全 文 ：夏蜡梅遗传多样性迁地保护取样策略研究*
陈香波1,田暋旗2
(1上海市园林科学研究所,上海暋200232;2上海辰山植物园,上海暋201602)
摘要:采用ISSR分子标记技术分析夏蜡梅天然群体的遗传多样性及空间遗传结构并在此基础上利用计算
机模拟取样,以保留95%以上天然群体等位基因为标准制定出夏蜡梅遗传多样性的取样策略,即采集6
个群体,群体抽样比例为30%,居群取样时应适当控制采种间距在26m以上。采种实施迁地保护后,后
代群体检测证实该取样策略能够有效保留原始群体的遗传多样性,由此探讨了濒危植物系统迁地保护的采
样模式与技术措施。
关键词:夏蜡梅;遗传多样性;迁地保护;取样策略
中图分类号:Q16暋暋暋 暋暋文献标识码:A暋暋暋 暋暋文章编号:0253灢2700(2010)Suppl灡桗桏灢074灢07
StudyontheSamplingStrategyofSinocalycanthuschinensis
forEx灢situConservationofGeneticDiversity
CHENXiang灢Bo1,TIANQi2
(1ShanghaiLandscapeGardeningResearchInstitute,Shanghai200232,China;
2ChenshanBotanicalGarden,Shanghai201602,China)
Abstract:ByanalysisofgeneticdiversityandpopulationgeneticstructureinnaturalpopulationsofSinocaly灢
canthuschinensiswithinter灢simplesequencerepeat (ISSR)technique,thesamplingstrategyweredeter灢
minedbasedonthegenecapturecurveof95%alelecaptured.Theresultsareasfolows:6populationstobe
sampled,thesamplingproportionshouldbe30%andthedistancebetweenthesampledindividualsarebestof
26mabove.AfterseedssamplingandconductionofEx灢situconservation,thegeneticdiversityoftheoff灢
springpopulationwereevaluatedthatitconservedthegeneticdiversityofthenaturalpopulationseffectively.
Therefore,thesystemicsamplingmethodofendangeredplantsforEx灢situconservationofgeneticdiversity
werediscussed.
Keywords:Sinocalycanthuschinensis;Geneticdiversity;Ex灢situconservation;Samplingstrategy
暋 植物迁地保护是指把植物的个体、器官或
组织转移到自然生境之外以繁衍保存的一种保护
方式,是生物多样性保护的重要辅助手段之一
(许再富,1998),特别对于那些以残存种群存在
或由于自然或人为原因生境条件已发生改变的濒
危物种,迁地保护已成为必要且可靠的措施。濒
危植物迁地保护时,简单的从一个地方采种或者
保存个别单株,很难达到遗传多样性保护的目的,
后代群体遗传代表性不强,而目前多数植物园收
集保存濒危植物均存在此问题 (康明等,2005;Li
等,2002),不能算是成功的保护。采用遗传多样
性迁地保护模式,在调查天然群体遗传多样性基
础上制定相应的采样策略并实施引种,以最少的
数量保存尽可能多的原有群体的遗传多样性,被
认为是一条科学而可行的保护途径 (金燕和卢宝
荣,2003)。采样策略关系到迁地保护的完整性和
云 南 植 物 研 究暋2010,Suppl灡桗桏:74~80
