全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 12 期 2014 年 6 月
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• 药材与资源 •
浙贝母特异性 PCR 鉴定方法研究
李 敏，黄龙妹，赵 欣，陈 强
浙江工业大学药学院，浙江 杭州 310032
摘 要：目的 利用特异性引物对浙贝母 Fritillaria thunbergii 进行特异性 PCR 鉴定。方法 回收 RAPD 扩增筛选到的浙贝
母分子标记 ZB1 基因，将其连接进入 T-载体克隆并测序。根据测序结果设计一对特异性引物 P2/P3，以贝母基因组 DNA 为
模板进行特异性 PCR 扩增。结果 特异性 PCR 鉴定结果为浙贝母在约 750 bp 处出现特异性条带，其他贝母品种则未出现条
带。 结论 浙贝母特异性 PCR 鉴定方法操作简单，准确、灵敏、重复性好，具有较好的应用前景。
关键词：浙贝母；RAPD；分子鉴定；特异性 PCR；分子标记
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)12 - 1754 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.12.020
Specific PCR identification of Fritillaria thunbergii
LI Min, HUANG Long-mei, ZHAO Xin, CHEN Qiang
College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310032, China
Abstract: Objective To identify Fritillaria thunbergii using special primer by specific PCR. Methods Gene footprint of F.
thunbergii named ZB1 was screened from RAPD amplification. Reclaimed ZB1 gene was inserted into T-vector to be cloned and
sequenced. One pair of specific primers P2/P3 were designed according to the ZB1 sequence, and applied in specific PCR reaction
using genome DNA of F. thunbergii as template. Results A specific band around 750 bp was detected in F. thunbergii, while nothing
appeared in other varieties. Conclusion The method is convenient, reproducible, and precise, with broad application prospects.
Key words: Fritillaria thunbergii Miq.; RAPD; molecular identification; specific PCR; molecular marker
浙贝母为道地药材“浙八味”之一，具有润肺
止咳的功效，用药历史悠久。贝母品种较多，除了
浙贝母外，贝母主要品种还包括川贝母、湖北贝母、
平贝母和伊贝母，另外流通领域还存在较多贝母伪
品。不同品种的贝母药效差异显著，而且价格相差较
大，需要建立一种准确、高效的鉴定方法[1-2]。目前，
较多学者利用 RAPD 技术对浙贝母及其他药材进行
分子鉴定，但是由于RAPD实验应用的是随机引物，
导致实验结果重复性差，无法推广应用[3-9]。
本实验室在贝母 RAPD 实验[10]的基础上筛选
到一条浙贝母分子标记，命名为 ZB1 基因。ZB1 基
因作为浙贝母分子标记，只存在于浙贝母中，在其
他品种中不存在，具有很高的特异性。本实验研究
ZB1 基因的克隆和测序，以及利用测序结果设计的
特异性引物，实现浙贝母特异性 PCR 鉴定。这种方
法由于使用了特异性引物，具有准确、高效的优点，
兼具灵敏度和适用性，可以制备成试剂盒推广应用，
具有极佳的应用前景。
1 材料与方法
1.1 材料
贝母品种包括浙贝母 Fritillaria thunbergii
Miq.、川贝母 F. cirrhosa D. Don、湖北贝母 F.
