g 酵
母浸膏作为碳源和氮源; Harvais培养基每升含有 20 g蔗
糖作为碳源, 另有大量的硝酸盐, 氨盐作为氮源, 有机
物质和矿质元素含量丰富。
摇 摇 (4) 内生真菌与兜兰共培养方法: 将兜兰幼苗在
无菌操作台中接入盛有培养基的兰花组培瓶中 (容积
600 mL, 瓶口内径 4 cm, 培养基 120 mL /瓶), 每瓶 5 株
幼苗。 将共培养的真菌在 PDA平板上培养, 待菌丝长满
平板, 用直径 0. 5 cm 的打孔器取 PDA 平板上的菌株琼
脂块, 置于兰花瓶的中央, 距每株幼苗的距离大致相
等, 对照组不接菌, 每个处理 30 个重复。 所有处理组和
对照组均置于温度 (27依1)益, 光照 21. 6 ~ 25. 2 滋mol·
m-2·s-1 12 h / d的组培室内培养。
摇 摇 (5) 生物量指标的测量: 共培养 150 d之后, 以瓶
为单位, 将苗取出测量鲜重, 80益烘箱中烘 48 h, 测量
叶干重, 根干重, 总干重。 矿质元素含量测量: 以 6 瓶
为单位, 将兜兰接菌苗和对照苗置于 80益烘箱中烘干,
研磨后过 60 目筛。 样品送至云南大学现代测试分析中
心, 采用混合酸消煮法提取苗内矿质元素, ICP鄄AES
(电感耦合等离子体原子发射光谱仪) 测量苗内各元素
含量。 数据分析使用 SPSS 16. 0 统计软件。
2摇 结果
2. 1摇 菌株分离鉴定结果
2. 1. 1摇 形态学鉴定摇 由硬叶兜兰根材料中分离
获得的菌株编号为 PM鄄1。 PM鄄1 在 PDA 平板上
呈米黄色, 圆周状发散生长, 可形成间隔不等的
同心菌落环纹, 生长面有稀松的白色气生菌丝,
生长速度 3 mm / d, 经诱导未见有性生殖孢子形
成 (图 1: A)。 光学显微特征: 分枝几近直角,
分枝处略呈缢缩状, 距菌丝分枝点较近处形成隔
膜 (图 1: B); 具有由桶状无性厚垣孢子串联而
成的念珠细胞结构 (图 1: C)。 由杏黄兜兰根材
料中分离得到的菌株编号 PA鄄1。 PA鄄1 在 PDA平
板上呈白色圆周状发散生长, 生长面有稀松的白
色菌丝, 生长速度 11 mm / d, 经诱导未见有性生
殖孢子形成 (图 1: D), 光学显微特征与 PM鄄1
相似。 基于菌落和菌丝的特征, 初步判定 PM鄄1
和 PA鄄1 属于兰科丝核菌类 ( Rhizoctonia鄄like)
真菌。
图 1摇 PM鄄1 和 PA鄄1 的菌落特征和菌丝体光学显微特征
A. PM鄄1 的菌落特征; B. PM鄄1 的菌丝特征;
C. PM鄄1 的厚垣孢子; D. PA鄄1 的菌落特征
Fig. 1摇 Colony and mycelial optics characteristics of PM鄄1 and PA鄄1
A. Colony characteristic of PM鄄1; B. Mycelium characteristic of PM鄄1;
C. Chlamydospore of PM鄄1; D. Colony characteristic of PA鄄1
2. 1. 2摇 分子生物学鉴定摇 所得菌株 PM鄄1 的 ITS鄄
5. 8S rDNA序列与 uncultured Tulasnellaceae (Gen鄄
Bank accession number GQ241852) 显示有 100%
的相似性, GQ241852 是从昆明兰花温室中的硬
3712 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 朱鑫敏等: 内生真菌与两种兜兰共培养过程中的相互作用摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
