全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 5 期 2014 年 3 月

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一氧化氮和水杨酸依次介导内生真菌诱导子促进苍术细胞中苍术素生物合
成的信号转导
陶金华 1，汪冬庚 1，濮雪莲 1，黄金华 1，赵 喜 1，仇雯倩 1，江 曙 2
1. 南通大学，江苏 南通 226019
2. 南京中医药大学，江苏 南京 210023
摘 要：目的 研究介导内生真菌诱导子促进苍术悬浮细胞中苍术素生物合成的信号分子及信号转导途径，并探讨诱导子对苍术
素合成途径关键酶活性的影响。方法 采用植物细胞悬浮培养法，考察内生真菌诱导子处理下苍术细胞中一氧化氮（NO）、水杨
酸（SA）及苍术素量的变化。结果 内生真菌诱导子通过诱导苍术细胞中一氧化氮合酶（NOS）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）以及
乙酰辅酶 A 羧化酶（ACC）的活性，显著促进苍术细胞的 NO 迸发、SA 和苍术素的合成。NOS 抑制剂 PBITU 可以阻断诱导子对
NO、SA 和苍术素合成的促进作用，外源 NO 供体 SNP 及外源 SA 单独处理也能促进苍术素的合成，说明 NO 和 SA 是参与苍术
素合成的信号分子，且 NOS 是参与诱导子诱发苍术细胞 NO 迸发的主要途径。NO 猝灭剂 cPITO 可以有效清除诱导子诱发苍术细
胞的 NO 迸发，显著阻断诱导子对苍术细胞中 SA 和苍术素合成的促进作用，外源 SNP 可以逆转 cPITO 对 PAL、ACC 活性以及
SA、苍术素合成的抑制作用，表明 NO 是介导内生真菌诱导子诱发苍术细胞中苍术素和 SA 生物合成所必需的上游信号分子。结
论 NO 主要通过 SA 信号途径介导内生真菌诱导子激活 ACC，显著促进苍术细胞中苍术素的生物合成。
关键词：内生真菌诱导子；苍术；一氧化氮；水杨酸；苍术素；一氧化氮合酶；苯丙氨酸解氨酶；乙酰辅酶 A 羧化酶
中图分类号：R282.13 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)05 - 0701 - 08
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.05.020
Signal transduction of atractylodin biosynthesis in Atractylodes lancea cell induced
by endophytic fungal elicitor mediated with nitric oxide followed by salicylic acid
TAO Jin-hua1, WANG Dong-geng1, PU Xue-lian1, HUANG Jin-hua1, ZHAO Xi1, QIU Wen-qian1, JIANG Shu2
1. Nantong University, Nantong 226019, China
2. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China
Abstract: Objective To investigate the signal molecules and signal transduction involved in endophytic fungal elicitor-induced
atractylodin biosynthesis and the effect of an endophytic fungal elicitor on the key enzyme activity in Atractylodes lancea. Methods
Content changes of nitric oxide (NO), salicylic acid (SA), and atractylodin were detected under the endophytic fungal elicitor treatment by
plant cell suspension culture technology. Results The endophytic fungal elicitor remarkably promoted NO burst and the biosynthesis of
SA and atractyodin by activating nitric oxide synthase (NOS), phenylalanine ammonia lyase (PAL), and acetyl coenzyme A carboxylase
(ACC), respectively. NOS inhibitor PBITU could inhibit the NO and SA accumulation and the atractyodin biosynthesis induced by the
elicitor. And atractyodin biosynthesis could also be triggered by exogenous NO or SA. The results indicated that NO and SA were the
necessary signal molecules and NO burst was mediated by NOS induced by endophytic fungal elicitor. NO quencher cPITO could
effectively remove NO burst in A. lancea cell induced by endophytic fungal elicitor and notably inhibit the biosynthesis promotion of SA
and atractyodin in A. lancea cell induced by endophytic fungal elicitor. Exogenous SNP could reverse the cPITO inhibition on the activity
of PAL and ACC and the synthesis of SA and atractylodin. This suggested that NO was an upstream signal molecule mediated endophytic
fungal elicitor to accelerate the biosynthesis of SA and atractyodin. Conclusion Endophytic fungal elicitor mediated through NO
followed by SA could promote atractyodin biosynthesis by activating ACC in A. lancea.
Key words: endophytic fungal elicitor; Atractylodes lancea (Thunb.) DC.; nitric oxide; salicylic acid; atractyodin; nitric oxide synthase;
phenylalanine ammonia lyase; acetyl coenzyme A carboxylase


收稿日期：2013-09-03
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81102743）
作者简介：陶金华（1984—），女，江苏南通人，硕士，从事微生物与药用植物品质的相关研究。E-mail: taojinhua2000@163.com
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药用植物细胞不仅具有形态建成全能性，同时
还具有物质代谢全能性，根据“细胞全能性”原理
发展起来的细胞培养技术被视为解决中药及天然药
物资源可持续发展问题的一种新型生物技术。但到
目前为止，能够采用细胞培养技术进行产业化生产
的天然活性物质种类非常有限。制约该项技术产业
化应用的核心问题之一是培养细胞中活性物质的低
产现象。因此研究探讨药用植物细胞次生代谢产物
合成的高产调控技术具有重要的理论和实践意义。
现代研究表明，中药及天然药用植物次生代谢及次
生代谢物的生物合成，受到自身和环境中各种生物
和非生物因素的调控。干旱、高温、辐射等非生物
逆境胁迫以及微生物侵染等生物胁迫均可以激活植
物体内次生代谢物的生物合成途径，显著提高植物
次生代谢物的合成代谢水平[1]。近年来，利用内生
真菌诱导子激活药用植物细胞次生代谢途径，促进
活性成分的合成与积累是国内外植物细胞培养领域
中提高次生代谢物质产量的研究热点之一[2-3]。内生
真菌是生长在植物体内，与宿主植物互惠进化的一
类微生物，也是许多植物在自然生长条件下常见的
一种生物胁迫因子，可以诱发植物细胞产生一系列
与信号转导有关的生理生化效应，如离子跨膜运输、
蛋白质磷酸化和脱磷酸化以及一氧化氮（nitric
oxide，NO）和水杨酸（salicylic acid，SA）的合成
等[4-6]。因此，利用内生真菌诱导子可促进药用植物
细胞生物合成和积累次生代谢物，也为研究药用植
物次生代谢的调控提供了新途径。
苍 术 素 是 我 国 大 宗 常 用 中 药 材 苍 术
Atractylodes lancea (Thunb.) DC. 的主要活性成分
之一，具有保肝、抗缺氧、降血糖、抗炎等多种生
物活性[7]。由于苍术自然植物资源有限，而且天然
苍术植物中苍术素的量较低，因此利用苍术细胞培
养法将为苍术素的生产提供一种新的途径。本实验
以苍术悬浮细胞为材料，系统研究了内生真菌诱导
子处理对苍术素合成与积累的影响，并探讨了内生
真菌诱导子处理诱发苍术素合成的信号转导机制。
研究结果对揭示内生真菌诱导子诱发药用植物次
生代谢产物合成的信号转导机制具有重要意义。
1 材料
材料采自江苏省茅山地区，经南京中医药大学
陈建伟教授鉴定为苍术 Atractylodes lancea (Thunb.)