ActaBotanicaYunnanica暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋
* 基金项目:国家环保部专项 “中国重要观赏植物种质资源调查暠(物种08灢二灢3灢1)、上海市绿化和市容管理局项目 “夏蜡梅引
种及栽培应用技术研究暠(G060208)
作者简介:陈香波 (1972-)女,博士,高级工程师。主要研究方向:园林植物资源与生物技术。
有效性,但目前许多工作还只是随机引种以及分
析评价已收集群体、提出进一步引种建议方面
(韦霄等,2005),未能从一开始系统研究制定出
收集策略再行实施,更未有对策略采样后代群体
进一步跟踪评价的报道,收集保护效率普遍不高。
以国家二级保护植物、中国特有珍稀野生花
卉夏蜡梅为例 (郑万钧和章绍尧,1964),目前
国内只在武汉、杭州等少数植物园做零星收集,
天目山自然保护区虽已人工繁殖夏蜡梅,但后代
群体未检测到任何多态性 (周世良和叶文国,
2002),说明该迁地保护仅是保存了一定数量的
夏蜡梅苗木而未真正实现物种遗传多样性的有效
保护。调查发现,虽然夏蜡梅分布区狭小,但群
体表型变异仍很丰富 (陈香波等,2010),ISSR
分子标记分析显示居群间遗传多样性较高,夏蜡
梅自然繁育系统以异交为主且又呈片段化分布,
导致居群间强烈的遗传分化 (金则新和李钧敏,
2007;张文标,2007)。因此,迫切需要针对其
特殊的分布及繁育特点实施遗传多样性迁地保
护,制定切实的取样策略混合引种,以促使不同
群体间基因交流与融合、扩展种群适生范围,实
现物种的长远保护与合理利用。
本研究采用ISSR分子标记技术分析夏蜡梅
天然群体的遗传多样性及空间遗传结构并在此基
础上利用计算机模拟取样,通过不同取样方式对
比,制定代表夏蜡梅自然居群遗传多样性的取样
策略,采种实施迁地保护进一步检测后代群体的
遗传代表性,由此探讨了适合夏蜡梅系统迁地保
护的取样策略与实施方法,为更多濒危植物取样
保护提供参照与技术借鉴。
1暋材料和方法
1灡1暋ISSR分子标记遗传多样性数据采集与分析
选取夏蜡梅全分布区8个代表性居群 (取样群体基
本情况见表1)、每居群取30株个体 (天台居群15株,
保证株间距大于30m),共采集255株夏蜡梅植株幼嫩
叶片,经变色硅胶快速干燥处理,置于密封袋室温带回
保存备用。
采用改良CTAB法提取夏蜡梅总DNA (Doyleand
Doyle,1990),进行ISSR灢PCR扩增并对扩增反应产物进
行电泳与银染 (方法参照金则新和李钧敏,2007)。
条带统计:属于同一位点的产物按扩增阳性 (1)和
扩增阴性 (0)记录电泳带谱,形成ISSR数据矩阵。利用
POPGENEv.1灡31软件 (Yeh等,1999)计算多态位点
百分率 (P)、Shannon指数 (I)和Nei曚s基因多样性指
数 (h)等获得原始群体遗传多样性基础数据。
1灡2暋计算机模拟取样及空间自相关分析
针对群体与个体,利用PGDC1灡0软件通过计算机
模拟对总遗传材料分别按1、2、3、4、5、6、7、8个群
体或0灡1、0灡15、0灡2、0灡25、0灡3、0灡35、0灡4、0灡45、
0灡5、0灡55、0灡6、0灡65、0灡7的个体抽样比例进行可重
复随机抽样。在每种抽样比例下,分别进行1000次的
模拟取样得到1000个模拟样本,分析表征这些样本遗
传多样性的各项指标:多态位点数 (A)、多态位点百分
率 (P)、群体总的基因多样度 (Ht)及捕获的基因位
点数,计算各指标的平均数。当捕获等位基因数占到总
基因位点数的95%以上时的样本数量确定为取样的群体
和个体数 (李正宏等,2006)。
以横源居群夏蜡梅为研究对象,将ISSR的1、0数
据视作绝对型变异,选取等位基因频率在30%~70%之
间的ISSR位点,以个体间平均距离划分10个距离等
级,以空间自相关系数 Moran曚sI值衡量变异的空间结
构,计算公式如下:
I=
n毑
n
i=1
毑
n
j=1
Wij(Xi-X)(Xj-X)
(毑
n
i=1
毑
n
j=1
Wij)毑
n
i=1
(Xi-X)2
表1暋夏蜡梅居群基本情况
Table1暋InformationofpopulationsofSinocalycanthuschinensis
群体编号
Populationcode
地点
Location
经度
Lontitude
纬度
Latitude
海拔
Altitude (m)
坡向
Slope
P1 浙江临安大明山西坑 30曘02曚N 118曘58曚E 459~659 东北坡
P2 浙江临安大明山景区 30曘02曚N 118曘59曚E 664~929 东北坡
P3 浙江临安顺溪乡横源 30曘02曚N 118曘57曚E 822~830 北坡
P4 浙江临安颊口镇前坑 30曘05曚N 119曘01曚E 599~626 西北坡
P5 浙江临安清凉峰马啸 30曘08曚N 118曘54曚E 747~767 东北坡
P6 浙江临安顺溪乡直源 30曘03曚N 118曘56曚E 715~864 东北坡
P7 安徽绩溪龙须山 30曘03曚N 118曘41曚E 854~908 东北坡
P8 浙江天台大雷山 28曘59曚N 120曘46曚E 714~725 东北坡
57增刊桗桏暋暋暋暋 暋暋暋暋暋陈香波和田旗:夏蜡梅遗传多样性迁地保护取样策略研究暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋
暋暋式中Wij为权重,当空间一点i与j为邻接关系时,
Wij=1,否则Wij=0;Xi、Xj 分别为空间点i和j的数
值,X为所有点的均值,n为样点数。
I的期望值为E(I)=灢1/(n灢1),当I值为正值且显
著时,说明该距离等级两点间存在相似关系,当I值为
负值且显著时说明该距离等级两点间不存在相似关系
(何敬胜等,2005),显著性检验采用标准正态偏差法进
行,依据等间隔距离等级法 (10个等级)计算不同距离
等级下的 Moran曚sI值,以分析居群不同分布尺度变异的
空间结构,明确获取不同遗传背景材料的取样间隔距离。
1灡3暋采种育苗
于2008年9月下旬果实成熟期,采集上述8个居群
夏蜡梅、每居群20个单株 (株间距﹥30m)、每株采集
3个果实,共计480个果实2357粒种子,采后立即播于
育苗盘内,播种基质按园土、草炭、珍珠岩=2暶2暶1
的比例混合均匀,播后浇足水分,上覆塑料地膜以保
湿。待种子真叶长出后移栽上盆,栽植土壤同播种基
质。期间半月除草一次,视土壤干湿状况适量浇水,夏
季高温季节来临前搭建单层遮荫网。统计每株发芽3~
12个不等,共获得1688株后代植株,所有苗木均种植
于上海辰山植物园科学引种苗圃内。
1灡4暋取样策略的评价分析
对迁地保护采自8个夏蜡梅居群、各20株夏蜡梅个
体后代而建立起的人工居群,每株随机选取1株后代个
体植株的幼嫩叶片 (共计采集160个样本)提取总DNA
并进行ISSR灢PCR扩增,条带统计方法同1灡1。
以每群体采种20株,分别按6、7、8个群体等3个
级别以及采种8个群体,每群体分别按10、20个单株
个体2个级别进行随机抽样,构建成不同的采种群体,
利用 POPGENEv.1灡31 软件计算多态位点百分率
(P)、Shannon指数 (I)和 Nei曚s基因多样性指数
(h)等 (每级别随机重复抽样10次取平均值);计算不
同采种级别下后代群体各项遗传参数,以8个居群、每
居群30个单株所获得的原始群体遗传多样性参数为对
照,计算不同采种策略对原始群体的保留率。
2暋结果与分析
2灡1暋取样策略
2灡1灡1暋取样群体样本策略暋随取样群体数的增
加,获得的多态性位点百分率增加,而群体总的
基因多样度也在增加 (表2),捕获基因数呈现
递增的趋势,8个群体随机抽取1、2、3、4、5、
6群体可分别达到平均捕获78灡67%、93灡38%、
91灡91%、91灡91%、94灡85%、96灡32%的等位基
因数。保存6个群体的夏蜡梅可达到捕获总体等
位基因的96灡32%,多态性位点百分率达总群体
的90灡54%,群体总的基因多样度Ht占总群体
的94灡12%,保存6个群体即可保护夏蜡梅天然
群体95%以上的等位基因。
表2暋按群体随机取样群体遗传参数
Table2暋Geneticparametersofrandomsamplingpopulation
取样居
群数
No.of
sampled
populations
多态位
点数
No.of
polymorphic
loci
多态性
位点百
分率
P
(%)
群体总
的基因
多样度
Ht
捕获等位
基因数
No.of
aleles
captured
1 24 28灡91 0灡11 107
2 44 53灡01 0灡16 127
3 42 50灡6 0灡14 125
4 42 50灡6 0灡14 125
5 46 55灡42 0灡16 129
6 48 57灡83 0灡16 131
7 53 63灡85 0灡18 136
8 53 63灡85 0灡17 136
2灡1灡2暋取样个体样本策略暋表3可知,虽个别
有波动,但整体显示等位基因的捕获率随着居群
取样个体数增加而呈增大的趋势。在取样比例在
0灡3即30%时,等位基因的捕获率即已达到
97灡05%,在此比例下,群体总的基因多样度
(Ht)是原始群体基因多样度的119灡38%,多
态性位点百分率达到原始群体的92灡45%,较好
地代表了夏蜡梅天然群体的遗传多样性。因此,
在实施夏蜡梅迁地保护时,抽样比例在30%
(即每居群采取9~10株)即可达到有效保护总
体遗传多样性的目的。
表3暋按个体随机取样群体遗传参数
Table3暋Geneticparametersofrandomsamplingindividuals
取样
比例
Sampling
proportion
多态位
点数
No.of
polymorphic
loci
多态性
位点百
分率
P
(%)
群体总
的基因
多样度
Ht
捕获等位
基因数
No.of
aleles
captured
0灡1 33 39灡75 0灡15 108
0灡15 42 50灡6 0灡19 121
0灡2 45 54灡21 0灡2 128
0灡25 41 49灡39 0灡18 124
0灡3 49 59灡04 0灡2 132
0灡35 47 56灡62 0灡2 130
0灡4 48 57灡83 0灡21 125
0灡45 48 57灡83 0灡19 129
0灡5 49 59灡04 0灡2 132
0灡55 50 60灡24 0灡21 133
0灡6 50 60灡24 0灡21 131
0灡65 52 62灡65 0灡21 135
0灡7 51 61灡44 0灡21 134
67暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋云暋南暋植暋物暋研暋究暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋增刊桗桏
2灡1灡3暋取样个体空间距离暋为保证获取不同的遗
传组成个体、避免同一个体后代的重复取样从而降
低取样效率,需要首先分析单个群体内夏蜡梅遗传
变异的空间分布,以明确取样间隔距离。本研究以
横源群体为例进行夏蜡梅遗传变异的空间自相关分
析,运用等地理距离间隔法计算两居群不同距离等
级下的Moran曚sI空间自相关系数,结果见表4。
横源群体共得到ISSR多态位点数29个,
选取21个谱带频率在30%~70%的位点,以个
体间平均距离 (26m)为梯度划分10个距离等
级。如表4所示,在计算出的210个 Moran曚sI
值中,有20个 (9灡5%)达到显著 (P <0灡05)
或极显著 (P<0灡01)相关水平,在10个距离
等级中未有一个等级距离显著性I值比例超过
30%,夏蜡梅群体内遗传变异分布的空间结构性
不强。但在最短距离 (26m)内,仍有5个统计
检验达显著的I值 (占23灡8%)为正值,因此在
采样过程中应保持一定的个体间隔距离。
表4暋横源群体10个距离等级下的 Moran曚sI值及其显著性
Table4暋Spatialautocorrelationcoefficients (Moran曚sI)fortendistanceclassesinpopulationP3ofS灡chinensis
位点
Locus
10种距离等级 Moran曚sI值 MoransIfor10distanceclasses#
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
807灢1 0灡0003 0灡0005 0灡0008 0灡001 0灡0013 0灡0015 0灡0018 0灡0021 0灡0023 0灡0026
807灢2 灢0灡05 0灡015 灢0灡0136 0 0灡122 灢0灡056 灢0灡0937 灢0灡275 0灡1326 灢0灡3004
807灢4 0灡1952* 灢0灡1268 0灡4289*** 灢0灡3048 灢0灡5561* 灢0灡2232 0灡0141 灢0灡2577 灢0灡0086 灢0灡1787
807灢6 灢0灡0256 灢0灡1592 灢0灡1122 0灡1154 灢0灡1236 灢0灡0589 0灡0805 0灡0689 灢0灡0344 灢0灡002
807灢7 灢0灡069 灢0灡0206 0灡2231* 灢0灡1905 灢0灡2997 灢0灡2577 0灡0659 0灡0668 灢0灡0725 灢0灡0551
808灢1 灢0灡0064 灢0灡1763 0灡2595* 灢0灡1154 灢0灡044 0灡0108 0灡0108 灢0灡0798 灢0灡151 0灡0567
808灢2 0灡0194 灢0灡1498 0灡0061 灢0灡2 0灡1853 0灡0825 灢0灡2196 0灡0231 0灡0051 0灡0599
808灢3 0灡0584 灢0灡1569 0灡2336* 灢0灡2662 灢0灡2468 灢0灡0938 灢0灡1291 灢0灡1008 0灡0315 0灡0407
808灢7 0灡1282 灢0灡0047 灢0灡135 灢0灡2308 0灡0357 0灡2432 0灡1386 灢0灡1913 灢0灡151 灢0灡1781
809灢3 0灡025 灢0灡072 灢0灡0057 0灡04 0灡0979 灢0灡1209 灢0灡0122 灢0灡159 灢0灡0045 灢0灡0842
817灢1 0灡2887*** 灢0灡0015 灢0灡1017 灢0灡2738 灢0灡6054* 0灡4241** 灢0灡1962 灢0灡0851 灢0灡1859 灢0灡2005
826灢4 灢0灡0542 灢0灡1077 0灡0308 灢0灡2083 灢0灡0506 0灡0799 灢0灡0258 0灡0573 灢0灡0189 灢0灡0461
826灢5 0灡087 0灡0734 灢0灡2795 灢0灡1304 0灡1558 0灡3134* 灢0灡0543 灢0灡3696* 灢0灡0967 0灡1945
835灢4 0灡1429 0灡1281 0灡0569 0灡1429 灢0灡1714 0灡1091 灢0灡124 0灡0806 灢0灡3343** 灢0灡7892***
835灢5 0灡1591 灢0灡015 灢0灡1276 灢0灡0325 0灡1568 灢0灡0408 灢0灡1291 灢0灡4068** 灢0灡0163 0灡2488
835灢9 0 0灡0339 0灡1097 0灡1058 灢0灡034 灢0灡0589 灢0灡3552* 0灡1084 灢0灡2072 灢0灡0461
840灢4 0灡3157** 灢0灡2361 灢0灡0973 灢0灡4293* 灢0灡4246 灢0灡1304 0灡3777** 灢0灡0626 灢0灡0709 0灡2334
841灢1 0灡3875*** 灢0灡0631 灢0灡0876 灢0灡1667 0灡0357 灢0灡1315 0灡0573 灢0灡1542 灢0灡1884 灢0灡1732
841灢2 0灡0128 0灡0525 灢0灡0667 灢0灡0769 灢0灡044 灢0灡0589 0灡0457 灢0灡2192 灢0灡0011 灢0灡1781
841灢3 0灡3875*** 灢0灡0631 灢0灡0876 灢0灡1667 0灡0357 灢0灡1315 0灡0573 灢0灡1542 灢0灡1884 灢0灡1732
841灢5 灢0灡1357 0灡1303 灢0灡101 0灡1524 灢0灡1616 0灡0616 灢0灡2534 灢0灡0299 0灡0141 灢0灡2586
*P<0灡05,**P<0灡01,***P<0灡001.