叶兜兰根材料中直接扩增出来的序列 (Yuan 等,
2010), 本研究从同一生长地点的硬叶兜兰中分
离得到该真菌菌株; PM鄄1 与瘤菌根菌 Epulorhiza
sp. ( GenBank accession number GU166409 ) 的
ITS鄄5. 8S rDNA序列最大相似度为 86% (表 1)。
在构建的系统发育树中, PM鄄1 与瘤菌根菌属聚
为一支 (图 2), 由此, PM鄄1 应属于瘤菌根菌
属。 PA鄄1 的 ITS鄄5. 8S rDNA 序列和美孢胶膜菌
(Tulasnella calospora) (GenBank accession number
FJ613176) 有 99%的相似性, 在构建的系统发
育树中, PA鄄1 与美孢胶膜菌聚为一支 (图 2),
由此, PA鄄1 属于美孢胶膜菌。
2. 2摇 在 DE 培养基上, 两种真菌对硬叶兜兰和
杏黄兜兰生长的影响
2.2.1摇 PM鄄1真菌对硬叶兜兰和杏黄兜兰生长的影响
在 DE培养基上, 两种兜兰接菌组的菌丝生
长均不明显, 接菌苗的总鲜重、 叶干重、 根干重
和总干重比对照组均有显著或极显著增加 (表 2)。
表 1摇 两株真菌的 ITS鄄5. 8S rDNA序列在基因库中相近的序列
Table 1摇 The closest relatives of two Rhizoctonia鄄like fungus of ITS鄄5. 8S rDNA from GenBank
Fungal isolate Close relative Percentage identity, gaps Reference
PM鄄1 GQ241852 uncultured TulasnellaceaeGU166409 Epulorhiza sp. Pch鄄Qs鄄0鄄3
100% (603 / 603), gaps 0% (0 / 603)
86% (381 / 447), gaps 6% (31 / 447)
Yuan et al., 2010
Nontachaiyapoom et al., 2010
PA鄄1 FJ613176 Tulasnella calosporaGU166418 Tulasnella calospora
572 / 575 (99% ), gaps 0% (0 / 575)
570 / 574 (99% ), gaps 0% (0 / 574)
Yang et al. unpublished
Nontachaiyapoom et al., 2010
图 2摇 根据 ITS鄄5. 8S rDNA 序列构建的最大简约树 (length =629, CI=0. 871, RI=0. 909), Pachnocybe ferruginea
(GenBank accession number DQ241473) 和 Septobasidium carestianum (GenBank accession number DQ241448)
用作外类群, 枝上显示了>50%靴带值, 从 GenBank中获得的序列显示编号
Fig. 2摇 The maximum parsimomnious tree ( length =629, CI=0. 871, RI=0. 909) based on the ITS鄄5. 8S rDNA data. Pachnocybe ferruginea
(GenBank accession number DQ241473) and Septobasidium carestianum (GenBank accession number DQ241448) were used as outgroups taxon.
