全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 13 期 2014 年 7 月

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半夏凝集素基因的克隆、生物信息学分析及其蛋白的亚细胞定位
赵 欢 1, 2, 3，彭正松 2，雷 杨 3，周永红 1*
1. 四川农业大学小麦研究所，四川 成都 611130
2. 西华师范大学生命科学院，四川 南充 637002
3. 四川农业大学水稻研究所，四川 成都 611130
摘 要：目的 克隆半夏凝集素基因，并对其进行生物信息学分析和亚细胞定位。方法 以半夏 Pinellia ternata 新鲜
叶片的 DNA 为模板，根据 Genbank 上的半夏凝集素的基因序列（GU593718.1）设计引物，克隆了半夏凝集素（PTA）
基因，并构建植物表达载体 pI1300-CaMV35S-PTA-GFP，在农杆菌 GV3101 中进行表达且观察了其在烟草中瞬时表达。
结果 所克隆的 PTA 的开放阅读框为 810 bp，其编码 269 个氨基酸；具有 1 条信号肽、2 个 B-lectin 保守区域和 3 个
甘露糖结合基序；PTA 氨基酸序列与 NCBI 中所报道的半夏、掌叶半夏 P. pedatisecta、滴水珠 P. cordata 凝集素的氨基
酸序列的同源性分别达到 97%、85%和 83%；初步推测其定位于膜上，现已在 NCBI 中登记（登录号 KF154979）。
结论 本实验通过对半夏凝集素的生物信息学分析和亚细胞定位分析，为进一步研究半夏凝集素的抗病虫害机制奠定
了基础。
关键词：半夏；半夏凝集素；基因克隆；瞬时表达；亚细胞定位
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)13 - 1914 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.13.020
Genomic cloning, bioinformatics analysis, and subcellular localization of an
agglutinin gene from Pinellia ternata
ZHAO Huan1, 2, 3, PENG Zheng-song2, LEI Yang3, ZHOU Yong-hong1
1. Institute of Triticeae Research Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China
2. College of Life Science, China Western Normal University, Nanchong 637002, China
3. Rice Research Institute, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China
Abstract: Objective To clone an agglutinin gene from Pinellia ternata and to analyze its bioinformatics and subcellular location.
Methods Based on the published sequence GU593718.1 from Genbank, P. ternata agglutinin (PTA) was amplified and cloned from
genomic DNA of the fresh leaves of P. ternata. The cloned PTA gene was further fused to the plant expression vector
pI1300-CaMV35S-GFP to construct pI1300-CaMV35S-PTA-GFP, then transfered into cells of Agrobacterium tumefaciens GV3101. Its
transient expression was observed in Nicotiana tabacum. Results The full length of PTA contained 810 bp with the deduced 269 amino
acid residues; It contained one signal peptide, two conversation B-lectin domains and three mannose binding sites; PTA shared 97%, 85%,
and 83% identity with the amino acid sequence from PTA, and Pinellia pedatisecta agglutinin (PPA), Pinellia cordata agglutinin (PCA),
respectively; The PTA was localized to the plasma membrane; Its registration number is KF154979 in NCBI. Conclusion It would
provide a stable foundation for the study on its effect against fungi, insects, and bacterium.
Key words: Pinellia ternata (Thunb.) Breit.; Pinellia ternate agglutinin (PTA); gene cloning; transient expression; subcellular location

植物凝集素是一类具有高度特异性糖结合活性
的蛋白，含有一个或多个可与单糖或寡聚糖特异可
逆结合的非催化结构域[1]。van Damme 等[2]根据进化
和结构相关性，将其分成 7 个家族，分别为豆科凝

收稿日期：2014-02-25
基金项目：西南野生动植物资源保护省部共建教育部重点实验室开放基金项目（XNYB01-4）；西华师范大学校级科研启动金（08B021）
作者简介：赵 欢（1982—），女，博士在读，讲师，研究方向为药用植物资源评价与分析。
Tel/Fax: (028)86290947 E-mail: zhaohuan_2010@163.com
*通信作者 周永红，男，博士，教授，博士生导师，主要从事植物资源的保护与利用。
Tel: (028)86291005 Fax: (028)86291005 E-mail: zhouyhdavid@126.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 13 期 2014 年 7 月

