全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 7 期 2014 年 4 月

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铁皮石斛丙酮酸激酶基因的克隆与表达分析
张 琳 1，蔡 茜 1，张大为 2，张 岗 1, 2*，郭顺星 2*
1. 陕西中医学院药学院 陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 西安 712046
2. 中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193
摘 要：目的 克隆珍稀濒危药用植物铁皮石斛丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）基因（DoPK），并进行生物信息学分析以
及检测基因在不同器官中的表达情况。方法 采用 RACE 技术获得基因的全长 cDNA；利用生物信息学软件预测蛋白的理化性
质、结构域及亚细胞定位等分子特性；用 DNASTAR 6.0 和 MEGA 4.0 分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析；借助 r 实
时荧光 (real-time quantitative) PCR (RT-qPCR)分析基因在不同器官中的表达情况。结果 克隆获得 DoPK（GenBank 注册号
KC178572）的 cDNA 全长 1 895 bp，编码一条由 511 个氨基酸组成的多肽，相对分子质量为 55 040，等电点 7.00；DoPK 基因
与江南卷柏、拟南芥、马铃薯和葡萄等植物的 PK 基因有 71%、86%、89%和 91%的相似性；DoPK 蛋白包含保守的丙酮酸激
酶结构域（21～497）和活性位点（235～247）；DoPK 属于胞质型的 CYTOSOLIC-1 亚类，与单子叶植物亲缘关系较近；DoPK
基因为组成型表达，其转录本在石斛茎中的相对表达量较高，为叶中的 2.29 倍，根中次之,为叶中的 1.28 倍。结论 克隆了胞
质型的铁皮石斛 DoPK 基因的全长 cDNA 序列，为进一步研究其在铁皮石斛生长发育中的作用奠定基础。
关键词：铁皮石斛；丙酮酸激酶；基因克隆；表达分析；生物信息学
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)07 - 0990 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.07.018
Cloning and expression analysis of pyruvate kinase gene in Dendrobium officinale
ZHANG Lin1, CAI Xi1, ZHANG Da-wei2, ZHANG Gang1, 2, GUO Shun-xing2
1. Shaanxi Provincial Key Laboratory for Chinese Medicine Basis & New Drugs Research, College of Pharmacy, Shaanxi
University of Chinese Medicine, Xi’an 712046, China
2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing
100193, China
Abstract: Objective To clone the pyruvate kinase (PK) gene DoPK in a rare and endangered medicinal plant Dendrobium officinale, followed
by bioinformatic analysis and to detect the expression in different organs. Methods RT-PCR and RACE technologies were used to clone the full
length cDNA of DoPK gene. The molecular characteristics such as physiochemical properties, conserved domain, and sub-cellular localization of
the deduced DoPK protein were determined using a series of bioinformatic tools. The analyses of multiple alignment and phylogenetic tree were
performed using DNASTAR 6.0 and MEGA 4.0 softwares, respectively. Real time quantitative PCR (RT-qPCR) was used for gene expression
analysis in different organs. Results The full length cDNA of DoPK was 1 895 bp in length (GenBank accession KC178572) and encoded the
protein of 511 amino acids with a molecular weight of 55 040 and an isoelectric point (PI) of 7.00. Sequence analysis demonstrated that DoPK was
similar to PK genes from Selaginella moellendorffii, Arabidopsis thaliana, Solanum tuberosum, and Vitis vinifera with the identities of 71%, 86%,
89%, and 91%, respectively. The deduced DoPK protein contained the conserved PK domain (21—497) and the active site (235—247).
Phylogenetic analysis indicated that DoPK was grouped into the CYTOSOLIC-1 subfamily and was closely related to monocots. The
transcription level of DoPK in the stems of D. officinale was the highest (2.29-fold higher than that in the leaves), followed by that in the roots
(1.28-fold). Conclusion The full length cDNA sequence in a CYOTOSLIC DoPK gene is identified, facilitating further functional analysis of the
gene involving in the growth and development of D. officinale.
Key words: Dendrobium officinale Kimura et Migo; pyruvate kinase; gene cloning; expression analysis; bioinformatics