Numbers above the branches are bootstrap values >50% . Sequences obtained from GenBank are shown with accession numbers
471摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 34 卷
接种 PM鄄1 的硬叶兜兰总鲜重、 叶干重、 根干重
和总干重分别高于对照组 50. 114% 、 112. 251% 、
60. 412%和 85. 671% ; 接种 PM鄄1 的杏黄兜兰总
鲜重、 叶干重、 根干重和总干重分别高于对照组
55. 353% 、 35. 978% 、 29. 412%和 33. 415% (表
2), 从干物重增加百分率上看, PM鄄1 对硬叶兜
兰的影响比对杏黄兜兰的影响更强。 硬叶兜兰接
菌苗的 Ca、 S、 Fe、 Zn、 Mn 含量比对照组显著
或极显著增加, Mg、 P 含量极显著减少; 杏黄
兜兰接菌苗的 Ca 和 Mn 含量比对照组显著或极
显著增加, Mg含量无显著差异, Fe、 Zn、 P、 S
含量显著或极显著降低 (表 3)。
2.2.2摇 PA鄄1真菌对硬叶兜兰和杏黄兜兰生长的影响
在 DE培养基上, 接种 PA鄄1的硬叶兜兰总鲜
重, 叶干重, 根干重和总干重与对照组均无显著差
异; 接种 PA鄄1的杏黄兜兰鲜重比对照组显著增加,
叶干重、 根干重和总干重与对照组无显著差异
(表 4)。 接种 PA鄄1 的硬叶兜兰总鲜重、 叶干重、
表 2摇 DE培养基上, 两种兜兰接菌组 D鄄PM鄄1 与对照组 D鄄CK生物量差异
Table 2摇 The difference of biomass of both P. armeniacum and P. micranthum seedlings
between D鄄PM鄄1 and D鄄CK on DE medium (independent t鄄test)
D鄄CK D鄄PM鄄1 P >CK / %
总鲜重 Fresh weight / g 1. 748 依 0. 182 2. 624 依 0. 258 0. 024* 50. 114
硬叶兜兰 叶干重 Leaf dry weight / g 0. 080 依 0. 014 0. 170 依 0. 028 0. 021* 112. 251
P. micranthum 根干重 Root dry weight / g 0. 085 依 0. 006 0. 136 依 0. 013 0. 006** 60. 412
总干重 Total dry weight / g 0. 165 依 0. 018 0. 306 依 0. 033 0. 005** 85. 671
总鲜重 Fresh weight / g 0. 677 依 0. 078 1. 051 依 0. 127 0. 036* 55. 353
杏黄兜兰 叶干重 Leaf dry weight / g 0. 055 依 0. 005 0. 074 依 0. 005 0. 029* 35. 978
P. armeniacum 根干重 Root dry weight / g 0. 035 依 0. 002 0. 045 依 0. 001 0. 003** 29. 412
总干重 Total dry weight / g 0. 090 依 0. 005 0. 120 依 0. 005 0. 003** 33. 415
N=5;*表示差异显著 (P<0. 05); **表示差异极显著 (P<0. 01)
摇 摇 *Significant difference (P<0. 05); **Extremely significant difference (P<0. 01)
表 3摇 DE培养基上, 两种兜兰接菌组 D鄄PM鄄1 与对照组 D鄄CK矿质元素含量差异
Table 3摇 The difference of mineral contents of both P. armeniacum and P. micranthum seedlings
between D鄄PM鄄1 and D鄄CK on DE medium (independent t鄄test)
D鄄CK D鄄PM鄄1 P
Ca / 滋g·g-1 4513. 72 依 3. 067 4602. 67 依 13. 343 0. 018
Mn / 滋g·g-1 124. 34 依 1. 413 148. 327 依 0. 474 0. 000**
S / 滋g·g-1 1818. 01 依 4. 785 2207. 91 依 26. 890 0. 000**