hupehensis Hsiao et K．C．Hsia、平贝母 F. ussuriensis
Maxim 和伊贝母 F. pallidiflora Schrenk，分别采自
于浙江、四川、湖北、吉林和伊犁贝母主产地。其
中浙贝母来自鄞州、磐安和象山 3 个不同产地。样
品经浙江工业大学华云芬副教授鉴定为正品。
快速植物基因组提取试剂盒、UNIQ-10 柱式
DNA 回收试剂盒、EZ-10 Spin Column Plasmid DNA
Minipreps Kit 及 PCR 相关试剂购自生工®生物工程
（上海）有限公司。RAPD 引物 P1 和特异性引物
P2/P3 由生工®生物工程（上海）有限公司合成。
pMD®18-T Vector 载体试剂盒由宝生物工程（大连）
有限公司生产。E. coli DH5α为实验室保存菌种。琼
收稿日期：2013-12-07
作者简介：李 敏（1975—），女，浙江杭州人，副教授，硕士生导师，研究方向为中药分子鉴定。Tel: 13757155117 E-mail: limin@zjut.edu.cn
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 12 期 2014 年 6 月
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脂糖、溴化乙锭、X-gal、IPTG、Amp、LB 液体培
养基、琼脂粉购自生工®生物工程（上海）有限公
司。实验使用的 PCR 扩增仪 MyCycleTM Thermal
Cycler，电泳仪 Power PacTM Basic，凝胶成像系统
Molecular Imager® Gel DocTM XR＋Imaging System，
均为 Bio-Rad 公司产品。
1.2 方法
1.2.1 RAPD 扩增 用快速植物基因组提取试剂盒
提取贝母基因组 DNA。以贝母基因组 DNA 为模板，
进行 RAPD 扩增，RAPD 引物 P1 的序列为
5’-CGACGAAGAA-3’。RAPD 扩增体系为：2 μL
10×PCR 缓冲液，1.2 μL MgCl2（25 mmol/L），0.5
μL dNTPs （ 10 mmol/L ）， 0.3 μL Taq DNA
polymerase，0.5 μL RAPD 引物 P1（20 μmol/L），1.2
μL 贝母基因组 DNA 模板，补加 ddH2O 至总体积为
20 μL。RAPD 扩增条件：95 ℃预变性 5 min，94 ℃
变性 30 s，42 ℃复性 30 s，72 ℃延伸 2 min，30 个
循环，最后 72 ℃延伸 5 min。RAPD扩增产物在 1.2%
琼脂糖凝胶中进行电泳，胶板经溴化乙锭染色后在
凝胶成像系统中进行观察，并照相保存。
1.2.2 浙贝母分子鉴定标记的回收、克隆和测序
分析 RAPD 扩增结果，将浙贝母分子标记用刀片小
心切下，用 UNIQ-10 柱式 DNA 回收试剂盒回收纯
化。将纯化产物与 pMD®18-T Vector 载体进行连接，
导入大肠杆菌 E. coli DH5α感受态细胞中进行增殖。
用灭菌牙签随机挑取数个在含有 X-gal、IPTG、Amp
的 LB 琼脂平板培养基上长出的白色单菌落，分别
接种于含 AMP 0.1 mg/mL 的 50 mL LB 液体培养基
中，37 ℃、300 r/min 振荡培养 10～12 h。用 EZ-10
Spin Column Plasmid DNA Minipreps Kit 从菌体培
养液中提取质粒。经过凝胶电泳鉴定后的重组质粒
由南京金斯瑞生物科技有限公司用 M13-47
（5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’）通用
引物进行序列测定。
1.2.3 浙贝母特异性 PCR 鉴定方法 根据测序结
果，设计并合成一对特异性引物 P2/P3，以贝母基
因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR 扩增体系：
2 μL 10×PCR 缓冲液，1.2 μL MgCl2（25 mmol/L），
0.5 μL dNTPs（10 mmol/L），0.3 μL Taq DNA
polymerase，0.5 μL 上游引物 P2（20 mmol/L），0.5
μL 下游引物 P3（20 μmol/L），1.2 μL 贝母基因组
DNA 模板（50 ng/μL），补加 ddH2O 至反应液总体
积 20 μL。PCR 扩增条件：95 ℃预变性 5 min，94 ℃
变性 30 s，60 ℃复性 30 s，72 ℃延伸 2 min，30 个
循环，最后 72 ℃延伸 5 min。PCR 扩增产物在 1.2%
琼脂糖凝胶中进行电泳，胶板经溴化乙锭染色后在
凝胶成像系统中进行观察，并照相保存。为了检测
浙贝母特异性 PCR 鉴定方法的灵敏度和适用范围，
将贝母基因组 DNA 模板分别进行梯度稀释和等量
混合后按照上述方法进行 PCR。
2 结果与分析
2.1 RAPD 扩增结果
RAPD 扩增图谱如图 1所示，该图谱条带清晰，