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集素、雪花莲相关凝集素、含 Hevein 结构域的壳多
糖结合蛋白、II 型核糖体失活蛋白（RIP）、葫芦科
韧皮部凝集素、木菠罗素（jacalin）家族和苋科凝
集素。目前，已经发现的植物凝集素超过 1 000 种，
广泛分布于豆科、茄科、大戟科、禾本科、百合科、
天南星科和石蒜科等众多植物类群中。
半夏 Pinellia terenata (Thunb.) Breit. 为天南星
科半夏属多年生草本植物，是中国的传统中药，以
块茎入药，具有消痞散结、燥湿化痰、降逆止呕的
功效[3]。半夏主要含有生物碱、谷甾酸、多糖、氨
基酸、挥发油、半夏蛋白及无机元素等多种有效成
分，而凝集素是半夏蛋白的重要组分之一。半夏凝
集素（Pinellia ternate agglutinin，PTA）隶属于雪花
莲相关凝集素家族，该家族成员可专一性结合对甘
露糖，具有抗虫、抗菌和凝血活性等药理作用[4]。
自 Yao 等[5]于 2003 年首次克隆了 PTA 基因以
来，半夏凝集素序列被大量报道，就已报道的 PTA
序列而言，该序列无内含子。目前，PTA 基因已相
继成功转化了水稻、小麦、烟草、油菜、大青、菘
蓝等，抗虫鉴定表明，相应的转基因植株对刺吸式
害虫如褐飞虱、二化螟、麦蚜、桃蚜等均表现出一
定抗性，但对其亚细胞定位的研究尚未见报道[6-11]。
本实验以半夏新鲜叶片的 DNA 为模板，NCBI 库中
已报道的 PTA 基因的序列设计特异性引物，克隆了
PTA 基因的全长，并将其连接到含有绿色荧光蛋白
标记的真核表达载体 pI1300-CaMV35S 上，通过对
基因序列的分析与其亚细胞定位的初步研究，旨在
从分子水平阐明 PTA 抗病害的机制，以期为 PTA
基因的抗病虫害机制研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为来自川半夏主产区四川省南充市
的野生半夏，经西华师范大学彭正松教授鉴定为
半夏 Pinellia ternata (Thunb.) Breit.。农杆菌
GV3101、植物表达载体 pI1300-CaMV35S-GFP 和
烟草 Nicotiana tabacum L. 均由四川农业大学水
稻研究所植物病理实验室提供。
1.2 方法
1.2.1 半夏 DNA 的提取及 PTA 基因的扩增 用常
规的 CTAB 法提取半夏叶片的 DNA，以其为模板
用特异性引物 PTA_F：5’-ACAGGTACCATGGCCT
CCAAGCTCCTC-3’和 PTA_R：5’ACAGGTACCAT-
TCACCTTCTCCGTCACCA-3’（划线部分为 kpnI
酶切位点的序列）进行 PCR 扩增。PCR 反应程序
为 94 ℃预变性 2 min，94 ℃变性 15 s，55 ℃退火
30 s，68 ℃ 延伸 1 min，共 30 个循环，72 ℃延伸
10 min。
1.2.2 PTA 基因对植物表达载体的转化 将 PCR
产物回收，连接于 pEASY-Blunt Simple 载体，鉴别
阳性克隆 pEASY-Blunt-PTA，经酶切和测序验证正
确后，从 pEASY-Blunt 载体上酶切、回收 PTA 基因，
将 其 连 接 于 已 切 好 的 植 物 表 达 载 体
pI1300-CaMV35S-GFP，并转化大肠杆菌 DH5α 感
受态细胞，然后鉴定阳性克隆并抽提质粒。将质粒
通过冻融转化法导入农杆菌 GV3101 感受态细胞
中，鉴定农杆菌阳性克隆，备用。
1.2.3 序列分析 所获得的序列已提交至
GenBank，PTA 基因的序列号和蛋白质序号为
KF154979 和 AGV40777。引物设计使用 NTI 软件
完成；使用 http//expasy.org/进行 PTA 基因的氨基酸
序列翻译、相对分子量与等电点的预测；使用
SignalP 和 Wolf 程序分别对其信号肽切割位点和亚
细胞定位进行预测；使用 http//smart.embl-heidelbe-
rg.de/对其结合域进行预测；使用 DNAMAN6.0 软
件对相应的氨基酸序列进行比对，并用 MEGA 软件
对其进行聚类分析。
1.2.4 PTA基因在烟草中的瞬时表达 将鉴定的农
杆菌单克隆接种到 5 mL 含 Kan 和 Rif 的 YEB 液体
培养基，于 28 ℃培养 16 h 至吸光度（A600）值为
0.5。将菌液 4 000 g/min 离心 10 min，用 5 mL 缓冲
液 10 mmol/L 氯化镁重悬，用 1 mL 无菌医用注射
器吸取菌液，注射器尖端贴紧烟草叶片，将菌液从
下表皮缓缓注射进叶片中，48 h 后将注射的叶片从
烟草植株上取下，在荧光共聚焦显微镜下观察 PTA
基因的亚细胞定位。注射实验重复 3～5 次。
2 结果与分析
2.1 PTA 的扩增及鉴定
以半夏叶片基因组 DNA 为模板，用特异引物
PTA_F、PTA_R 进行扩增，其 PCR 产物为单一明亮
的特异性片段，其大小约为 850 bp，与预期片段大小
相符（图 1）。将 PCR 扩增片段纯化回收后，克隆到
pEASY-blunt 载体，再转化到大肠杆菌 DH5α 感受态
细胞，筛选阳性重组子并酶切、回收 PTA 基因，将回
收后的 PTA 基因连接到预先酶切好的植物载体
pI1300-CaMV35S-GFP 上，提取阳性重组质粒用 kpnI
单酶切，结果表明，酶切片段的大小约为 850 bp，与
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原 PCR 产物的长度一致（图 2）。将重组质粒导入农
杆菌 GV3101，用 PTA_F 和 GFP_R 进行菌落 PCR 检
测，结果表明，所选择的阳性克隆在约 1 000 bp 处均
具有明显的条带（图 3）。说明插入的 PTA 基因的位
置、方向及阅读框均正确，重组表达载体 pI1300-
CaMV35S-PTA-GFP 构建成功。

M-Marker 1～3-PCR 产物
M-Marker 1—3-PCR productions
图 1 PTA 的 PCR 扩增
Fig. 1 PCR application of PTA

M-Marker 1～2-单酶切产物
M-Marker 1—2-the result of single digest
图 2 重组质粒 pI1300-CaMV35S-PTA-GFP 的单酶切结果
Fig. 2 Single digestion of recombinant plasmid
pI1300-CaMV35S-PTA-GFP

M-Marker 3, 5～7, 11～12-阳性克隆的检测 1, 2, 4, 8～10-未检出
M-Marker 3, 5—7, 11—12-detection of positive colony 1, 2, 4,
8—10-not dectected
图 3 菌落 PCR 扩增
Fig. 3 PCR amplification of colony
2.2 PTA 的序列分析
对 PTA 基因进行测序和分析，发现目的片段
的长度为 810 bp，其编码氨基酸残基的长度为 269
bp。序列的 N 端含有一条 24 氨基酸的信号肽序列，
其剪切位点位于第 24 位的丙氨酸（A24）与第 25
位的缬氨酸（V25）之间。PTA 氨基酸序列中还含
有 3 个保守的甘露糖位点结合位点基序，分别为位
于第 51～59 位氨基酸的 QXDCNAVLY，第 172～
180 位氨基酸的 QGDCNLVLY，和第 234～242 位
氨基酸的 QXXGXXVXY。进一步分析发现，第 2
个甘露糖结合位点基序最为保守，第 3 个甘露糖结
合位点基序的特异性最强（4/9）。此外，该序列中
还包含 2 个保守的 B-lectin 结合域，分别位于第
27～131 位氨基酸和第 145～252 位氨基酸（表 1
和图 4）。
2.3 PTA 的序列同源性分析
利用 DNAMAN 软件对克隆所得的 PTA
（AGV40777）在 GenBank 数据库中查询得到半夏属
属 3 个种 6 条凝集素基因氨基酸序列的登录信息进
行同源比较（表 2）。其中，PTA 基因（Pinellia ternata
agglutinin ， PTA ， AAR27794 、 AAP20876 和
ABX47148）3 条，掌叶 PTA 基因（Pinellia pedtaisecta
agglutinin，PPA，AAR27793 和 ADK56179）2 条，
滴水珠凝集素基因（Pinellia cordata agglutinin，
PCA，ABK88277）1 条。结果显示，半夏属凝集素
的种间序列长度差异较大，其中，PTA 的氨基酸序
列长度为 268～269 bp，而 PPA 和 PCA 的序列长度
均为 256～258 bp。相较于 PPA（序列同源性为
85.9%）而言，PTA 序列间的差异小，同源性高达
97.4%～100%。进一步分析发现，PTA AGV40777
和 AAR27794 间的序列同源性最高（100%），PTA
（AAP20876 和 ABX47148）均与 PCA（ABK88277）
序列同源性最低（82%）。以雪花莲凝集素基因的氨
基酸序列为外类群（Galanthus nivalis agglutinin，
GNA，AAL07474 和 AAL07476），采用 MEGA 软件
的 Neighbor-joining (NJ)方法对序列进行聚类，聚类
结果（图 5）表明，PTA 和 PPA AAR27793 聚为第
I 类，PPA ADK56179 和 PCA 聚为第 II 类，而外类
群的雪花莲凝集素单独聚为 III 类。
2.4 在烟草中的瞬时表达
应用 Wolf 程序对 PTA 基因的亚细胞定位进行
预测，分析表明 PTA 蛋白位于细胞膜上。为了进
一步验证 PTA 的亚细胞定位，本实验构建了 PTA