硬叶兜兰 P. micranthum Fe / 滋g·g-1 1123. 91 依 6. 600 1186. 70 依 1. 468 0. 001**
Zn / 滋g·g-1 36. 038 依 0. 446 40. 7283 依 1. 104 0. 017*
Mg / 滋g·g-1 2527. 31 依 5. 084 2301. 54 依 7. 504 0. 000**
P / 滋g·g-1 5424. 47 依 49. 962 4521. 04 依 48. 382 0. 000**
Ca / 滋g·g-1 3787. 28 依 30. 488 4067. 4 依 55. 185 0. 011*
Mn / 滋g·g-1 124. 06 依 0. 685 135. 37 依 0. 677 0. 000**
S / 滋g·g-1 2723. 26 依 21. 320 2530. 4 依 7. 745 0. 001**
杏黄兜兰 P. armeniacum Fe(滋g / g) 797. 60 依 1. 150 465. 2 依 4. 919 0. 000**
Zn / 滋g·g-1 36. 900 依 0. 682 29. 683 依 0. 156 0. 007**
Mg / 滋g·g-1 1366. 997 依 2. 685 1366. 2 依 1. 646 0. 825
P / 滋g·g-1 5473. 152 依 72. 246 5004. 9 依 20. 119 0. 003**
N=3;*表示差异显著 (P<0. 05); **表示差异极显著 (P<0. 01)
摇 摇 *Significant difference (P<0. 05); **Extremely significant difference (P<0. 01)
5712 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 朱鑫敏等: 内生真菌与两种兜兰共培养过程中的相互作用摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
根干重和总干重分别高于对照组 - 13. 272% 、
2. 166%、 1. 420%和 1. 784%; 接种 PA鄄1 的杏黄
兜兰总鲜重、 叶干重、 根干重和总干重分别高于
对照组 63. 758%、 43. 510%、 18. 218%和 20. 263%
(表 4), 从干物重增加百分率上看, PA鄄1 对杏
黄兜兰生长有一定的促进作用, 对硬叶兜兰生长
无影响。 硬叶兜兰接菌苗的 Ca、 Mn、 S 元素含
量均比对照组极显著增加, Fe、 Zn、 Mg、 P 元
素含量极显著减少。 杏黄兜兰接菌苗的 Ca 元素
含量比对照组显著增加, P、 S、 Mg、 Fe、 Zn、
Mn元素含量极显著减少 (表 5)。
2. 3摇 在 Harvais 培养基上, 两株真菌对杏黄兜
兰生长的影响
在营养丰富的 Harvais培养基上, 两株真菌菌
丝生长旺盛, 并在培养基表面形成厚厚的菌丝层,
常见菌丝缠绕在植株上。 接种 PM鄄1 的杏黄兜兰鲜
重、 总干重和叶干重均比对照组显著或极显著减少;
接种 PA鄄1的杏黄兜兰鲜重、 叶干重、 根干重和总干
重均比对照组显著或极显著减少 (表 6)。 在该培养
基上, 内生真菌对杏黄兜兰幼苗生长产生不利影响。
表 4摇 DE培养基上, 两种兜兰接菌组 D鄄PA鄄1 与对照组 D鄄CK生物量差异
Table 4摇 The difference of biomass of both P. armeniacum and P. micranthum seedlings
between D鄄PA鄄1 and D鄄CK on DE medium (independent t鄄test)
D鄄CK D鄄PA鄄1 P >CK / %
总鲜重 Fresh weight / g 1. 748 依 0. 182 1. 5160 依 0. 102 0. 298 -13. 272
硬叶兜兰 叶干重 Leaf dry weight / g 0. 080 依 0. 014 0. 082 依 0. 018 0. 942 2. 166
P. micranthum 根干重 Root dry weight / g 0. 085 依 0. 006 0. 086 依 0. 013 0. 934 1. 420
总干重 Total dry weight / g 0. 165 依 0. 018 0. 168 依 0. 028 0. 931 1. 784
总鲜重 Fresh weight / g 0. 677 依 0. 078 1. 108 依 0. 100 0. 009** 63. 758
