全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 15 期 2016 年 8 月

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知母的 HPLC-ELSD 指纹图谱研究
钟 可 1，王文全 2*，靳凤云 1，姚 鹏 1，杨芳芳 1
1. 贵阳中医学院，贵州 贵阳 550025
2. 中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193
摘 要：目的 采用 HPLC-ELSD 法建立知母的指纹图谱，全面综合反映和控制知母整体质量。方法 Thermo 色谱柱 C8（250
mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.2%冰醋酸水溶液（B）梯度洗脱：0～5 min，5%～7% A；5～15 min，7%～15%
A；15～36 min，15%～22% A；36～43 min，22%～35% A；43～51 min，35%～50% A；51～60 min，100% A；柱温 25 ℃，
体积流量 1 mL/min，ELSD 检测器雾化器（空气）体积流量 2.6 L/min，漂移管温度 100 ℃，进样量 20 μL。结果 在 60 min
内获得了较好分离效果的特征图谱，确定 12 个主要特征峰作为共有峰，建立了能够使多数化学成分色谱分离的知母药材
HPLC-ELSD 指纹图谱。结论 该方法简便、可靠，并且同时指认了知母中皂苷类和双苯吡酮类成分，能较全面地反映知母
整体性的化学成分特征，可用于全面有效地控制知母的质量。
关键词：HPLC-ELSD；指纹图谱；知母；知母皂苷 BII；知母皂苷 AIII；芒果苷；新芒果苷；知母皂苷 C
中图分类号：R286.6 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)15 - 2747 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.15.025
Research on HPLC-ELSD fingerprint of Anemarrhenae Rhizoma
ZHONG Ke1, WANG Wen-quan2, JIN Feng-yun1, YAO Peng1, YANG Fang-fang1
1. Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China
2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing
100193, China
Abstract: Objective To provide the HPLC-ELSD fingerprint analysis method of Anemarrhenae Rhizoma, and to reflect and
comprehensively control the quality of Anemarrhenae Rhizoma. Methods The HPLC-ELSD separation was performed on a C8 analytical
column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) gradient eluted with a mixture consisting of acetonitrile (A) and 0.2% acetic acid-water (B) at a flow rate of
1 mL/min with ELSD detector. Using a linear gradient of 0 min, 5% A; 5 min, 7% A; 5—15 min, 15% A; 15—36 min, 22% A; 36—43 min,
35% A; 43 min, 40% A; 51 min, 50% A; 51—60 min, 100% A. The temperature of column was 25 .℃ The flow rate of ELSD detector
atomizer (air) was 2.6 mL/min. The temperature of the drift tube was 100 ℃ and the injection volume was 20 μL. Results The fingerprint
with better separation effect by using gradient elution method within 60 min was established, and also the 12 peak which are common peak
were determined. The most of chemical components of Anemarrhenae Rhizoma were chromatographic separated in this HPLC-ELSD
fingerprint. Conclusion The method is simple and reliable, and in this way for the steroidal saponins and flavonoids of Anemarrhenae
Rhizoma can be identified at the same time. Moreover, it can fully reflect the characteristics of the chemical composition of Anemarrhenae
Rhizoma, therefore it can be used as an effective quality control method for Anemarrhenae Rhizoma.
Key words: HPLC-ELSD; fingerprint; Anemarrhenae Rhizoma; timosaponin BII; imosaponin AIII; mangiferin; neomangiferin; timosaponin C

知母 Anemarrhenae Rhizoma 为常用中药，来源
于百合科植物知母 Anemarrhena asphodeloide
Bunge. 的干燥根茎。其药用历史悠久，始载于《神
农本草经》，列为中品，具有清热泻火、润肠滑燥、
止渴除烦等功效[1]。在我国主要分布于河北、山西、
内蒙古、辽宁、黑龙江、吉林等省区。数 10 年来，
国内外学者对知母的化学成分进行了广泛深入的研
究，发现知母中含有甾体皂苷、双苯吡酮类、木脂
素类、多糖类、有机酸类及微量元素类成分，其主
要成分为甾体皂苷类和双苯吡酮类成分。其中双苯

收稿日期：2016-03-16
基金项目：贵州省科技厅联合基金资助（黔科合中药字[2010]LKZ7031）
作者简介：钟 可（1980—），女，副教授。E-mail: lionzhongke@163.com
*通信作者 王文全 E-mail: wwq57@126.com
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吡酮类中的化学成分芒果苷（mangiferin）和新
芒果苷（neomangiferin）是知母中主要的抗炎、
抗病毒和抗氧化成分。芒果苷和新芒果苷还有降
血糖和改善 2 型糖尿病症状的作用[2]。现代药理
研究发现知母中的甾体皂苷有着重要的药用价
值，其中知母皂苷 BII（timosaponin BII）和知母
皂苷 AIII（timosaponin AIII）具有抗血栓、抗动
脉粥样硬化、改善记忆功能障碍和治疗老年性痴
呆等作用，在抗癌方面也表现出显著的活性。知
母皂苷 C（timosaponin C）是知母中量较高的呋
甾皂苷之一，其水解脱糖后可转化生成菝葜皂苷
元，具有改善老年痴呆症状和抗氧化、抗辐射的
作用 [3-4]。利用色谱指纹图谱获取全面的中药化
学成分特征信息已广泛地应用于中药的质量控
制，中药色谱指纹图谱是对中药整体性化学特征
的表达和反映。目前，美国食品药品监督管理局
（FDA）、英国草药典、德国药用植物学会、印度
草药典、加拿大药用植物学会均接受和收载指纹
图谱的质量控制方法，指纹图谱已成为国际公认
的控制中成药、天然药物质量的最有效方法。《中
国药典》2015 年版以知母中芒果苷和知母皂苷
BII 的量测定来控制药材质量，且分别采用 2 种
不同的检测器来测定这 2 种化学成分的量，测定
方法较繁琐。因此，建立能反映甾体皂苷类和双
苯吡酮类这 2 类成分的知母指纹图谱方法具有重
要的意义。
1 仪器、试药与材料
安捷伦 1100 液相色谱仪，配有二元高压溶剂
系统、自动进样恒温箱样品管理器、柱温箱、
ALLTECH 2000ES 蒸发光散射检测器；台式系列
数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
十万分之一电子分析天平（德国 Sartorius）。对照
品知母皂苷 BII（批号 120926）、知母皂苷 AIII（批
号 121022）、芒果苷（批号 110910）、新芒果苷（批
号 110920）均由上海融禾生物科技公司提供，质
量分数均大于 98%；知母皂苷 C 为实验室自制（经
红外、质谱及核磁鉴定和纯度检查，质量分数＞
98%）。乙腈（色谱纯，美国 Fisher 公司），其他试
剂均为分析纯，娃哈哈纯净水。
知母样品经中国医学科学院王文全教授鉴
定为百合科植物知母 Anemarrhena asphodeloide
Bunge. 的根茎。干燥后，粉碎备用。样品来源
见表 1。
表 1 不同来源知母样品信息
Table 1 Sample information of Anemarrhenae Rhizoma
from different origins
样品 来源地 样品 来源地
1 河北易县西陵镇太平峪村 9 河北安国市伍仁桥镇伍仁村
2 河北易县西陵镇忠义村 10 河北安国市祁州药市街道中阳村
3 河北易县西陵镇华北村 11 河北安国市祁州药市街道北各堡村
4 河北易县坡仓乡宝石村 12 河北安国市祁州镇南七公村
5 河北易县西陵乡晓新村 13 河北安国市东河乡西固村
6 河北安国市石佛镇米庄村 14 河北安国市明官店乡辛庄村
7 河北安国市石佛镇南阳村 15 河北安国市西安国城乡北堡村
8 河北安国市石佛镇流各庄