呈多态性分布，在 750 bp 处出现了只有浙贝母有，
而其他贝母均无的条带，表明其所含的基因片段为
浙贝母品种所特有，可以作为浙贝母分子标记，命
名为 ZB1 基因。
M-Marker 1-平贝母 2-湖北贝母 3-川贝母 4-浙贝母
M-Marker 1-F. cirrhosa 2-F. hupehensis 3-F. cirrhosa
4-F. thunbergii
图 1 RAPD 扩增图谱
Fig. 1 RAPD amplification
2.2 浙贝母分子标记的回收、克隆和测序
用刀片将750 bp处的条带小心切下后用胶回收
试剂盒进行回收，电泳检测结果见图 2。回收片段
大小约为 750 bp，条带清晰完整，没有降解弥散现
象，表明回收质量佳。将回收的 ZB1 基因与 T 载体
相连形成重组质粒后转化入大肠杆菌进行克隆。挑
选克隆子，提取重组质粒进行测序。测序结果（图
3）显示浙贝母分子标记的序列总长度为 745 bp，
5’端和 3’端出现了跟 RAPD 引物 P1 序列一致的回
文序列，表明此序列确为 ZB1 基因序列。
2.3 浙贝母特异性 PCR 鉴定方法
根据测序结果设计并合成一对特异性引物
P2/P3。引物序列为 P2：5’-ACAGTACTGGGGGA-
M 1 2 3 4
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 12 期 2014 年 6 月
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M-Marker 1-浙贝母分子标记 ZB1 基因
M-Marker 1-Molecular marker ZB1 from F. thunbergii
图 2 浙贝母分子标记 ZB1 基因电泳图
Fig. 2 Electrophoresis results of ZB1 gene
from F. thunbergii
GAAGTC-3’，P3：5’-CAAATGGAGGGTATGTGTCG-3’，
其分别对应于 ZB1 基因上的 14～33 位点和 713～
732 位点。以贝母基因组 DNA 为模板，特异性引物
P2/P3 为引物进行特异性 PCR 扩增，实验结果见图
4。来自 3 个不同产地的浙贝母基因组 DNA 均在约
750 bp 处扩增出单一明亮的条带，其他贝母品种在
此位点上均无条带出现。实验重复 5 次，实验结果
均保持稳定，证明应用浙贝母特异性 PCR 鉴定方
法，可以鉴定浙贝母，并且重复性好，明显改善了
RAPD 反应重复性差的缺点。
浙贝母基因组 DNA 模板的浓度被梯度稀释后进
行 PCR。PCR 结果见图 5，当模板浓度稀释 1 000 倍
后，即用量为 0.06 ng 时，在约 750 bp 处依然出现浙
贝母的特异性条带，经过多次重复验证，结果保持稳
5’-CGACGAAGAACGGACAGTACTGGGGGAGAAGTCAAATACTGTTTTATCTGCCTGAAGGCTGCTTCGCACTCTTCCGTCCATTCAAACTCTCTG
CTTCCTCATAGCATCGCTGTAAAAGTTTTTATCTTGTCCGATGATCTTGATATGAAGCGGTAAAGGGCTGCTATTCTTCCACTCAGTACCTGTATGTC
TTTCACTGTTTTGGGGCTTTCCATCCCCAGTATCGATTTTGTTTGCGCTGGATCTGCGCTGATTCTCTTCTTGTGCACTATGTGCCCTAAGAACTTAC
CTAAAGCTACTCCAAATATGCATTTTTTTGGATTCAATTTCAGGGAGAAGATGCGTAATCGGTCGAAGGCCTCCTCTAGGTTCTGGATATGATCCTC
CTTTTTAGAACTTTTTACCAGTAAATCATCAATTTATGTGCCTACTGTTTTCCCTAGTAGCCCTTGAAAGATTCTGGTAATCAACCGTTGAAAAGT
TGCTCCTGCATTCTTAAGTCCAAAGGGCATCACCGTGTAGCAATATAACCCTAAGGGAGTAGTGAAACTGGTGTGTTCCTCATCTTGCAGATTTAACT
TGATTTGATTATAGCCTGAACAGGCATCCAAAAAAGATATCCTCTCGTGACCCACCAGTGAGTCCACCAACTGGCATATCCGTGGTAGCGGGAAA
CTGTCCTTGGGACAGGCTTTATTTAGATCTGTGTAGTCGACACATACCCTCCATTTGCCGTTCTTCGTCG-3’
图 3 浙贝母分子标记 ZB1 基因的测序结果
Fig. 3 Sequence of ZB1 gene from F. thunbergii
M-Marker 1-鄞州产浙贝母 2-磐安产浙贝母 3-象山产浙贝母
4-川贝母 5-湖北贝母 6-平贝母 7-伊贝母
M-Marker 1-F. thunbergii from Yinzhou 2-F. thunbergii from
Panan 3-F. thunbergii from Xiangshan 4-F. cirrhosa 5-F.