杏黄兜兰 叶干重 Leaf dry weight / g 0. 055 依 0. 005 0. 067 依 0. 005 0. 179 43. 510
P. armeniacum 根干重 Root dry weight / g 0. 035 依 0. 002 0. 041 依 0. 004 0. 195 18. 218
总干重 Total dry weight / g 0. 090 依 0. 005 0. 108 依 0. 010 0. 142 20. 263
N=5;*表示差异显著 (P<0. 05); **表示差异极显著 (P<0. 01)
摇 摇 *Significant difference (P<0. 05); **Extremely significant difference (P<0. 01)
表 5摇 DE培养基上, 两种兜兰接菌组 D鄄PA鄄1 与对照组 D鄄CK矿质元素含量的差异
Table 5摇 The difference of mineral contents of both P. armeniacum and P. micranthum seedlings
between D鄄PA鄄1 and D鄄CK on DE medium (independent t鄄test)
D鄄CK D鄄PM鄄1 P
Ca / 滋g·g-1 4513. 72 依 3. 067 5415. 35 依 7. 074 0. 000**
Mn / 滋g·g-1 124. 34 依 1. 413 166. 260 依 0. 966 0. 000**
S / 滋g·g-1 1818. 01 依 4. 785 2310. 89 依 2. 036 0. 000**
硬叶兜兰 P. micranthum Fe / 滋g·g-1 1123. 91 依 6. 600 863. 393 依 3. 356 0. 000**
Zn / 滋g·g-1 36. 038 依 0. 446 29. 3972 依 0. 583 0. 001**
Mg / 滋g·g-1 2527. 31 依 5. 084 1913. 64 依 5. 848 0. 000**
P / 滋g·g-1 5424. 47 依 49. 962 4535. 10 依 16. 511 0. 000**
Ca / 滋g·g-1 3787. 28 依 30. 488 3915. 97 依 17. 082 0. 021* 摇
Mn / 滋g·g-1 124. 06 依 0. 685 117. 06 依 0. 060 0. 001**
S / 滋g·g-1 2723. 26 依 21. 320 2427. 914 依 24. 738 0. 001**
杏黄兜兰 P. armeniacum Fe / 滋g·g-1 797. 60 依 1. 150 310. 697 依 2. 395 0. 000**
Zn / 滋g·g-1 36. 900 依 0. 682 22. 838 依 0. 515 0. 000**
Mg / 滋g·g-1 1366. 997 依 2. 685 1165. 669 依 3. 729 0. 000**
P / 滋g·g-1 5473. 152 依 72. 246 3851. 297 依 25. 849 0. 000**
N=3;*表示差异显著 (P<0. 05); **表示差异极显著 (P<0. 01)
摇 摇 *Significant difference (P<0. 05); **Extremely significant difference (P<0. 01)
671摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 34 卷
表 6摇 Harvais培养基上, 杏黄兜兰接菌组与对照组生物量差异
Table 6摇 The difference of biomass in P. armeniacum between treatment seedlings and the
control seedlings on Harvais medium (independent t鄄test)
H鄄CK H鄄PM鄄1 P H鄄PA鄄1 P
总鲜重 Fresh weight / g 1. 144 依 0. 134 0. 645 依 0. 087 0. 014* 0. 502 依 0. 116 0. 007**
叶干重 Leaf dry weight / g 0. 094 依 0. 010 0. 042 依 0. 006 0. 002** 0. 034 依 0. 010 0. 004**
根干重 Root dry weight / g 0. 044 依 0. 005 0. 034 依 0. 003 0. 126摇 0. 023 依 0. 005 0. 024*
