全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 10 期 2016 年 5 月

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博落回根中生物碱的组织化学定位研究
左 姿 1, 2，郑亚杰 2，梁之桃 4，邹剑峰 2，曾建国 1, 2, 3*
1. 湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208
2. 湖南农业大学兽用中药资源与中兽药创制国家地方联合工程研究中心，湖南 长沙 410128
3. 植物功能成分利用协同创新中心，湖南 长沙 410128
4. 香港浸会大学中医药学院，香港 九龙
摘 要：目的 建立激光显微切割结合HPLC-MS/MS 技术测定博落回根不同组织中血根碱、原阿片碱、别隐品碱、白屈菜红碱、二
氢白屈菜红碱和二氢血根碱的定量分析方法，开展博落回根的组织化学研究。方法 利用激光显微切割技术将两年生不同生长期博
落回根的木栓层、皮层、韧皮部、木质部维管束和木射线进行切割，HPLC-MS/MS 对切割的组织进行目标生物碱的检测。结果 6
种生物碱均有较宽的线性范围和良好的线性关系（r2＞0.996 6）；日内、日间精密度 RSD 均小于 2.4%；检出限和定量限最高分别为
0.29、0.57 ng/mL；重复性试验RSD 均小于 13.2%；加样回收率为 85.1%～133.9%，RSD 值为 9.4%～20.7%。苗期根的上述 5 个组织
中 6 种生物碱的总量分别为 0.14、0.10、0.07、0.16、0.11 μg/mm2；花期分别为 0.38、0.22、0.15、0.41、0.26 μg/mm2；果期分别为 0.46、
0.29、0.27、0.55、0.22 μg/mm2；果后期分别为 0.52、0.29、0.24、0.41、0.23 μg/mm2。结论 基于激光显微切割和LC-MS/MS 的组
织中生物碱的定量分析方法分辨率高、专属性强、灵敏度好、准确可靠；博落回根中 6 种生物碱主要分布在木栓层和木质部维管束。
关键词：博落回；生物碱；组织化学；激光显微切割；HPLC-MS/MS
中图分类号：R286.022 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)10 - 1785 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.10.026
Histochemical localization study of alkaloids in root of Macleaya cordata
ZUO Zi1, 2, ZHENG Ya-jie2, LIANG Zhi-tao4, ZOU Jian-feng2, ZENG Jian-guo1, 2, 3
1. School of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China
2. National and Provincial Union Engineering Research Center for the Veterinary Herbal Medicine Resources and Initiative, Hunan
Agricultural University, Changsha 410128, China
3. Hunan Co-Innovation Center for University of Botanicals Functional Ingredients, Hunan University of Chinese Medicine,
Changsha 410128, China
4. School of Chinese Medicine, Hong Kong Baptist University, Kowloon, Hong Kong SAR
Abstract: Objective To develop the quantitative analysis method combined with laser microdissection and LC-MS/MS technique
for determinating sanguinarine, protopin, allocryptopine, chelerythrine, dihydrochelerythrine, and dihydrosanguinarine in the roots
of Macleaya cordata, and performe the histochemical study on M. cordata roots. Methods The technology of
laser-microdissection was used to dissect the cork, cortex, phloem, xylem vascular bundles, and xylem rays from 2-year-old M.
cordata roots at different growth stages, the technique of LC-MS/MS was applied to detecting the contents of targeted alkaloids in
the microdissected tissues. Results The six kinds of alkaloids possesed a wide linear ranges and a good linear relationship (r2 >
0.996 6); The RSD of intra- and inter-day precision was all less than 2.4%; The highest limits of detection and quantification were
respectively 0.29 and 0.57 ng/mL; The repeatability RSD was below 13.2%. The recovery varied from 85.1% to 133.9%, and its
RSD ranged from 9.4% to 20.7%. The total amounts of six kinds of alkaloids in the above five tissues were respectively 0.14, 0.10,
0.07, 0.16 and 0.11 μg/mm2 for seedling stage root; 0.38, 0.22, 0.15, 0.41 and 0.26 μg/mm2 for flowering stage root; 0.46, 0.29,
0.27, 0.55 and 0.22 μg/mm2 for fruit stage root, and 0.52, 0.29, 0.24, 0.41 and 0.23 μg/mm2 for latering fruit stage root. Conclusion
The integrated method is high-resolution, specific, sensitive, and reliable for the quantitative analysis of alkaloid in tissues; The six
kinds of alkaloids are mainly located in corks and xylem vascular bundles from the roots of M. cordata.
Key words: Macleaya cordata (Willd.) R. Br.; alkaloids; histochemistry; laser-microdissection; HPLC-MS/MS

收稿日期：2016-02-01
基金项目：国家科技支撑计划项目（2012BAI29B04）
作者简介：左 姿（1991—），女，在读硕士，研究方向为中药化学与分析。Tel: 18773121174 E-mail: 1071260555@qq.com
*通信作者 曾建国（1965—），男，博士生导师，研究方向为中药资源与开发。Tel: (0731)84673824 E-mail: ginkgo@world-way.net
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博落回Macleaya cordata (Willd.) R. Br. 是罂粟科
（Papaveraceae）多年生草本植物，其带根全草属于传
统草药[1-2]。现代药理研究表明，博落回具有抗菌、抗
炎、改善肝功能、抗肿瘤、杀虫等活性[3]。以其提取
物制成的注射液对猪大肠杆菌病和传染性肠胃炎等
具有特效[4]。国内研发的美佑壮（Sangravit®）已经
被农业部批准为饲料添加剂，因具有抗炎促生长作
用，被用于替代饲用抗生素。原阿片碱（protopine，
PRO）、别隐品碱（allocryptopine，ALL）、血根碱
（sanguinarine，SG）、白屈菜红碱（chelerythrine，
CHE）、二氢白屈菜红碱（dihydrochelerythrine，
DHCHE）、二氢血根碱（dihydrosanguinarine，DHSG）
等异喹啉类生物碱被认为是其主要活性成分[5]。
目前，国内外博落回研究主要集中在成分[6-7]、
药理[8-9]等方面，而关于活性成分在植株体内的组织
分布规律少见报道。本研究团队在前期利用改良碘
化铋钾结合荧光显微镜法对博落回体内生物碱进行
了组织化学定位研究，但只能根据显色深浅来进行
相对定量，方法专属性不强，不能准确定位某一种
生物碱在植物组织中的分布[10]。激光显微切割结合
液相色谱-质谱联用技术能将同一类细胞用激光从
植物切片中分离出来，经适当样本前处理，采用液
相色谱-质谱联用仪对其进行定性和定量分析。
Liang[11-12]、Yi[13]和 Chen[14]等运用此法对青风藤、
大黄、柴胡及射干等药材次生代谢产物进行了定性、
定量研究，为药材品质评价和合理利用提供了科学
依据。本研究拟建立基于激光显微切割与高效液相
串联三重四级杆质谱联用仪（high performance
liquid chromatographytriple quadrupole，HPLC- QQQ）
相结合的定量分析方法，对不同时期博落回根不同
组织中的 PRO、ALL、SG、CHE、DHCHE 及 DHSG
的量进行分析检测，阐明目标化合物在不同组织的
分布，以期为进一步博落回根中生物碱合成、转运
和贮存机制研究奠定基础。
1 材料与仪器
1.1 材料
采自国家中药材生产（湖南）技术中心博落回
改良种植基地苗期、花期、果期及果后期的两年生
博落回植株根，经湖南农业大学曾建国教授鉴定为
罂粟科博落回属植物博落回 Macleaya cordata
(Willd.) R. Br. 的新鲜根。
1.2 仪器和试剂
美国 Agilent 公司 1260 液相色谱-6460 三重四极
杆串联质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI）；冷冻切片
机（英国 Thermo Shandon 公司）；显微镜滑动钢片（德
国 Leica Microsystems）；Leica LMD 7000 显微镜系统
（德国 Leica 公司）；AE204 型精密天平（上海梅特勒
托利多仪器公司），PRO、SG 和 CHE 购自中国食品
药品检定研究院。ALL、DHCHE 和 DHSG（自制，
质量分数大于 98.0%）。乙腈和甲醇（色谱级，德国
Merck 公司）；甲酸（色谱级，美国 Tedia 公司）；超
纯水。
2 方法
2.1 供试品溶液制备
新鲜根用冷冻切片机在−20 ℃的条件下切成
30 μm 的薄片，并迅速转移至显微镜滑动钢片的非
荧光 PET 膜上。载样钢片于 Leica LMD 7000 显微
镜系统荧光模式下观察并切割：DPSS 激光束波长
处于 349 nm，光圈 35，切割速度 3，能量 50～60 μJ。
每个组织的切割面积约 1.5×106 μm2，切割组织在
重力的作用下掉入 500 μL 的离心管（Leica，德国）
管帽中。4 ℃，1×104 r/min 离心 10 min 将组织样
本转移至离心管底部，加入 100 μL 甲醇，超声提取
30 min。1×104 r/min，4 ℃再次离心 10 min，移取
90 μL 的上清液至液相小瓶的内插管中，储存于 4
℃的冰箱，备用。
2.2 对照品溶液制备
精密称取 PRO、ALL、SG、CHE、DHCHE、DHSG
对照品适量，分别置于量瓶中，加入甲醇溶解并稀释
至刻度，得对照品储备液。精密吸取上述 6 种对照品
溶液混合制备成混合对照品储备液，PRO、ALL、SG、
CHE、DHCHE、DHSG质量浓度分别为1 025.6、935.9、
520.8、529.7、103.9、109.4 ng/mL。
2.3 HPLC-MS/MS 条件
色谱条件：色谱柱为 Agilent ZORBAX Extend
C18（100 mm×2.1 mm，3.5 μm，美国）；柱温为 40
℃；进样量为3 μL；流动相为0.2%的甲酸水溶液（A）
和乙腈（B）；梯度洗脱程序为 0～5 min，15%～28%
B；5～10 min，28%～100% B；10～15 min，100%
B；体积流量为 0.4 mL/min。
质谱参数：离子源为电喷雾离子源，采用正离
子扫描模式；雾化气为氮气；雾化气压力为 379 kPa；
检测方式为多反应离子监测（MRM）；干燥气温度
为 320 ℃；干燥气体积流量为 12 L/min；毛细管电
压为＋3 500 V。6 种生物碱的定性和定量离子对及
相关参数见表 1。
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表 1 目标化合物的质谱参数
Table 1 MS parameters for targeted compounds
碰撞能/V 化合物 定量离子对 (m/z) 定性离子对 (m/z) 驻留时间/ms 碎裂电压/V 定量 定性
PRO 354.1→189.0 354.1→188
354.1→149
100 150 30 30
22
ALL 370.2→188.0 370.2→290
370.2→189
100 150 26 26
34
SG 332.1→217.0 332.1→217
332.1→275
200 162 57 41
CHE 348.1→304.0 348.1→304
348.1→333
100 135 18 29
DHCHE 350.1→334.0 350.1→335
350.1→318
100 132 26 18
40
DHSG 334.1→318.0 334.1→319
334.1→304
100 136 30 18
18

2.4 HPLC-MS/MS 方法学考察
2.4.1 标准曲线的绘制 精密吸取 7 个不同质量浓
度的混合对照品溶液 3 μL，进样，记录各待测组分
的色谱峰面积，以各成分的质量浓度为横坐标（X），
各成分的峰面积为纵坐标（Y），利用最小二乘法进
行线性回归分析，得各化合物标准曲线，见表 2。
表 2 标准曲线方程及其线性范围和相关系数
Table 2 Standard curve equations, linear ranges, and
correlation coefficients
化合物 标准曲线方程 线性范围/(ng·mL−1) r2
PRO Y＝1 355 X＋30 783 5.1～1 025.6 0.996 6
ALL Y＝1 561 X＋15 737 4.7～ 935.9 0.998 9
SG Y＝177 X＋66 0.5～ 260.4 1.000 0
CHE Y＝325 X＋133 2.7～ 529.7 0.999 9
DHCHE Y＝6 644 X＋1 321 0.5～ 103.9 0.999 0
DHSG Y＝6 808 X＋123 0.6～ 109.4 1.000 0

2.4.2 定量限和检出限 将对照品溶液进样分析，
测定信噪比（S/N），将对应的 S/N＝10 和 S/N＝3 的
各标准溶液质量浓度分别作为定量限（LOQ）、检
出限（LOD）。PRO、ALL、SG、CHE，DHCHE 和
DHSG LOD 分别为 0.013、0.018、0.056、0.285、
0.006、0.007 ng/mL，LOQ 分别为 0.066、0.092、0.56、
0.57、0.013、0.013 ng/mL。
2.4.3 精密度试验 取含 PRO、ALL、SG、CHE、
DHCHE 及 DHSG 质量浓度依次为 51.3、46.8、26.0、
26.5、5.2、5.5 ng/mL 的对照品溶液，连续进样 3 d，
每次连续进样 5 针，记录各峰面积，计算峰面积的
RSD，考察仪器的日内和日间精密度。日内精密度
的 RSD 在 0.7%～1.6%，日间精密度的 RSD 为
1.8%～2.4%。
2.4.4 稳定性试验 取样本 3 木质部维管束组织，
按“2.1”项方法制备，于室温条件下放置，分别在
0、2、4、8、12、24、48 h 进样，记录各待测物各
时间点的峰面积，分别计算峰面积 RSD，考察样本
的稳定性。48 h 内的稳定性试验的 RSD 为 4.7%～
8.4%。
2.4.5 重复性试验 选取样本 3 连续切 3 片，
每个横切片上挑选 3 个以上的点激光切割木质
部维管束 1.5×106 μm2，获得 3 个重复性考察
样本，按“2.1”项样本制备方法制得重复性试
验供试品溶液，精密吸取 3 μL 进样，记录各样
本中各待测物的峰面积，分别计算 RSD 均低于
13.2%。
2.4.6 加样回收率试验 选取样本 3 连续切 6 片，
每个横切片上挑选 3 个以上的点激光切割木质部维
管束 7.5×105 μm2，每个回收率样本中加入 PRO、
ALL、SG、CHE、DHCHE 及 DHSG 对照品，按“2.1”
项制备，记录各峰面积，计算峰面积的 RSD，考察
方法的准确性。加样回收率为 85.1%～133.9%，RSD
为 9.4%～20.7%。
上述结果表明基于 HPLC-MS/MS 的定量分
析方法灵敏度高、稳定性好、准确可靠。由于组
织细胞中代谢的差异性，切割的组织样本中的代
谢物水平存在不均匀性，并且切割样本在微量水
平，因此本研究中重复性试验和加样回收率试验
的 RSD 值相对较大，但认为仍在可以接受的范围
内[11-12]。
2.5 切割样本中目标化合物的定量分析检测
将各样本切割下来的组织样品，按“2.1”项中
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的方法得到供试品溶液，经色谱柱分离后注入质谱
仪进行定量分析检测，所得峰面积代入相应的标准
曲线，计算单位面积中各目标生物碱的量。
3 结果与分析
3.1 HPLC-MS/MS 分析方法建立
在色谱分离条件优化过程中，流动相酸度的调
节可改善色谱峰的峰形及分离度，并对质谱离子源
中化合物的离子化效率产生影响。本研究通过对流
动相的 A 和 B 相中甲酸的不同添加比例进行考察，
最终发现 0.2%甲酸水溶液-乙腈效果最佳。随后对
不同的柱温 30、35、40、45 ℃对色谱分离效果的
影响进行了考察，结果表明当柱温设定为 40 ℃时，
色谱峰的分离度最佳。
将色谱条件和质谱参数确定后，各生物碱
对照品溶液不经色谱柱分离分别直接注入质谱
仪，在正离子检测方式下对各目标化合物进行
一级质谱扫描，得到每种生物碱的分子离子数
据，继续对每种生物碱的分子离子进行二级质
谱扫描，得到相应的子离子信息。随即对各目
标化合物的源内碎裂电压、碰撞能量（CE）等
参数进行优化，使每种生物碱的子离子的强度
达到最大，最后选择各目标化合物的定性和定
量离子对，建立了各目标生物碱化合物的 MRM
定量分析方法。如图 1 所示，各目标化合物具
有良好的峰形和分离度。


图 1 PRO、ALL、SG、CHE、DHCHE 及 DHSG 的 MRM
模式下的代表色谱图
Fig. 1 Represent MRM chromatogram for PRO, ALL, SG,
CHE, DHCHE, and DHSG
3.2 组织荧光特点及激光切割
根据在显微镜下观察到的样本切片的横切面，
将其分成木栓层、皮层、韧皮部、木质部维管束及
木射线（图 2-B）。可看出博落回根不同组织具有不
同的形态学特征，如木栓层由几列排列整齐的细胞
组成，皮层较宽广且细胞疏松，韧皮部狭窄且细胞
较小，木质部维管束和木射线相对较宽阔。在荧光
显微镜下不同的组织显示出不同的荧光，如木栓层
显示红棕色荧光，皮层显示黄偏蓝色荧光，韧皮部
显示黄色荧光，木质部维管束显示出亮橙色荧光，
而木射线则显示出浅蓝色荧光（图 2-B）。
据文献报道[9,11]，植物组织呈现的荧光颜色常
常与其中所含代谢产物的类型和量相关。值得注意


图 2 激光显微切割过程及博落回根横切面在紫外显微镜下的微观成像
Fig. 2 Process of laser-microdissection and microscopic imaging of cross section from M. cordata root under UV microscopy
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
DHSG
DHCHE
PRO
ALL
CHE
SG
A
切片









激光显微切割

激光切割前 激光切割后








管帽中
组织样
本成像
木栓层
皮层
韧皮部
木质部
维管束
木射线
t/min
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的是，在博落回根整个切片中木栓层和木质部维管
束呈现出最强的荧光，暗示这 2 个组织中生物碱的
类型和量可能具有其特殊性。本研究结合不同组织
的形态学特点及其在荧光显微镜下呈现不同颜色将
其辨认，并用激光将其切割开来（图 2-A）。
3.3 切割组织样品中各目标生物碱的测定
利用上述建立的 HPLC-MS/MS 定量分析方
法，对切割样品中各目标生物碱的进行检测，所得
结果见表 3。从表 3 中可以看出，同一组织在不同
生长时期的植株根中所含同一目标生物碱的量不
同，如木栓层中 PRO 的单位面积量在两年生植株
根的苗期为 0.041 μg/mm2，在其花期为 0.18
μg/mm2；不同组织在同一生长时期植株根中同一
目标生物碱的单位面积量也不同，如在两年生根的
苗期 PRO 在木栓层、皮层、韧皮部、木质部维管
束及木射线中的量分别为 0.041、0.040、0.029、
0.078、0.055 μg/mm2。但总体来说，各个生长期 6
种生物碱的量在木栓层和木质部维管束中高于其
他组织，结合在荧光显微镜下观察到的木栓层和木
质部较其他组织呈现更强荧光这一结果，推测可能
博落回根显示出的荧光强度与其中所含 PRO、
ALL、SG、CHE、DHCHE 和 DHSG 的量呈正相关。
另外，本研究团队前期利用改良碘化铋钾结合荧光
显微镜法对博落回根中生物碱进行了组织化学染
色，发现沉淀反应后维管柱的导管附近颜色更深的
结果与本研究相一致[10]。
表 3 博落回根不同生长期、不同切割组织样品中目标化合物的量
Table 3 Contents of targeted compounds in different dissected tissue samples from various growing stages M. cordata roots
化合物量/(μg·mm−2) 生长时期 组织
PRO ALL SG CHE DHCHE DHSG 总量
木栓层 0.041 0.087 3.3×10−3 4.5×10−3 4.0×10−4 1.5×10−3 0.14
皮层 0.040 0.055 7.6×10−4 1.1×10−3 2.1×10−4 1.7×10−4 0.10
韧皮部 0.029 0.036 7.2×10−4 8.5×10−4 1.8×10−4 1.2×10−4 0.07
木质部维管束 0.078 0.079 2.3×10−3 1.2×10−3 2.6×10−4 2.9×10−4 0.16
苗期
木射线 0.055 0.057 6.8×10−4 4.6×10−4 1.7×10−4 1.7×10−4 0.11
木栓层 0.180 0.160 0.030 0.015 1.7×10−4 9.0×10−4 0.38
皮层 0.110 0.095 5.6×10−3 7.2×10−3 2.0×10−4 2.1×10−4 0.22
韧皮部 0.075 0.074 2.2×10−3 2.9×10−3 1.0×10−4 1.0×10−4 0.15
木质部维管束 0.210 0.180 8.5×10−3 5.5×10−3 4.4×10−4 6.4×10−4 0.41
花期
木射线 0.150 0.120 1.7×10−3 1.2×10−3 1.1×10−4 9.0×10−5 0.26
木栓层 0.160 0.250 0.014 0.019 3.0×10−4 4.7×10−4 0.46
皮层 0.120 0.160 5.3×10−3 0.012 2.9×10−4 2.2×10−4 0.29
韧皮部 0.120 0.130 4.4×10−3 8.1×10−3 1.4×10−4 1.0×10−4 0.27
木质部维管束 0.230 0.260 0.030 0.024 5.7×10−4 1.2×10−3 0.55
果期
木射线 0.096 0.120 1.9×10−3 2.6×10−3 3.0×10−5 5.0×10−5 0.22
木栓层 0.170 0.260 0.040 0.046 8.0×10−4 2.9×10−3 0.52
皮层 0.120 0.170 1.1×10−3 3.2×10−3 9.0×10−5 7.0×10−5 0.29
韧皮部 0.110 0.120 6.6×10−4 1.2×10−3 6.0×10−5 5.0×10−5 0.24
木质部维管束 0.240 0.160 0.015 3.9×10−3 1.6×10−4 6.6×10−4 0.41
果后期
木射线 0.130 0.100 4.2×10−4 4.1×10−4 4.0×10−5 6.0×10−5 0.23

4 讨论
本研究建立了激光显微切割与 HPLC-MS/MS
技术相结合的博落回根中生物碱的组织化学定量分
析方法，经系统的方法学考察，结果表明该方法具
有专属强、灵敏度高及准确可靠的特点，能够满足
激光显微切割所获得的微量或痕量样品中的生物碱
类成分的定量分析检测。利用该定量分析方法对博
落回根中木栓层、皮层、韧皮部、木质部维管束和
木射线中的 PRO、ALL、SG、CHE、DHCHE 和
DHSG 的量进行了检测，发现这 6 种生物碱主要积
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累在木栓层及木质部维管束。
早期研究者常常利用组织化学染色的方法对植
物组织中的次生代谢产物进行组织化学研究[15-18]，
尽管该方法快速、简单，然而有些化学反应专属性
并不强，容易呈现假阳性反应，如用碘化铋钾定位
植物组织中的生物碱，蛋白质、多肽、鞣质等常产
生干扰反应而影响研究结果的准确性。并且化学染
色法只能根据显色的颜色深浅来相对定量某类次生
代谢产物在组织中的分布，不能定位具体一种化合
物[15-16]，缺乏客观数据显示的差异。本研究利用基
于激光显微切割与 HPLC-MS/MS 技术相结合的方
法实现了组织中代谢产物的特异性定量分析，能做
到定性与定量相结合，为博落回根组织中生物碱的
合成积累研究提供了基础。
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