M 1 2 3
850 bp
M 1 2
850 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 000 bp
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表 1 半夏属凝集素活性位点氨基酸序列分析
Table 1 Analysis on amino acid sequence of mannose binding sites from PTA
材料 序列号 甘露糖结合位点 1 甘露糖结合位点 2 甘露糖结合位点 3
滴水珠 ABK88277 QEDCNAVLY QGDCNLVLY QDDGFAVVY
掌叶半夏 AAR27793 QDDCNAVLY QGDCNLVLY QEDGLAVIY
掌叶半夏 ADK56179 QEDCNAVLY QGDCNLVLY QEDGFAVIY
半夏 AAR27794 QEDCNAVLY QGDCNLVLY QDNGYGVIY
半夏 AAP20876 QEDCNAVLY QGDCNLVLY QDNGYGVIY
半夏 ABX47148 QDDCNAVLY QGDCNLVLY QDNGYGVIY
半夏 AGV40777 QEDCNAVLY QGDCNLVLY QDNGYGVIY

红色下划线为甘露糖结合位点，绿色下划线为信号肽序列
Three mannose binding sites and signal peptide were underlined by red and green
图 4 半夏属凝集素的氨基酸序列比对
Fig. 4 Multiple alignments of amino acid sequence from PTA
表 2 半夏属凝集素的氨基酸序列的同源性分析
Table 2 Homological analysis of amino acid sequences in PTA
相似度 / % 凝集素
ABK88277 AAR27793 ADK56179 AAR27794 AAP20876 ABX47148 AGV40777
ABK88277 100
AAR27793 83.60 100
ADK56179 90.60 85.90 100
AAR27794 83.20 91.00 85.20 100
AAP20876 82.00 90.20 84.00 97.40 100
ABX47148 82.00 90.60 84.30 97.80 95.50 100
AGV40777 83.20 91.00 85.20 100 97.40 97.80 100

融合蛋白植物表达载体 pI1300-CaMV35S- PTA-GFP
并将该载体导入 GV3101 农杆菌菌株，通过注射器
将其到烟草叶片中，共培养 48 h 后用 FM4-64 进行
细胞膜染色，在激光共聚焦显微镜下观察。结果显
示，重组质粒 pI1300-CaMV35S-PTA-GFP 的绿色
荧光基本均匀分布于整个细胞膜上（图 6），且 GFP
绿色荧光区域同 FM4-64的红色荧光区域完全重叠
（图 6），表明 PTA 定位于细胞膜上，这与预测结果
一致。
3 讨论
3.1 序列分析
Yao等[5-6]应用RACE技术克隆了 PTA的 cDNA
全长并研究了相应的转基因烟草植物的抗虫性，结
果表明，PTA 的 cDNA 全长为 810 bp，编码一条 269
个氨基酸的前体蛋白，蛋白质相对分子质量为 29
400，转 PTA 的烟草显著地抑制了桃蚜 Myzus
persicae Sulzer 的生长。张红宇等[7]将 PTA 导入水
稻并研究了转基因植株对褐飞虱的抗性，结果表
ABK88277
AAR27793
ADK56179
AAR27794
AAP20876
ABX47148
AGV40777
consensus

ABK88277
AAR27793
ADK56179
AAR27794
AAP20876
ABX47148
AGV40777
consensus

ABK88277
AAR27793
ADK56179
AAR27794
AAP20876
ABX47148
AGV40777
consensus
100
100
100
100
100
99
100


198
198
200
198
198
197
198


256
256
258
269
269
268
269
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图 5 基于 NJ 方法构建半夏属凝集素家族的
系统进化树
Fig. 5 Phylogenetic tree from PTA constructed
by using NJ method
明，克隆的 PTA 的蛋白质相对分子质量为 29 100，
编码一条 268 个氨基酸的前体蛋白，且转基因纯
系对褐飞虱的存活率和发育进度均有显著的抑制
作用。
Xiao 等[11]克隆了 PTA 并连同苏云金芽孢杆菌
Cry1Ac 基因同时导入大青，结果发现，PPT 全长 804
bp，蛋白质相对分子质量为 25 000，转基因大青对
小菜蛾 Plutella xylostella L.和桃蚜的抗性增强。本实
验克隆的 PTA 基因全长为 810 bp，无内含子，编码
一条具有 269 个氨基酸的前体蛋白。此外，该基因
具有雪花莲相关的凝集素家族特有的特征信号序
列和甘露糖结合位点基序，与 NCBI 中已经登录

重组质粒 pI1300-CaMV35S-PTA-GFP FM4-64 融合图像
图 6 PTA 在烟草叶片表皮细胞中的亚细胞定位
Fig. 6 Subcellular location of PTA in epidermal cells of tobacco leaves
的 PTA 的氨基酸序列相似性高于 97%，说明不同半
夏植株的凝集素序列具有高度保守性。
3.2 同源性分析
高等植物的凝集素基因是一个多基因家族，
van Damme 等[2]根据植物凝集素的进化及结构特
点将其划分为 7 类。随着越来越多的新的植物凝
集素被克隆，Jiang 等[12]根据其序列中结合域的特
点进一步将植物凝集素划分为 12 类。本实验克隆
所得的 PTA 与 NCBI 已报道的半夏属 3 种 6 条凝
集素的多序列分析结果表明，半夏属植物的凝集
素基因序列同源性很高。从半夏属凝集素甘露糖
结合位点基序来看，半夏属凝集素的 3 个甘露糖
结合位点基序的保守性不同，第 1 个甘露糖结合
位点基序较为保守，仅第 2 个氨基酸存在差异；
第 2 个结合位点的氨基酸序列完全一致；而第 3
个结合位点保守性最低且基序存在种属特异性，
且同种的不同材料间也存在差异，进一步支持了
张正英[13]的结论。梁江丽等[14]通过原核表达获得
了 PTA 和 PPA，比较分析发现，PPA 的凝集活力
为三叶半夏凝集素的 4 倍，从而推测凝集素第三
个活性位点的氨基酸的差异可能是引起半夏和
PPA 凝集活性不同甚至药理作用不同的主要原
因。本实验的发现，半夏属不同种凝集素的第 3
个甘露糖结合位点基序不尽相同，哪种凝集素的
抗病虫功能最优，还需进一步验证。
从半夏属凝集素序列的聚类结果来看，所有
的半夏凝集素序列聚为第 I 类，滴水珠凝集素序
列聚为第 II 类，PPA 在第 I、II 中均有分布，究其
原因可能是 PPA AAR22793 是仅在块茎中特异表
达，在不同的组织中分布着不同的同工凝集素[15]。
Liu 等[16]应用 ISSR 和 SRAP 分析了半夏属 5 个种
的亲缘关系，研究表明，滴水珠与掌叶半夏的遗
传关系较近，与半夏的遗传关系较远。本实验的
聚类结果在一定程度上支持了 Liu 的结论，但凝
集素序列是否可作为半夏属间分类标准，还值得
进一步商榷。
3.3 亚细胞定位分析
Hwang 等[17]通过对胡椒凝集素（CaMBL1）基
AAR27793
ABX47148
AAR27794
AGV40777
AAP20876
ABK88277
ADK56179
AAL07474
AAL07476
I


II


III
0.1
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因的研究发现，CaMBL1 基因的氨基酸序列中含有
GNA-related lectin 结合域，可特异识别番茄疮痂病辣
椒斑点病菌 Xanthomonas campestris pv vesicatoria 表
面的甘露糖，且该基因定位于质膜上。CaMBL1 基
因可通过调节胡椒叶表面的细胞死亡、水杨酸的积
累和防御基因的表达量，从而起到抑菌作用。Chen
等[18]研究了水稻 Pi-d2 基因对水稻稻瘟病的抗性，
结果发现，Pi-d2 基因的氨基酸序列含有一个
B-lectin 结合域和一个丝氨酸-苏氨酸激酶结合域，
且 Pi-d2 基因定位于质膜上，过量表达 Pi-d2 基因
可以增强转基因植株对稻瘟病菌 Magnaporthe
grisea strain ZB15 的抗性。结合之前的报道，本实
验进一步采用 FM4-64 为探针荧光标记细胞膜，初
步将其定位于细胞膜上。
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