收稿日期：2013-11-18
基金项目：国家自然科学基金资助项目（31070300，31101608）；陕西省科技计划青年科技新星项目（2012KJXX-44）
作者简介：张 琳，女，硕士，实验师，主要从事药用植物资源学研究。E-mail: 34368230@qq.com
*通信作者 张 岗，男，博士，副教授，主要从事药用植物分子生物学研究。E-mail: zhanggang2006@gmail.com
郭顺星，博士，研究员，主要从事药用植物菌根生物学研究。Tel/Fax: (010)62829619 E-mail: sxguo1986@163.com
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糖酵解（glycoylsis）是所有生物细胞糖代谢过
程中的首个重要生化途径，即葡萄糖在细胞质中经
一系列酶促反应分解成丙酮酸，伴有少量 ATP 和
NADH 的合成[1]。丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）
是糖酵解途径最后一步关键限速酶，催化磷酸烯醇
式丙酮酸（PEP）将高能磷酸键转移给 ADP 生成
ATP 和一分子丙酮酸，丙酮酸作为重要的前体代谢
物参与细胞三羧酸循环（TCA）、萜类甲基赤藓醇磷
酸途径（MEP）和部分氨基酸合成等多种生理生化
反应过程[2]。因此，PK 在细胞基础代谢过程中起重
要作用。
植物 PK 存在胞质型（CYTOSOLIC）和质体型
（PLASTIDIAL）2 种同工酶：PKc 和 PKp，通常由
PK 基因家族的不同成员编码，以满足植物生长发育
的需要[2]。大量研究证实 PK 在植物细胞生理代谢和
生长发育过程起关键调控作用。转基因烟草叶片缺乏
PKc 导致植株生长、碳元素和暗呼吸的改变[3]。利用
RNAi 技术抑制 PKc 基因的马铃薯植株，呈现丙酮
酸、有机酸量以及异养植物组织交替氧化蛋白水平
下降等表型[4]。拟南芥和油菜 PK 调控光合产物转
化为油[5-6]。最近的研究发现，水稻 OsPK1 基因的
T-DNA 插入失活突变体矮化、有鞘包穗、结实率
严重降低[7]，且表现出 ABA/GA 平衡的变化以及
抗氧化压力增加[8]。可见，PK 通过细胞糖代谢、
能量代谢以及激素信号转导等多途径调控植物体
的生长发育。
铁皮石斛 Dendrobium officinale Kimura et Migo
为兰科（Orchidaceae）石斛属 Dendrobium Sw. 多年
生草本植物，药用部位为新鲜或干燥茎，具有益胃生
津、滋阴清热、润肺止咳、明目强身等作用，是石斛
属药用植物中最为珍稀名贵的种[9]。石斛属植物普遍含
有倍半萜类、菲酚类、双苄酚类、芴酮类、生物碱以
及多糖等主要活性成分。多糖是药用石斛最重要的有
效成分之一，具有抗氧化、抗肿瘤、调节免疫及降低
血糖等功效[10]。解析石斛多糖的生物合成以及分子调
控具有重要的理论和实践意义。PK 作为细胞糖代谢的
重要元件，可能对石斛多糖合成代谢调控有一定作用。
前期，本课题组分离得到一条 569 bp 的EST（未发表
资料），与玉米丙酮酸激酶基因（GenBank 注册号
NP_001150269）有很高的相似性（92%）。本研究首
次进行铁皮石斛丙酮酸激酶基因（DoPK）的分子克
隆及生物信息学序列分析，旨在为深入研究该基因在
石斛糖代谢以及生长发育中的生物学作用提供基础。
1 材料与方法
1.1 材料
材料采自云南西双版纳，经笔者鉴定为野生铁
皮石斛 Dendrobium officinale Kimura et Migo 全株，
取石斛根、茎、叶组织样品，液氮速冻后置−80 ℃
保存备用。
1.2 RNA 提取和 cDNA 合成
按照 EASYspin 植物 RNA 快速提取试剂盒
（Aidlab，中国）操作说明制备各样品总 RNA，
NanoDropTM 2000 分光光度计（Thermo Fisher，美
国）分析 RNA 质量、纯度，琼脂糖凝胶电泳检测
完整性。按照 M-MLV Reverse Transcriptase Kit
（Promega，美国）操作说明，逆转录合成 cDNA 第
一链，−20 ℃保存备用。
1.3 RACE 与 RT-PCR 验证
根据原 EST 序列，设计两条基因特异引物，按
照 SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit
（Clotech，日本）说明书进行 5’/3’-RACE PCR 反应。
以 1 μg 铁皮石斛叶总 RNA 为模板，利用
SMARTScribeTM Reverse Transcriptase（Clotech，日
本）进行逆转录合成 5’/3’-RACE ready cDNA。
5’-RACE 引物为 DoPK-GSP-R 5’-GCGTTGGGCG-
TGGAGACTTGATCATA-3’； 3’-RACE 引物为：
DoPK-GSP-F 5’-GAAATCCTACGGGAGACGGAC-
GCCTT-3’。DoPK-GSP-F/R 分别与 UPM 引物组合，
按照试剂盒中 Program 1 程序进行 5’/3’-RACE。反
应体系为：2.0 μL 10×Advantage® 2 PCR buffer，0.4
μL 、 10 mmol/L dNTPs ， 0.4 μL 10 μmol/L
DoPK-GSP-F/R/UPM，0.5 μL 5’-RACE ready cDNA，
0.4 μL，5 U/μL 50×Advatange® 2 Polymerase Mix，
补 ddH2O 至 20 μL。PCR 产物经电泳分析，回收目
的条带、克隆并测序，与原序列拼接分析后，设计
跨开放阅读框（open reading frame，ORF）引物
DoPK-ORF-F 5’-TCTTAGGTTTTGGCCGCG-3’ 和
DoPK-ORF-R 5’-TCCCGGCGATGCTTATGT-3’，以
铁皮石斛叶 cDNA 第一链为模板，Ex TaqTM DNA
聚合酶（Takara，中国）进行 RT-PCR。反应体系为：
2.0 μL 10×Ex TaqTM PCR 缓冲液，0.4 μL、10
mmol/L dNTPs，10 μmol/L DoPK-ORF-F/R 引物各
0.4 μL，1 μL cDNA，0.4 μL 5 U/μL Ex TaqTM DNA
Polymerase，补 ddH2O 至 20 μL。PCR 程序为 95 ℃
3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32
个循环；72 ℃延伸 10 min；4 ℃保温。PCR 产物
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经克隆、测序分析以验证基因 cDNA全长的可靠性。
1.4 基因克隆和序列分析
PCR产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳，TianGen胶
回收试剂盒（TianGen，中国）纯化目的条带，连接
至 pMD18-T vector（Takara，中国），转化大肠杆菌
Escherichia coli JM109感受态细胞，随机挑选 3个
克隆送上海生工测序。使用 BLASTX、ORF Finder
进行 cDNA 序列分析；InterProScan 和 PROSITE
SCAN 在线分析 DoPK 蛋白质的结构域和基元；
Protparam和SOPMA分析蛋白质理化性质和二级结
构；SignalP 4.0和 TMpred预测蛋白质信号肽和跨
膜区域；PSORT进行蛋白质亚细胞定位分析。采用
DNASTAR 6.0 进行氨基酸序列比对分析；借助
MEGA 4.0构建系统进化树。
1.5 实时定量 PCR 分析
分别用 2 μg根、茎、叶样品总 RNA反转录合
成 cDNA，以铁皮石斛延伸因子 1α（elongation
factor，EF1α）[9]作为内参基因，qPCR 分析 DoPK
基因的组织表达模式。qPCR 引物 DoPK-qPCR-F
5’-GTGGTGGTTCCTGTGCTGAC-3’和DoPK-qPCR-
R 5’-CCTAAGTATGCTGGTGTTCGCT-3’的扩增产
物长 376 bp。将 cDNA第一链原液稀释 20倍作为
qPCR反应的模板。用 ABI PRISM 7500实时荧光定
量 PCR仪（Applied Biosystems，美国）进行 qPCR。
反应体系 25 μL包括 2×SYBR® Premix Ex TaqTM
Master Mix（Takara，中国）12.5 μL，正反向引物
（10 μmol/L）0.5 μL，ROX 0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O
9 μL。每个反应重复 3次，包括不加模板的对照，
实验重复 3次。PCR程序为 95 ℃、30 s，95 ℃、
10 s，60 ℃、45 s，40个循环，反应结束绘制熔解
曲线。根据 ABI PRISM 7500 SDS 软件（Applied
Biosystems，美国）生成的循环阈值（cycle threshold，
CT），用 2−ΔΔCt方法[11]计算相对表达量。
2 结果与分析
2.1 DoPK 基因克隆和全长验证
经过 5’/3’-RACE 反应，扩增产生长度约为
1 200 bp的目标条带（图 1），克隆、测序分别获得
1 035、1 041 bp的序列，拼接分析获得了一条 1 895
bp 的 cDNA。BLASTx 分析表明，其与 GenBank
中已注册的江南卷柏 Selaginella moellendorffii
Hieron.、拟南芥 Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.、
马铃薯 Solanum tuberosum Linn. 和葡萄 Vitis vinifera
Linn. 的 PK基因（XM_002982399、NM_120944、
P22200、XM_002270364）分别有 71%、86%、89%
和 91%的相似性，因此定名为DoPK，提交GenBank
并获得注册号 KC178572。DoPK 基因的 ORF 长
1 533 bp，5’-UTR长 101 bp，3’-UTR长 233 bp，
具有真核生物特有的 polyA尾巴结构，起始密码子
附近碱基序列 GTGATGG 遵循 KOZAK 规则，即
A/GNNATGG[12]。使用 DoPK-ORF-F/R 引物，
RT-PCR扩增产生特异目标条带（图 1），克隆、测
序获得 1 712 bp的序列包含完整 ORF，与拼接序
列一致，进而验证成功获得 DoPK 基因的全长
cDNA。

1-5’-RACE产物 2-3’-RACE产物 3-全长基因 M-Marker
1-5’-RACE product 2-3’-RACE product 3-Full length gene M-Marker
图 1 DoPK 基因全长 cDNA 克隆
Fig. 1 Clone of full length cDNA of DoPK in D. officinale
2.2 DoPK 基因的编码蛋白理化特性分析
Protparam 预测 DoPK 基因编码蛋白的分子式
为 C2425H4021N655O735S29，等电点 7.00、相对分子质
量 55 040；DoPK蛋白带正电残基（Arg＋Lys）为
61，负电残基（Asp＋Glu）为 61。该蛋白的不稳定
系数为 29.52，脂肪系数为 103.25，亲水性系数为
0.066。SOPMA 分析表明，DoPK 蛋白的二级结构
主要由 α螺旋（35.69%）、延伸链（20.98%）、β转
角（8.63%）和随机卷曲（34.71%）组成。
2.3 DoPK 蛋白结构域、定位和跨膜区分析
InterProScan分析显示，DoPK基因编码蛋白含
有保守的丙酮酸激酶结构域（21～497）和活性位点
（235～247）。PROSITE Scan分析表明，DoPK蛋白
含有数目不等的基元（motif），包括 1个 N-糖基化
（52～55），1 个 cAMP-cGMP 依赖蛋白激酶磷酸化
位点（216～219），8个依赖蛋白激酶 C磷酸化位点
（116～118、127～129、161～163、191～193、307～
309、407～409、460～462、476～478），8 个酪蛋

2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp

M 1 M 2 M 3
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白激酶 II 磷酸化位点（189～192、191～194、239～
242、311～314、357～360、377～380、436～439、
464～467），7 个 N-端酰基位点（45～50、106～111、
121～126、160～165、202～207、404～409、459～
464），1 个细胞附着序列（264～266）和 1 个异戊
烯基结合位点（507～510），这些保守基元可能对蛋
白结构和功能有重要作用。
SignalP 4.0 和 TMpred 分析 DoPK 蛋白不含信
号肽或跨膜结构域。PSORT 预测 DoPK 蛋白定位于
叶绿体间质的可能性较高为 63.8%，定位于内质网
质和质膜的可能性分别为 85%和 44.0%，定位于叶
绿体类囊体膜和过氧化物酶体的几率分别为 30.6%
和 30.0%。
2.4 氨基酸序列比对和进化分析
运用DNAStar 6.0中的MegAlign程序，对DoPK
基因编码蛋白与 4 种植物的 4 个 PK 蛋白进行多序
列比对的结果表明（图 2），DoPK 与葡萄（Vitis
vinifera L., Vv，XP_002270400）、番茄（Solanum
lycopersicum Mill.，Sl，XP_004236881）、百合（Lilium
longiflorum Thunb.，Ll，AAF44707）和蓖麻（Ricinus
communis Linn.，Rc，XP_002513157）PK 蛋白的一
致性分别为 90.6%、89.6%、89.2 和 87.7%。
按照 Oliver 等[4]构建的 PK 蛋白分子进化树，下
载具有代表性的拟南芥、水稻 Oryza sativa Linn.、啤
酒酵母 Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C.
Hansen和贝酵母Saccharomyces bayanus Sacc. 等物种
PK 氨基酸序列，使用 MEGA 4.0 软件邻接法
（Neighbour-joining, NJ）构建系统进化树（图 3）。结
果表明，26 条 PK 蛋白分为 PLASTIDIAL 和
CYTOSOLIC 两大类群，DoPK隶属于CYTOSOLIC-1
亚类，与水稻 PK（LOC_Os4g58110）聚在一起，表
明其与单子叶植物亲缘关系较近。
2.5 DoPK 基因在不同器官中的表达分析
分别提取铁皮石斛根、茎、叶等样品总 RNA，
利用 qPCR 技术检测 DoPK 基因在不同器官中的表
达。图 4 结果表明，DoPK 基因在 3 种器官中为组
成型表达，在茎中表达量较高，为叶中的 2.29 倍，
根中次之（1.28 倍），叶中表达量最低。
3 讨论
PK 通过糖酵解途径调控植物糖代谢、能量代
谢以及生长发育等多种生命活动过程。现已有油
菜 [2,13-14]、烟草[3]、马铃薯[4]、拟南芥[6]和水稻[7-8]
等经济或模式植物 PK 基因的相关报道，药用植物
中仅有琵琶 Eriobotrya japonica Lindl. PK 基因克隆
及表达谱分析的研究[15]。植物的 PK 为多基因家族，
如拟南芥、烟草、番茄和水稻等植物中现已报道分


图 2 DoPK 与植物 PK 蛋白的多序列比对
Fig. 2 Multiple sequence alignment of DoPK and PK proteins from other plants
L1-AAF44707
Rc-XP_002513157
S1-XP_004236881
Vv-XP_002270400
Do-KC178572

L1-AAF44707
Rc-XP_002513157
S1-XP_004236881
Vv-XP_002270400
Do-KC178572

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Vv-XP_002270400
Do-KC178572

L1-AAF44707
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Vv-XP_002270400
Do-KC178572

L1-AAF44707
Rc-XP_002513157
S1-XP_004236881
Vv-XP_002270400
Do-KC178572
L1-AAF44707
Rc-XP_002513157
S1-XP_004236881
Vv-XP_002270400
Do-KC178572
85
85
85
85
85

170
170
170
170
170

255
253
255
255
255

340
338
340
340
340

425
423
425
425
425

510
508
510
510
510
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图 3 DoPK 与不同物种来源 PK 基因的进化树分析
Fig. 3 Phylogenetic tree of DoPK with PK genes from other species

图 4 qPCR 分析 DoPK 在不同器官中的表达
Fig. 4 qPCR Analysis expression of DoPK in different organs
别含有 14、9、6、9 个成员[4]。本研究以前期构建
的 cDNA 文库中的一条 EST 为基础[16]，利用 RACE
技术首次从珍稀濒危药用铁皮石斛克隆获得一个
PK 编码基因。DoPK 与多种植物的 PK 基因高度同
源，编码蛋白具有典型的丙酮酸激酶结构域和活性
位点，和已报道的 PK 蛋白一致[2]。进化树构建分
析表明 DoPK 基因所在分支隶属于胞质型
CYTOSOLIC-1 亚类（图 4）。这些结果说明 DoPK
是编码铁皮石斛丙酮酸激酶的新成员。随着现代高
通量测序技术和生物信息学分析在铁皮石斛功能基
因组学研究中应用[17]，将有更多的 PK 编码基因被
鉴定，有利于从整体上解析 PK 的分子作用。
目前，利用蛋白免疫组化分析、RNAi 或者过量
表达等技术，已经初步明确了烟草[3]、马铃薯[4]、拟
南芥[6]和水稻[7-8]等植物 PK 的生物学功能。对琵琶
EjPK 的基因表达分析发现，在果实成熟第一阶段转
向第二阶段（授粉后 135 d）时，该基因瞬时高强度
诱导表达，与 TA 酸消耗和蔗糖累积有一定相关性；
同时，EjPK 基因表达丰度在高糖品种中远高于低糖
品种，表明其在果实成熟过程的重要作用[15]。本研
究 qPCR 分析表明，DoPK 为组成型表达，在 3
种器官中的表达量依次为茎＞根＞叶。铁皮石斛
的药用部位茎富含生物碱和多糖等多种有效成
份。DoPK 在石斛茎中的高丰度表达特征，似乎
和茎中多糖的量高正相关，暗示该基因很可能在
石斛茎中执行重要的糖代谢调节功能。本研究的
后续工作将包括 DoPK 的转基因功能分析以及铁
皮石斛 PK 基因家族其他成员的分子鉴定，进一
步分析 DoPK 和其他成员之间是否存在相互作
用，以期为铁皮石斛糖代谢和生长发育的分子调
控研究提供物质基础。
参考文献
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1.00
1.28
2.29
相
对
表
达
量

3
2
1
0
叶 根 茎
II
I
胞质型
质体型
CYTOSOLIC-2
PLASTIDIAL-alp
PLASTIDIAL-beta
CYTOSOLIC-2
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