hupehensis 6-F. ussuriensis 7-F. pallidiflora
图 4 浙贝母特异性 PCR 扩增图谱
Fig. 4 Specific PCR amplification of F. thunbergii
M-Marker 1-0.1%浙贝母基因组 DNA 2-1%浙贝母基 DNA
3-10%浙贝母基因组 DNA
M-Marker 1-0.1% DNA of F. thunbergii 2-1% DNA of F.
thunbergii 3-10% DNA of F. thunbergii
图 5 浙贝母特异性 PCR 鉴定方法对不同浓度
样品的鉴定图谱
Fig. 5 Specific PCR amplification of F. thunbergii
with different concentration
M 1
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1 2 3 4 5 6 7
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1 2 3
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
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定，证明浙贝母特异性 PCR 鉴定方法的灵敏度很高，
含量极微弱的浙贝母也能够被鉴定出来。将贝母基因
组 DNA 等量混合后进行 PCR。PCR 结果见图 6，
泳道 2 中为川贝母、湖北贝母、平贝母和伊贝母基
因组 DNA 的等量混合物，没有加入浙贝母基因组
DNA，结果显示无扩增条带出现。泳道 1 中加入的
为浙贝母、川贝母、湖北贝母、平贝母和伊贝母基
因组 DNA 的等量混合物，结果显示，750 bp 处出
现了明亮的条带，浙贝母在 5 种贝母的混合材料中
被很好地鉴定了出来。经过重复验证，结果保持稳
定，表明浙贝母特异性 PCR 鉴定方法不仅可以检测
单个浙贝母样品，还可以在混合物中检测出浙贝母，
适用范围较广。
M-Marker 1-浙贝母、川贝母、湖北贝母、平贝母和伊贝母混合基
因组 DNA 2-川贝母、湖北贝母、平贝母和伊贝母混合基因组 DNA
M-Marker 1-mixed DNA samples of F. thunbergii, F. cirrhosa, F.
hupehensis, F. ussuriensis, and F. pallidiflora 2-mixed DNA sample
of F. cirrhosa, F. hupehensis, F. ussuriensis, and F. pallidiflora
图 6 浙贝母特异性 PCR 鉴定方法对混合样品的鉴定图谱
Fig. 6 Specific PCR amplification of mixed samples
3 讨论
利用 RAPD 引物 P1 进行 RAPD 扩增后得到的
浙贝母分子标记 ZB1 基因是本实验室在大量工作
（近千条 RAPD 引物）基础上筛选出来的。该分子
标记在 RAPD 多态性分布良好的情况下，显示出特
异性条带清晰、明亮，是一条十分理想的分子标记。
ZB1 基因进行测序后，对其序列编码的蛋白质信息
进行了分析，发现该片段为非编码区。目前 GenBank
中尚未存储浙贝母基因序列，ZB1 基因序列是首个
被测定的浙贝母基因组 DNA 序列。在建立浙贝母
PCR 鉴定方法时，对退火温度进行了研究，当退火
温度低于 60 ℃时，图谱中会出现一些非特异性扩
增条带，所以浙贝母特异性 PCR 鉴定方法中的关键
条件为退火温度。本实验建立的浙贝母特异性 PCR
鉴定方法可以直接对单一样品进行鉴定，不需要通
过多种样品间的相互比较图谱来做出鉴定，这是该
法与 RAPD 的最大不同之处，因此该法具有操作简
单、准确、应用范围广等优点。浙贝母特异性 PCR
鉴定方法使用的是特异性引物，与 RAPD 相比，结
果重复性好、灵敏度高，适合开发成检测试剂盒，
具有很好的应用前景。
在检验特异性 PCR 鉴定方法时使用了 5 种贝
母主要品种，浙贝母选用了 3 个产地。今后打算
将研究内容扩展到其他贝母药用品种、贝母伪品
以及百合科非中药植物，以它们的基因组 DNA 为
模板来进一步验证该方法的准确性。还将在 ZB1
基因内部设计一条套嵌引物，与特异性引物 P2/P3
联合使用，利用套嵌引物进行浙贝母 PCR 鉴定，
其准确性将会进一步得到提高。
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M 1 2
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp