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鸡蛋果叶片细胞质丙酮酸激酶的部分纯化及其调节性质



全 文 :植物生理学报 。 A`· r`: Pl,冬甲o 户 ,, y 、 `o ro叼i `、 , s 诬,: 成`、 , 199 3 , 19 ( 2 ) 门 05一 110 】0 5
鸡蛋果叶片细胞质丙酮酸激酶的部分纯化及其调节性质
享`振 一吃 李明启
(华南农业大学光合作用研究室 . 广州 51 06 刁2)
提要 鸡蛋果叶 片细 胞质 丙酮酸激晦 ( PK r )
纯 化 92 . 6 倍 , 其最 适 p H 为 7 . 2 . 对 热较 稳
定 。 P E P 的 ,-t 。 为 0 . 0 3 7 m m o一/ L , ^ D P 的 K ,
为 0. 0 5 m m o l / L 。 A印 、 A 、 n 、 c y s 、 r卜酮戊二酸 和
苹果酸均衬 P K 。 有轻徽的激 活作用 . 但草酸 、
A T P

aC CI
:
lM县强烈的抑制作用 。
关钮词 : 鸡蛋果 . 叶 片 . 细胞质丙酮酸激畴 ,
代谢物 . 草酸
丙酮酸激酶 ( P K ) 是糖酵解的一 个调
节酶 。 过去对植物 P K 的研究较少 ,且 多以
种子 为材 料 ( D u g g le b y 和 eD n n is I9 7 3a . b ,
l r e 一a n d 等 一9 8 0 . N a k a y a m a 等 一9 7 6 . T om -
1i n s o n 和 T u r n e r 19 7 3 ) 。 N a k a y a m a 等
( ! 9 7 8) 发现萌发蓖麻种子胚乳 P K 8 5%的
活性存在于细胞质 . 其余活性 存在 于前质
体 。 o e L u e a 和 oe n n is ( 19 7 8 )首次将发育的
蓖麻 胚乳细 胞质 P K ( P K 。 ) 与前质体 P K
( P K
p
) 分开 。 对植物叶片 P K 的研究尚不 多
见 (氏 s f o r d 和 M a w 19 7 5 , l r e la n d 等 19 7 9 .
R u y t
e r s 和 M i y a e h i 19 8 3 , 助 y s d o r f e r 和
B a s s h a nt 一9 8 4 ) ,而且一些文献关于植物 p K
调节特性 的结果很不一致 . 需要进一步研
究 。 我们将鸡蛋果叶片 P K 。 作部分纯 化 . 以
探讨其调节特性 。
9 0 0 0 r / m i
n 离心 2 0 m i n , 取上清液于水浴中加温
到 5 0 ( ’ , 10 m i n 后迅速冷却至 4 ( 、 , 9 0 0 0 r / m i n 离
心 2 0 m in 。 取 上清液 , 加入硫酸镶至 30 %饱和度 .
如前法离心 , 上清液加入硫酸钱至 50 %饱和度 ,
同前法再离心 , 沉淀悬浮于 oI ml 缓冲液 B( 含咪
哩 10 m m o l / L . p H 6 . 5 , 琉基 乙醇 5 m m o l / L . M g劝 l
1 0 m m o l / L
.
2 0 % 乙二醇 ) 。 过 eS ph ad e x 。 2 5 柱脱
盐后 . 上 o E A E一s e ph a r , ( f a s t f l o w ) 柱 ( 1 . 5 火 4 5
e m )
· 以 刁0 0 m l 含 0一 0 . 5 m o一 / L的 K e l缓冲液 B
梯度洗脱 (流速 3 7 m一/ h .每 6 m i n 收集 一管 ) 。 收集
酶活性峰部分 , 加入硫酸钱至 53 % 饱和度 , 10 0 0
x , 离心 30 m in , 沉淀悬浮 于 」 mI 缓冲液 B , 上
eS p ha d
e x C

2 0 0 柱 ( 3 . 5 X 2 8 e m ) , 以缓冲液 B 洗
脱 , 收集酶活性部分 , 为测定酶液 。
P K
C 测定 酶反应液含咪哇 ( p H 7 . 2 ) 5 0 m m ol L/ .
P EP 1
.
5 m m o l / L
.
M幼0 1 1 0 m m o l / L , K C I 5 0
m m ol / .L N A D H .O ! 2 m m ol / L
.
5 单位乳酸脱氢酶
和 A O P ! . 5 m m ol / L . 以不加 A D P 为对照 . 加入 5 0
川酶液启动反应 , 总体积为 ! ml 。酶比活性以 25 ( ’
时每分钟每 m g 蛋白催化形成丙酮酸的量 ( 。om l)
表示 。
蛋白质含 t 测定 按照 Br ad of dr 〔 19 76) 考马斯亮
蓝法 。
试剂来源 P E P 为中国科学院生物物理研究所产
品 ; 代I A 、 F一 6一 P 、 -F I , 6 一 P , 、 A T P 、 A M P 、 为 S ig m a 产
品 ; A D p 为 F lu ca 产 品 ; N A D H 为 翻 e h r i n ser
M
a n n h e im 产品 ;橄 ph. d . x 0 25 、枷 p h a d以 0 一 2 0 和
O E A -E eS hP ar * (俪 t 孔ow )为 P h a r m ac 认 产品 。
材 料 与 方 法 结 果
PK
. 提取及部分纯化 取成长的鸡蛋果 (乃州汀枷魂
~
)叶片 , 用蒸馏水洗净 , 吸干 ·加人 3 倍体积卯
缓冲液 ^ (含咪哇 1 0 m m o 一/ L . p H 6 . 5 . 蔗糖 3 5 0
P凡 部分纯化
P凡经过热处理 、 硫酸按沉淀 、离子交
m m ol L/
, 琉基 / L . 艺O %乙 二醉 . 1%
p v p )
, 用捣碎机 次 5 、 , 2 层尼龙布过
滤 滤液于 3 0 心 3 m in , 上清液再于
乙醇色m m ol/
几捣碎资今每
, o “ r /呻n离 `亡
一g今 I一 0乐 o刁收到 , 19 -2 0 1一 2 7 修回 。
高等学校博士学科点专项科研墓金资助课题 。
10 6 殖 物 生 理 学 报 19 卷
表 l 鸡蛋果叶片P K 的纯化
T abl e1Pr ui fi eatio no fP K fo r m l b、 确翻 耐产老 Z矛人 l : Iv e e、
Fr a etio n
To t aP lo r t ei n To t al c ati vi ty SP eci i fc a eti vi ty
(卜lmo lr ni n l) () lr no l】 1 l lnm g一 ’Pro t)
Ro e evr ey
P ur i fi a etio n fo l d
( %)
0 31
0 4 2
} 0 0
8 3
.
3
O乃只
:
门八J q5伟月Cr L一 d e ex tr a et
H eat tr a etm n et
(H N
.)2 50
.
30 %一0 5 % s at·
E D AE

S eP hr ao s e
S eP h adx eG

20 0
(m g)
1 71 1 艺
10 6 14
2 36
.
; 二2 .碑0 . 1 3 7
0
.
310
2 8 70
0 6
.
24
.
4
34
.
6
2 魂 . 5
10
9 2
.
6
八 b,é
:
只gd.1n亡n
:
门刀抢 悦n
换层析和凝胶层析等步骤 ,纯 化了 92 . 6 倍
(表 1 ) 。
P K
。 的性质
最适 p H 在 p H 6 . 2一 9 . 0之间 , P K 。 保持最
大 活性 的 相 写以 上 , 最适 p H 为 7 . 2 ( 图
l )

于 A D P
2
.
0
óbùU,通,二
卜\t
0
.
5
1 0 0 一 2 0 一 1 0 0 1 0 2 O 3 0 4 0
l / ( P E P m m of / L )
/
/
八UdCU0`1二
夕、1
(次à势ō>ù州。.ǐ 1璐一妙国
一 2 0 一 1 0 0
PH
1 / (人 D P
10 2 0 3 0 4 0
m 幻。 Q l / L )
图 1 p H 对 PK 。 活性影响
iF g
. 少 Ef fe e t o f P H o n t h e a e t i v i t y o f P K
图 2 p K。 对 p E p ( A )和 A D p 浓度 ( B ) 的双倒数图
iF g
.
2 oD
u bl e r e e i P r oc a l P l o t o f P K
。 a g a i n s t P E P ( A )
a n d ( B )
e o n e e n t r a t i o n s
S t a n d a r d a姗 y e o n d i t io n s w e r e u s e d e x e e Pt f o r v a r y in g
P E P 以 A D P c o ll e e n tr a t i o n .
热稳定性 将酶液 在不同温 度下保温 5
m in 后 , 于 25 C 测定其活性 。 P K 。 在 5 0 C 以
下不仅不失活 , 反而有轻微激活作用 ; 当超
过 S O C后 , 则随温度的提 高 , 活性急剧 下
降 . 至 6 5 C时完全失活 。
底物 K 。 值 用双 倒 数 作 图法 测 得 K 。
( p E p ) 为 0 . 0 3 7 m m o l / L , K , ( A D p )为 0 . 0 5
m m o l / L (图 2 ) , 说明 P K 。 对 p E P 亲和力大
代谢物对 P K 。 的调节
经试验 的 23 种 化合物 中 , s m m ol / L
的 A s p 、 A sn 、 c ys 、 a 一酮 戊二酸 和苹 果 酸对
P K
。 有轻微激活作用 ; 草酸 、 A T P 和 C a 1C 2
能强烈抑制 p K c (表 2 ) 。 5 m m o l / L 的 G l u 、
c xn

A 一a 、 s e : 、 。 一y 、 T h r 、 延 胡索 酸 、 异 柠檬
酸 、 柠檬酸 、 珑泊酸 、 乙醇酸 、 F 一 6一 P 、 F 一 } , 6 -
2期 鸡蛋果 叶片细饱质丙酮酸激酶的部分纯化及其调节性质 1 0 7
一 P :、 P G A和 AMP对 PK活性均无影响 。 V:声 m ol砂 rl通 va了 e mg一 1 JIì J|. l广 |1表 2代谢物对 PK.活性影响 Ta bl e f f 2 Fe e t ofme ra b ol, r e 、 o n t h e a c z i v i r y o f P K P r o t e一n m 哥n 一 4 . 0R e l a t i v e a c t l v l t v( / ) 0 C O ll t r o lM e t a b o l i t e s 3 0一 A T P ( m m o l / L )

( b n t r o l
A s p
八 卜 n
(
、 、 S
厂沈一
K c r o g l l j t之J r之J r e
M 是Ll是戈 t e
( ) x 是匀l d t e
A T P
〔 、故〔 ’ l
1 0 0
」2艺
1 1 2
} } 7
1 1 】
! 1 ( J
18
3 5
2 9
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0
{一 。一 2 0 一 1 5 一 1 0 0
1 / ( A T P
_
, :
J
5 1 0 1 5 2 0
m m o l / L )
T h e C o n c e n t r 是, t z ( J n 、 a r e 5 lp r刊 0 1 / L .
草酸 是 P K t 对 P E P 的竟 争性 抑制剂
(图 3 ) . 不 同浓度 的 A D P 不 影响 草酸对
P K
. 的抑制 。 用 iD x on 作图法测得草酸的抑
制常数 斤 , 为 0 . 洲 m m ol / L , 在饱和 P E P 浓
度 (l . s m m o l / )L 下 . 草酸对 P K ` {又有轻微
的抑制作用 , I n l n o o l / L 的草酸抑制 2 0厂 ;
但在 P E P 浓 度 为 0 . 0 3 7 m m o 一 [ }了寸. 0 . 8
m m ol / L 草酸即完全抑制 P K 活性 。
图 4 改变 A D P 浓度时 A T P 对 P K 抑制作用的双
倒数图
F豆9 . 4 D o 日b l e r e e 一Pr o c a l Pl o t 、 o f t h e i n h生b i r i o n o f P K
b少, A T P a r v o r 少, i n g A D P c o n 〔竺e n t r a r i o n
S t a n d a r d a 卜s a y c o n d i t i o n s w e r e u 、 e d e x e e P t lb r v a r y i n g
A D P c o n c e n t r a t l o n
.
A T P 为 P K 对 A D P 的竟争性抑 制剂
( 图 4 ) , 用 Dj x on 作图法测得抑制常数 人 l
为 0 . 3 3 m m o l / L 。 当改变 P E p 浓度时 , A T P
对 P K 表现为竟争性和非竟争性的混合性
抑制剂 (图 5 ) 。 在饱和 P E P 和 八 D P 浓度
F
,
0
.
2 m m o l / L A T p 抑 制 p K 。 10环 , l
m m o 一/ L A T P 抑制 3 0% 。
,户lJ v : 本`m o哥砂 r u v a te m g一 1{{ p r ot e i n m in 一 」 2 . 01 . 5 000 C on t r d. 、 T P 、 m m o` / L , 冬1 . 。
2
.
0
0
.
5
0
10不
业弓 艺0 J O 一 5 0 5 10 1 5 一 2 5 一 2 0 一 15 一 1 0 一 5 0
1尸 ( P E P m m o l / L ) 1 /` P E P m m d
5 1 0 1 5
/ L )
图 3 草酸对 P K 抑制作川的双倒数图
F i g
.
3 D o t一b l e r e c 1P r o仁 a { p i o t、 o f rh e 一n h i b i t侄o n o f P K

b、 , o X a l之至t e
S t乏士n ` i之l r d 之一从、 之t y e o n d l t一o n s 认℃ r e 一l s c d e x ( ℃ P t f o r y 之l r冬飞门 g
P E P (勺 n ( ℃ n t r a 七i o n .
图 5 改变 P E P 浓度时 A 下 P 对 P K 。 抑制作用的双
倒数图
F i g
.
5 D o t一b l e r e e i Pr o e a l Pl o t s o f t h e i n h ib i t i o n o f P K
b y A T P a t v a r y i n g P E P e o n e e n t r a t i o 门
S t a n d a r d a浦 y e o n d i t j o n s w e r e u s e d e x e e P t f o r v a r y i n g
P E P e o n e e n t r a t i o n
.
随 物 生 理 学 报 } 9卷
讨 论
有 关植物 K P的研究较少 , 对 n }片 P K
研究也只有对番茄 ( B e 、 f o r d 和 M o w } 9 75 ) 、
蓖麻 ( l , e la n d 等 } 9 7 9 ) 、 l咙 豆 ( R u y t e r 、 和
M j y a e h i 19 8 3 ) 和 菠 菜 ( B a y侧 o r f e r 和
I; : 1、 、 h : , m 19 8 」)有过报道 。 从这些植物的 口{
片中观察到有存在 厂叶绿体的 P K 。 和存在
J
几细胞质的 P K . 两 者的特性有较大差 异 。
P K
, 丈、 t热 敏 感而 P K 较 隐定 ( D e L u e : , 和
o 。 n n s、 一9 7 8 ) 。蓖麻叶 片 p K 最适 p H 比 p K 。
低 . P K 。 为 8 . 0 , P K . 在较宽 p H 范围 ( 6一 9 )
均 有较高了舌尸七( ] r e la n d 等 一9 7 9 ) 。 于绝们从鸡
蛋果叶片中部分纯 化 了 P K 。 其热稳 定性
于}l }乍!11 p H (图 l ) ’ ;J’ 蓖 !袜! 1卜} { P K 的丰}1近 。
据 文献报告 , 棉花种 护 P K 受 八 M P 激
i舌( o L Jg g l e 匕y 和 D e n n i、 一9 7 3 h ) , 但豌 夏和胡
萝 卜种 广 P K ( T o m一n s o n 于{1 T u r n e r 19 7 3 ) 及
鸡蛋果叶片 p K ` 不受 A M P 影响 。 F一 6一 P 和
F

}
,
6

P ( s m m o 一/ L ) 可抑 带`1蓖 麻胚乳 p K 。
活性达 10 万 ( l r e l a n d 等 19 8 0 ) , 但 又寸其它植
物 P K ( 包括鸡蛋果 P K力则无影响 。 柠檬酸
抑制 多数 杭物 的 p K ( D u g g le b y 和 D e n n js
19 7 3 a
,
b
.
B : 、 y 、 d o r r e r 于[J B : ,、 s h : , m 19 8 4一 r c -
一a n d 等 一9 8 0 . L i n 等 19 8 9 , T o m l in 、 o n 手}1
下 。 r n e : } 9 7 3 ) ,但 不影 {,向鸡蛋 果 “ !一片 p K 。 和
萌 发 蓖 麻 胚 乳 P K i舌附三 ( N a k a y a m a 等
1 9 7 6 )
。 `之一酮戊三二酸 沁寸棉花种 J气 p K ( D u g g一e -
b y 卞{1 0 e n n i、 19 7 3 a ) 和 发 育的 蓖 麻 胚乳
p K

p K
飞 少二J龙作用 ( z r e l: , n d 等 19 8 0 ) , 但能
抑 制菠 菜 。 } 片 P K , 和 p K , ( B a y % d o r f e r 和
B :主、 、 h : , m l 9 8 4 ) , I币萌 发 的 蓖 麻 胚 乳 p K
( N a 、 a y : 、 m a 等 一9 7 6 )和鸡蛋果 P K (表 2 ) 则
受其激活 下同 来源的 P K 效 )、几之物有如此大
的旅异的原 t1I , 日前尚不清楚 。
草酸是鸡蛋果 口十片 P K 对 P E P 的 竟争
性抑 制斧,1 ( }乍1 3 ) , 草 }(交对菠 菜叶片 P K , 平IJ
p K : 亦 有抑制 作用 ( B : , y、 d o r f e : 和 Ba 、 、 h a m
}9 8 4 )
。 草酸的抑制作用是 否具有生理 意
义 ,有待 j些 一 步阐明 。
许 多 植 物 来源 的 P K 受 八T P 抑 制
( D u g g le b y 于11 D e n n j、 19 7 3 , Ir e la n d 等 t 9 8 0 、
N a k a y a m a 等 } 9了6 , T o m 一j n 、 o n 于{1 T u r n e r
} 9 7 3
`
B a y 、 d o r r e r 和 B a 、 、 h a m 1 9 8 」) 。 A T p 对
发育的蓖麻肛乳 P K ` 是 八 D P 白勺非竟争性
抑 制剂 , 为 P E P 的 竞争性 抑制剂 , 但 对 J几
p K
。 . 去{J是 p E p 于[} A o P 白勺非竞争性 抑湘1齐!1
( l r e la n d 等 , 9 8 0 ) 。 A T p 又寸菠 菜 P K 亦 是
p E p 的 竞 争 书1任寸印 制 齐,} ` B a y 、 d o r f e r 和
B a s s h a m { 9 8
,
1 )
。 犬、全1二鸡蛋果 p K , 八 T P 贝}J是
A D P 的竞争性抑击,!齐.1 (图 4 ) .是 p E p 的竞
争性 和 1卜竟价性 的混 合性 抑制 刹 ` YI S ) 。
据报道 , 菠菜叶片原生质体细胞质 八 T P 产仁
理浓度 为 0 . 3 m m o } / L ( W s r t 7 等 一9 8 0 ) , 在
饱和 J氏物浓度 卜, 0 . 2 m m o l / L 的 A T p 已 可
抑制鸡蛋果 P K 10 % , 这表明 入 T P 对 P K
的 抑 制作 用 叮能 具 有 定 的生理 意 义 。
H a m p。 等 ( ! 9 8 2 )认 为 , 小麦原生质体细胞
质 A D p 浓度 为 0 . 0 6 m m o l / L , 鸡蛋 果叶片
A

1
( A D p ) 为 0 . 0 5 m m o } / L ( t月 2 ) 。 卜葫此 ,叶
片细胞质 入 D P 浓度变化及 A T P / 八 D P 比 ,
也可能是 P K I舌性的调节因子 。
参 考 文 献
B a 乡从 10 r f e r ( ’ . R之生、 、 h乏I n 、 , ,入 . S p l n 之I c h P冬, r 一I v 之正飞e k 一
n £卜 c is o f o r m s . P £亩r t 一之里I P一 r i f i( 花* r一o n 之圭n d r e g LJ IJ t o r ) ,
p r o p e r t一e 凡
.
1 ,l 了2, , I伪护、介矿 I , 8 4 、 7 4 : 3 7礴
浅 s f o r t { R T , M 是l w ( 奋八 . S o m c P r ( ,阵 , r t一c 、 o f Py r 一 v a t e
k一n 之通、 c c x r r 之讹`

t e t { f r (〕 m 乙!(/ , ,7月军人厅 , ,。 `】习 , ,z I/, n , z产, , .
l,I/
,l 浑介 ,产了矛2以 r !l 19 7 5 , 1 4 ; 6了7
B了u d f o r 〔 1 M M
.
\/ r 之t P 一` ! J n d 、 c n 、 i r一v ( , rn e rh浏 lb r t h e
叼一之t n r i t之直t io n o f m 一` · r o g r之泣m q 一之更n t r r i e s o f P r o t e i n
t奋t i l i z i n g t h e p r i n c ip l c o f P r o t e l n

d )℃ b i n d i n g .
月 l/ j加 汀去尸斤, } 9 7 6 , 7 2 : 2 4 8
D `兰 I 一J` 之一 V , n e n n 一、 D T
.
1
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l ,、 p r o p l之ts t l d 、 l

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.
I ,l/ 12子1 1 ,l/护、 /, 了 } 9 7名 . 6 1 : T0 3 7
D一 g g j e b ) R ( ;
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c n n t、 日丁 . ’ r t 、e 仁 h 是、 r d 仁咬c r i z a t i o n a n d
2 期 鸡蛋果叶 片细 胞质丙酮酸激酶的部分纯化及其调节性质 】0 9
r e g u l a t o r y P r o pe r t i“ o f P y r u v a r e k j n a s e f r o m e o t -
r o n 、 e e d、 月。 去 刀i从 、从叨 刀初分恻 1 9 7 3a , 1 5 5 :
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D u g g le b y R 6
,
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P y r u v a t e k j n a 凡 e
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a 落洲” -
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. 了刀d n 产
I,lI 夕、 钾了 1 9 7 3 b , 5 2 : 3 12
H a m P P R
,
G o l l e r M
,
Z 孟e g l e r H . A d e n y l a t e l e v e l s ,
e n e r g y e h a r g e
,
a n d P h o s Ph o r y l a t i o n Po t e n t i a l d u r
-
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P l a s t s
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p r o t o P l a s t s f r o m 月尹、户)产a 喇 子7孔 L . lP `z ,t l伪少刃 l
19 8 2
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Ir e l a n d R
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D e L u ca V
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D e n n i s D T
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Is oe n z y m e s o f
P y r一 v a t e k i n a s e i n e t i o P l a s t s a n d e h l o r o p l a s t s
.
了叭王了“ IP !l’ 耐 19 7 8 , 6 3 : 9 0 3
Ir e l a n d R J
.
D e L 、一e a V , D e n n i s D T . C h a r a e t e r i z a -
t i o n a n d ki n e t i e s o f 15叱n z y m e s o f P y r t一v a t e k i n a s e
f r o n l d e v e l o Pi n g ca s t o r 加 a n e n d仍 eP r m . 产刃动 It
了伪夕人人扩 1 9 8 0 , 6 5 : 1 18 8
L i n M
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T t一r Pi n D H
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P l a x t o n W C
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P y r t l v a t e k i n a s e
i s o z y m e s f r o m t h e g r e e n a lga
. 人回四才耐 r刀 z厅 洲刀 I廿产I子材
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.
K i n e t i e a n d r e g u l a t o r y P r o pe r t ies
. 方` ,儿
刀灰汉 ,` , 月 而砂笋 1 9 8 9 , 2 6 9 : 2 2 8
N a k a y a m a H
,
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,
M ju r a K
.
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