2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液的制备 分别称取知母皂苷BII、
知母皂苷 AIII、芒果苷、新芒果苷、知母皂苷 C 对
照品适量，加 50%乙醇配制成知母皂苷 BII、知母
皂苷 AIII、芒果苷、新芒果苷、知母皂苷 C 质量浓
度分别为 2.0、1.6、3.9、1.3、6.3 mg/mL 的混合对
照品溶液，摇匀，备用。
2.1.2 供试品溶液的制备 取知母粉末（过 4 号筛）
约 1.0 g，精密称定。置具塞锥形瓶中，精密加入 50%
乙醇 25 mL，称定质量。超声 30 min（功率 400 W，
频率 40 kHz）。放冷，再称定质量，用 50%乙醇补
足减失的质量，摇匀。滤过，取续滤液，0.45 μm
针头微孔过滤器滤过，作为供试品溶液。
2.2 色谱条件
Thermo C8 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；
流动相乙腈（A）-0.2%醋酸水（B）溶液，梯度洗
脱：0～5 min，5%～7% A；5～15 min，7%～15% A；
15～36 min，15%～22% A；36～43 min，22%～35%
A；43～51 min，35%～50% A；51～60 min，100%
A；柱温 25 ℃；体积流量 1 mL/min；ELSD 检测器
雾化器（空气）体积流量 2.6 L/min，漂移管温度 100
℃；进样量 20 μL。
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度试验 取同一份供试品（1 号样品），
按照供试品的制备方法和色谱条件连续进样 6 次，
按照“2.1.2”项下方法和“2.2”项下色谱条件进行
检测，以知母皂苷 BII 峰为内参比峰，计算占总峰
面积 5%以上峰的相对保留时间和峰面积，结果显
示 5%以上峰相对保留时间的 RSD 为 0.01%～
0.24%，相对峰面积的 RSD 为 1.33%～2.55%，均小
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于 3%，符合指纹图谱技术要求。
2.3.2 稳定性试验 取同一份供试品（1 号样品）
溶液，分别在 0、2、4、8、12、24 h 按照“2.1.2”
项方法和“2.2”项下色谱条件进行检测，以知母皂
苷 BⅡ峰为内参比峰，计算占总峰面积 5%以上峰的
相对保留时间和峰面积，结果表明，占总峰面积 5%
以上峰的相对峰面积的 RSD 为 1.28%～1.81%，相
对保留时间的RSD值为0.01%～0.23%，均小于3%，
符合指纹图谱技术要求。
2.3.3 重复性试验 取同一供试品（1 号样品）6 份，
按照“2.1.2”项方法和“2.2”项下色谱条件进行检测，
以知母皂苷 BII 峰为内参比峰，计算占总峰面积 5%
以上峰的相对保留时间和峰面积，结果表明，占总峰
面积 5%以上峰的相对峰面积的 RSD 为 1.77%～
2.82%，相对保留时间的 RSD 为 0.01%～0.57%，均
小于 3%，符合指纹图谱技术要求。
2.4 知母指纹图谱的建立
根据上述液相色谱条件，分别精密吸取对照品
溶液及供试品溶液（1 号样品）各 20 μL，注入液相
色谱仪，记录 60 min 内的色谱峰，色谱图见图 1，
同时以对照品的图谱进行比对，确认了 2 号峰为新
芒果苷，3 号峰为芒果苷，7 号峰为知母皂苷 BII，
9 号峰为知母皂苷 C，12 号峰为知母皂苷 AIII。按
上述确定的供试品溶液制备方法进行样品分析，将
15 个不同批次的知母供试品的 HPLC-ELSD 色谱图
（图 2）通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”
2010 版软件，将峰面积较大、分离度较好的色谱峰
进行标定，确定 12 个主要特征峰作为共有峰。


2-新芒果苷 3-芒果苷 7-知母皂苷 BII 9-知母皂苷 C
12-知母皂苷 AIII
2-neomangiferin 3-mangiferin 7-timosaponin BII 9-timosaponin C
12-timosaponin AIII
图 1 知母 HPLC-ELSD 对照图谱
Fig. 1 HPLC-ELSD Chromatograph of Anemarrhenae
Rhizoma sample


图 2 15 批知母样品 HPLC-ELSD 图谱
Fig. 2 HPLC-ELSD Chromatograph of 15 batches of
Anemarrhenae Rhizoma
根据 15 个不同批次的知母供试品溶液的
HPLC-ELSD 色谱图，对照指纹图谱生成法，通过
“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2010 版软件，
计算各药材样品的 HPLC-ELSD 图谱与生成对照指
纹图谱之间的相似度，结果见表 2。
由表 2知母HPLC-ELSD指纹图谱相似度可知，
15 个不同批次的知母 HPLC-ELSD 指纹图谱的相似
度＞0.97 以上。实验结果表明所收集的知母样品整
体性的化学成分特征相似。
3 讨论
知母中所含的皂苷类成分为甾体皂苷，没有紫
外吸收，用传统的紫外检测器对其进行定性定量分
析不适用，而 ELSD 可以弥补这方面的不足。本实
验筛选出合适的知母化学成分提取方法和对 ELSD
检测器的各项参数进行了选择，确定了最优的
HPLC-ELSD 指纹图谱色谱条件，采用梯度洗脱方
法在 60 min 内获得了较好分离效果的特征图谱，确
定 12 个主要特征峰作为共有峰，建立了能够使多数
化学成分色谱分离的知母道地药材 HPLC-ELSD 指
纹图谱。该图谱特征性较强，主要共有峰达到了基
线分离。在分析过程中，对芒果苷、新芒果苷、知
母皂苷 BII、知母皂苷 AIII、知母皂苷 C 同时进行
了指认，克服了在以往的知母 HPLC 指纹图谱中无
7
3 12
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
t/min
1 2
4 9 5 10 6 8 11
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
t/min
S15







S1

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表 2 15 批知母 HPLC-ELSD 指纹图谱相似度
Table 2 Similarity of HPLC-ELSD fingerprint of 15 batches of Anemarrhenae Rhizoma
样品编号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 对照指纹图谱
S1 1.000 0.967 0.913 0.999 0.993 0.891 0.960 0.927 0.928 0.981 0.996 0.989 0.975 0.942 0.900 0.972
S2 0.967 1.000 0.979 0.975 0.984 0.972 0.999 0.980 0.987 0.990 0.985 0.991 0.995 0.995 0.975 0.998
S3 0.913 0.979 1.000 0.925 0.941 0.990 0.980 0.990 0.992 0.965 0.940 0.961 0.976 0.992 0.992 0.981
S4 0.999 0.975 0.925 1.000 0.997 0.908 0.970 0.937 0.942 0.986 0.998 0.993 0.981 0.954 0.914 0.980
S5 0.993 0.984 0.941 0.997 1.000 0.928 0.981 0.945 0.956 0.986 0.999 0.993 0.985 0.966 0.928 0.986
S6 0.891 0.972 0.990 0.908 0.928 1.000 0.976 0.978 0.995 0.952 0.926 0.944 0.964 0.990 0.987 0.971
S7 0.960 0.999 0.980 0.970 0.981 0.976 1.000 0.979 0.988 0.987 0.981 0.987 0.992 0.995 0.976 0.997
S8 0.927 0.980 0.990 0.937 0.945 0.978 0.979 1.000 0.986 0.975 0.948 0.970 0.982 0.989 0.994 0.984
S9 0.928 0.987 0.992 0.942 0.956 0.995 0.988 0.986 1.000 0.976 0.955 0.970 0.983 0.997 0.988 0.988
S10 0.981 0.99 0.965 0.986 0.986 0.952 0.987 0.975 0.976 1.000 0.990 0.997 0.995 0.983 0.959 0.995
S11 0.996 0.985 0.940 0.998 0.999 0.926 0.981 0.948 0.955 0.990 1.000 0.996 0.988 0.966 0.929 0.987
S12 0.989 0.991 0.961 0.993 0.993 0.944 0.987 0.970 0.970 0.997 0.996 1.000 0.996 0.979 0.953 0.995
S13 0.975 0.995 0.976 0.981 0.985 0.964 0.992 0.982 0.983 0.995 0.988 0.996 1.000 0.990 0.971 0.998
S14 0.942 0.995 0.992 0.954 0.966 0.990 0.995 0.989 0.997 0.983 0.966 0.979 0.990 1.000 0.989 0.994
S15 0.900 0.975 0.992 0.914 0.928 0.987 0.976 0.994 0.988 0.959 0.929 0.953 0.971 0.989 1.000 0.975
对照指纹图谱 0.972 0.998 0.981 0.98 0.986 0.971 0.997 0.984 0.988 0.995 0.987 0.995 0.998 0.994 0.975 1.000

法反映皂苷类成分信息的不足 [5-6] 以及知母
HPLC-ELSD 指纹图谱中双苯吡酮类成分没有分离
和鉴定的缺陷 [7-8]，经方法学考察，建立的知母
HPLC-ELSD 指纹图谱方法符合指纹图谱的要求。
该特征图谱能较全面地反映知母整体性的化学成分
特征。
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