# 距离等级 (Distanceclasses)(单位:m;Unit:m):1.0-26m;2.26-52m;3.52-78m;4.78-104m;5.104-130m;
6.130-156m;7.156-182m;8.182-208m;9.208-234m;10.234-260m
表5暋横源群体中表现显著相关性的位点数
Table5暋NumberoflociwhichshowedsignificantcorrelationinpopulationP3
距离等级Distanceclasses
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
显著正相关的位点个数
No.oflociwhichshowedsignificantpositivecorrelation
5 0 4 0 0 2 1 0 0 0
显著负相关的位点个数
No.oflociwhichshowedsignificantnegativecorrelation
0 0 0 1 2 0 1 2 1 1
显著相关性位点所占比例
Thepercentoflociwhichshowedsignificantcorrelation (%)
23灡8 0 19 4灡8 9灡5 9灡5 9灡5 9灡5 4灡8 4灡8
77增刊桗桏暋暋暋暋 暋暋暋暋暋陈香波和田旗:夏蜡梅遗传多样性迁地保护取样策略研究暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋
暋暋综合以上研究,夏蜡梅迁地保护取样6个群
体,每群体抽样比例在30% (每群体取9~10
株)可代表夏蜡梅天然群体95%以上的遗传组
成,居群取样时应考虑种群内遗传变异的空间分
布模式,保持一定的取样个体间隔距离。
2灡2暋取样策略的评价分析
实际操作中,为避免漏选或收集后代遗传多
样性偏低,可先放宽收集,待建立收集资源圃基
础之后再进一步决定筛除或补充,这是实施濒危
植物迁地保护必要的环节 (许再富,2008)。通
过对不同取样居群与个体数后代群体的遗传多样
性分析,分析取样居群与个体数对各遗传参数的
影响,结果正验证了上述取样策略的正确性。表
6显示,以每居群采样20个单株种子播种,随
着采种居群数增加,无论是观测等位基因数、有
效等位基因数或是多态性位点数、Nei曚s基因多
样性指数 (h)、Shanon曚s指数 (I)均呈增加
趋势,采种6个群体,Nei曚s基因多样性指数
(h)、Shanon曚s指数 (I)对野生群体的保留率
均已超过90%,由此可见取样策略中6群体取
样是有效而可行的。
同样,以采种8个居群,每居群随采种个体数
的增加,各遗传参数均呈增加趋势。采种10个个
体,Nei曚s基因多样性指数 (h)、Shannon曚s指
数 (I)对野生群体的保留率分别达到96灡67%
和95灡12%,取样策略中每居群10个个体的取
样能够较好地保留原始群体的遗传多样性。
3暋讨论
3灡1暋取样的理论依据
遗传多样性取样策略明确在进行种质采集
时,既要考虑使获取样本包含尽可能多的遗传变
异,又须使样本数量在可控制的范围之内 (金燕
和卢宝荣,2003)。种质取样保存的多少取决于
种内遗传多样性水平及分布状况,取样的居群数
理论上应覆盖整个分布区域并尽可能包含整体种
群分布的生态梯度,以最大限度的代表整个天然
种群;基于哈迪灢温伯格平衡 (Hardy灢weinberg
Equilibrium)提出的假设模型认为若使样本包
含种群95%以上的遗传变异或保存基因频率小
于0灡05的稀有等位基因则居群内取样数至少要
达到30个个体 (Sj昳grenandWy昳ni,1994);而对
表6暋采种居群数对后代群体遗传参数影响
Table6暋Influenceofsamplingpopulationnumberongeneticindexofoffspringpopulation
居群数
No.of
populations
观测等位
基因数
Na
有效等位
基因数
Ne
多态性位点数
No.of
polymorphicloci
多态性位点
百分率
P(%)
Nei曚s基因
多样性指数
h
Shannon曚s
指数
I
6 1灡55 1灡26 46 55灡42 0灡16 0灡25
保留率
Conservedpercentage(%)
94灡84 99灡26 86灡79 86灡78 95灡32 94灡34
7 1灡56 1灡27 47 56灡63 0灡16 0灡26
保留率
Conservedpercentage(%)
95灡58 99灡93 88灡67 88灡67 98灡13 96灡79
8 1灡58 1灡28 48 57灡83 0灡17 0灡26
保留率
Conservedpercentage(%)
96灡32 100灡59 90灡56 90灡56 100灡81 99灡29
表7暋每居群采种个体数对后代群体遗传参数影响
Table7暋Influenceofsamplingindividualproportionongeneticindexofoffspringpopulation
个体数
No.of
individuals
观测等位
基因数
Na
有效等位
基因数
Ne
多态性位点数
No.of
polymorphicloci
多态性位点
百分率
P(%)
Nei曚s基因
多样性指数
h
Shannon曚s
指数
I
10 1灡55 1灡27 45灡6 54灡94 0灡16 0灡25
保留率
Conservedpercentage(%)
94灡7 99灡7 86灡04 86灡04 96灡67 95灡12
20 1灡58 1灡28 48 57灡83 0灡17 0灡26
保留率
Conservedpercentage(%)
96灡32 100灡59 90灡56 90灡56 100灡81 99灡29
87暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋云暋南暋植暋物暋研暋究暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋增刊桗桏
不同遗传分化与空间遗传结构的物种,取样居群
数与个体数各有侧重,对于群体间较高遗传分化
而变异主要存在于居群内、遗传变异的空间结构
不显著的物种则应加大取样居群数以及居群内取
样个体数 (李昂等,2002)。
3灡2暋取样策略制定参数与方法
野生植物分布于一定的居群范围,相比栽培
作物可获得的性状数据非常有限,如何掌握充分
的群体信息 ‘档案暞获取遗传变异数据,并在此
基础上制定相应的种质收集保存策略,是野生濒
危植物迁地保护中需要首先考虑的问题。文献报
道中,有以等位酶电泳分析数据 (罗建勋等,
2007)、表型与分子标记数据相结合的 (张睿鹂
等,2008)以及单纯采用ISSR分子标记数据进
行野生群体遗传多样性 分 析 对 比 (Jin 等,
2003),建立针对不同植物的取样策略。
相对于表型性状,分子标记数据受环境影响
较小,并且随着分子标记技术的改进,能够提供
的信息量也在不断增多,从最初的等位酶标记一
直发展到 RAPD、SSR、ISSR以及 AFLP等分
子标记技术被相继采用以获取群体遗传多样性数
据资料 (周世良和叶文国,2002;Martins等,
2003)。表型更多反映的是获得表达基因所控制
的性状,而分子标记提供的一些稀有基因信息可
能并未表现在表型性状上,但在收集保护中也应
给予重视,毕竟保留更多变异有助于提高种的环
境适合度、减少灭绝风险 (HedrickandKali灢
nowski,2000)。实际制定采样策略时,可综合
考虑表型与分子标记分析数据,二者间相互对
照。以夏蜡梅为例,保留6个夏蜡梅居群进行取
样,应优先选择表型变异丰富的居群,天台大雷
山群体的夏蜡梅 (P8)变异系数最高 (陈香波
等,2010),与近临安夏蜡梅居群 (P1~P7)距
离较远成间隔分布,居群聚类分析与其它群体遗
传距离也最远,因此P8居群应作为优先取样群
体,而对地理距离较近的临安顺溪横源 (P3)
与直源群体 (P6)、大明山西坑 (P1)与大明山
景区群体 (P2),则考虑保留表型丰富、遗传多
样性较高的P3与P2群体进行取样。综合分析
认定,天台大雷山 (P8)、大明山景区 (P2)、
顺溪乡横源 (P3)、颊口镇前坑 (P4)、清凉峰
马啸 (P5)、安徽龙须山 (P7)这6个群体作为
遗传多样性迁地保护的样本群体进行取样,这样
既保留了夏蜡梅不同花色类型 (白、浅粉、粉、
粉红),同时也保留了遗传分化较为明显的两大
类群 (天台与近临安群体)。
取样居群确定以后,根据前述有关理论居群
内取样个体数至少应保持30个以上 (居群规模偏
小者除外),本研究每群体采取了30个个体 (天
台群体15株)共计255株构建初始取样群体,获
取代表群体总的ISSR分子标记变异数据,在此基
础上计算机模拟随机取样分析,计算结果捕获
95%的等位基因的个体取样比例应在30%,在初
始取样数量上进一步筛除,符合以最少的取样数
量代表最大程度遗传多样性的收集宗旨。
同样是计算机模拟取样,根据等位酶数据结
果计算出夏蜡梅个体取样比例在35%时可捕获
95%的等位基因 (李正宏,2005),与本研究30%
比例结果非常接近,可见当原始样本群体足够大
时,无论是共显性标记 (等位酶)或是显性标记
(ISSR)捕获等位基因增加趋缓时的个体数量比例
相当,此时标记方法对其的影响已非常有限。
在个别针对野生分布植物的核心种质构建中,
多以PopGene1灡32进行取样分析,确定保存数时
是经多次随机抽取不同比例的群体或个体 (一般
10次)分别计算群体多样性指标 (赵冰,2008;
宋丛文和包满珠,2005)再取平均值,分析数量
(重复数)偏少,而以PGDC1灡0软件分析,每一
抽样比例下模拟野外随机取样,可以产生1000个
随机样本,因为样本数量足够大,从而各项遗传
指标的平均数就比较稳定,降低了因为取样次数
少而产生波动的误差,因此,该取样方法相对更
加科学合理,应该在更多濒危植物迁地保护取样
时加以采用,以提高取样的精确度和取样效率。
3灡3暋取样后代群体的评价分析
本研究中,原始群体与种子采样后建立起的
人工群体遗传变化趋势非常相近,即随着取样居
群数与居群内取样个体数增加,包括多态性位点
百分率 (P)、群体总的基因多样度(Ht)/Nei曚s
基因多样性指数 (h)等在内的遗传参数均呈增
加的趋势,测得对于原始群体的遗传变异保留率
超过90%的群体与个体数与先前制定的取样策
略完全吻合,验证了该遗传多样性取样策略的科
学可行性。
97增刊桗桏暋暋暋暋 暋暋暋暋暋陈香波和田旗:夏蜡梅遗传多样性迁地保护取样策略研究暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋
当然取样保存只是实施迁地保护工程的第一
步,并不意味着全部工作的结束,后续工作中还
需对所建立起的迁地保护居群的遗传多样性进行
动态跟踪与监测 (韦霄等,2005),决定补充或
者完善。
华东地区重要的珍稀濒危植物—夏蜡梅能够
在上海辰山植物园落户、实现遗传多样性迁地保
护,其意义非常重要。通过这一种植物建立起的
遗传多样性取样保护模式,可为更多濒危植物迁
地保护提供参照与技术借鉴,也是向 “华东区域
性珍稀濒危植物保育暠目标更迈进了一步。
暡参暋考暋文暋献暢
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