总干重 Total dry weight / g 0. 137 依 0. 014 0. 076 依 0. 010 0. 006** 0. 057 依 0. 016 0. 005**
N=5;*表示差异显著 (P<0. 05); **表示差异极显著 (P<0. 01)
摇 摇 *Significant difference (P<0. 05); **Extremely significant difference (P<0. 01)
3摇 讨论
PM鄄1 和 PA鄄1 真菌形态学特征均符合兰科丝
核菌类 (Rhizoctonia鄄like) 真菌的形态学特征,
经过诱导并未产孢。 很多学者认为兰科共生丝核
菌在自然条件下没有或者极难发现有性态阶段,
实验室条件下进行产孢诱导也极难成功 (Athipu鄄
nyakom等, 2004; Otero 等, 2002)。 分子生物学
方法是对兰科植物广义丝核菌鉴定的最有效的方
法之一 (Nontachaiyapoom等, 2010; Chutima 等,
2011), 根据 NCBI 数据库可获得的序列以及有
效的引物, 选择 ITS鄄5. 8S rDNA 片段进行分析。
基于两种真菌的 ITS鄄5. 8S rDNA序列构建的系统
树表明, PM鄄1 属于瘤菌根菌属, PA鄄1 为美孢胶
膜菌。 瘤菌根菌属真菌和美孢胶膜菌均存在于多
种兰科植物中 ( Athipunyakom 等, 2004; Non鄄
tachaiyapoom等, 2010; Yuan等, 2010)。
DE培养基碳氮含量低, 营养相对贫瘠, 与
两种兜兰野外生境土层薄, 营养相对贫瘠的特点
一致。 在 DE 培养基上, 两种兜兰与 PM鄄1 菌株
共培养的接菌苗鲜重、 干重均比对照苗高, 表明
PM鄄1 对硬叶兜兰和杏黄兜兰幼苗的生长均有促
进作用。 根据数据统计分析结果, PA鄄1 对两种
兜兰干物质积累的影响未达到显著水平, 然而杏
黄兜兰接菌苗的生物量与对照组相比有所增加,
表明 PA鄄1 对杏黄兜兰生长有一定的促进作用。
在营养贫瘠的培养基上真菌能促进兜兰属植物生
长, 表明与真菌共生可能是兜兰属植物适应恶劣
生境的原因之一。 同时, 接种两种真菌的硬叶兜
兰和杏黄兜兰幼苗的部分矿质元素含量均显著高
于对照组, 这与多数内生真菌能促进兰科植物对
矿质元素吸收的结果一致 (赵杨景等, 1999;
Cameron等, 2007; 金辉等, 2009)。 然而, 研究
结果还表明, 两种兜兰接菌苗的部分元素含量比
对照组显著或极显著降低, 这可能是因为不同真
菌与兰科植物共生, 对其生长的影响是不一样的
(Porras鄄Alfaro 和 Bayman, 2007)。 PM鄄1 对硬叶
兜兰生长的促进作用比对杏黄兜兰生长的促进作
用更强, PA鄄1 对杏黄兜兰有促进作用而对硬叶
兜兰生长无影响, 表明真菌对宿主植物生长的促
进作用比对其它兜兰的促进作用更强。
内生真菌与杏黄兜兰在不同培养基上的相互
关系有明显差异。 改良的 Harvais 培养基含有丰
富的碳源和氮源且有机物质和矿质元素含量丰
富, 目前, 该培养基已被用来规模生产杏黄兜兰
组培苗。 在 Harvais 培养基上, 对照组幼苗生长
旺盛; 接菌苗生长较差, 黄叶数目较多。 接菌组
的真菌菌丝生长旺盛, 并在培养基表面形成厚厚
的菌丝层, 这是因为养分充足的培养基有利于真
菌生长, 但是, 在真菌生长过程中可能产生某些
有害物质, 对兜兰幼苗的生长产生抑制或者毒害
作用。 Hadley (1970) 等认为真菌旺盛生长的情
况下可能打破真菌与植物之间物质交换的平衡,
表现为二者由共生关系变为真菌对植物的寄生或
腐生。 在这种情况下, 真菌从植物中获取养分,
而植物表现为病害症状直至死亡。
本研究结果表明, 在养分较少的 DE 培养基
上, 真菌促进杏黄兜兰生长; 而在养分丰富的
Harvais培养基上, 真菌反而对杏黄兜兰的生长
产生毒害作用。 因此, 培养基养分水平能显著影
响内生真菌与兜兰的共生关系, 保持真菌和兰科
植物适当的营养平衡对于二者的共生十分重要。
此外, 碳氮含量及有机物质和微量元素对内生真
菌与兜兰属植物共生关系的具体影响还需进一步
的探索。
7712 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 朱鑫敏等: 内生真菌与两种兜兰共培养过程中的相互作用摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
致谢摇 感谢绍士诚博士在真菌形态和分子鉴定方面的帮
助以及李存信研究员对本论文写作的大力支持和指导。
也参摇 考摇 文摇 献页
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