DC. 的新鲜植株。
净化工作台（SW—CJ—1FB，苏州净化设备有
限公司），HP1100 高效液相色谱仪（四元梯度泵、
在线真空脱气机、柱温箱和二极管阵列检测器
DAD）。
2 方法
2.1 内生真菌诱导子的制备
将内生真菌 Rhizoctonia DC. ex Fr. 接入发酵培
养液，28 ℃，200 r/min 振荡培养 7～10 d，发酵结
束后，5 000 r/min 离心 10 min，分离菌体和发酵液，
菌体匀浆后与发酵液混合，抽滤，将滤液减压浓缩
后，于 121 ℃灭菌 20 min，即为内生真菌诱导子。
用总糖标定其浓度，采用蒽酮-硫酸法测定糖量[8]。
2.2 苍术悬浮细胞系及培养条件的建立
按文献方法[9]进行苍术愈伤组织的诱导及悬浮
细胞系的建立。选取生长旺盛，质地疏松的愈伤
组织约 2.0 g，接种于装有 300 mL MS 液体培养基
的 1 000 mL 三角瓶中，25 ℃，120 r/min 悬浮振荡
培养。5 d 继代 1 次，连续继代 3～5 次，将细胞悬
浮培养物用 80 目镍网滤过，滤液分装后继续培养，
作为起始悬浮培养液。
2.3 苍术细胞中苍术素量及乙酰辅酶 A 羧化酶
（ACC）活性的测定
苍术素量按文献的方法[10]进行测定；ACC 活性
测定[11]：取 10 μL 待测液，加入 90 μL 反应液 [60
mmol/L N-二羟乙基甘氨酸-NaOH（pH 9.0）、3
mmol/L ATP 、 10 mmol/L MgCl2 、 9 mmol/L
NaHCO3（0.621 μCi/mmol）、0.7 mmol/L 丙二酰辅
酶 A]，37 ℃反应 12 min 后加 6 mol/L HCl 25 μL 终
止反应。用滤纸吸取 100 μL 反应液，风干过夜。风
干后的滤纸放入闪烁管中，加入 2 mL 闪烁液浸泡
过夜。最后将闪烁液置于液体闪烁计数仪下计数 1
min。ACC 酶活性以 1 min 内每克蛋白质中丙二酰
辅酶 A 的量来表示。
2.4 苍术细胞中 SA 量及苯丙氨酸解氨酶（PAL）
活性的测定
2.4.1 SA 的测定[12] 采用 HPLC 法测定 SA 量。取
苍术细胞 0.5 g，加液氮研磨成粉末，加入 1.5 mL
90%甲醇，旋涡混匀 1 min，超声波处理 5 min，离
心，上清液转入 2 mL Ep 管中，残留物用 0.5 mL 甲
醇重提取，再次旋涡、超声波、离心处理，合并 2
次上清液，离心，上清液加入 10 μL 0.2 mol/L 的
NaOH 溶液，浓缩至干，用 300 μL 5%三氯醋酸旋
涡混匀，用 800 μL 醋酸乙酯-环己烷（1∶1）萃取 2
次，合并有机相，加入 60 μL 0.2 mol/L 乙酸钠缓冲
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液（pH 5.5），离心，浓缩至干，残留物溶于 600 μL
HPLC 流动相中，即为待测样品。采用 HPLC 法测
定 SA 量，色谱条件：色谱柱为 Thermo-C18 柱（250
mm×4.6 mm，5 μm），流动相为 0.2 mol/L 乙酸钠
缓冲液-甲醇（9∶1），pH 5.5，体积流量 1.0 mL/min。
2.4.2 PAL 活性测定 取 5.0 g 滤过收集的苍术细
胞，按 1∶2 的比例加入提取液（50.0 mmol/L pH 8.0
Tris-HCl 缓冲液，10.0 mmol/L 巯基乙醇，4.0
mmol/L EDTA，1.0 μmol/L 亮抑蛋白酶肽），冰浴
中研细，−4 ℃，10 000×g 离心 15 min。取上清
液 1 mL 按文献的方法[13]测定 PAL 酶活性。PAL
酶活性以 1 h内每毫克蛋白质中反式肉桂酸的量来
表示。
2.5 苍术细胞中 NO 量及一氧化氮合酶（nitric
oxide synthase, NOS）活性的测定
2.5.1 NO 的测定[14] 在酸性条件下将 NO 氧化成
亚硝酸盐，利用 Greiss 试剂（1%对氨基苯磺酸，0.1%
N-萘基-乙二胺，5%磷酸）测定所生成的亚硝酸盐
量，推算细胞中 NO 浓度。不同处理的苍术悬浮细
胞经 0.22 μm 微孔滤膜滤过后，取 1 mL 滤液加入 1
mL Greiss 试剂振荡混匀，室温下放置 30 min 后，
在 550 nm 处测定吸光度值，利用 NaNO2 标准曲线
计算 NO 的量。
2.5.2 NOS 活性的测定[15] 采用瓜氨酸分析法测
定。取 1.0 g 新鲜苍术细胞，加入 50 mg 聚乙烯吡
咯烷酮，1.0 mL 冷冻的提取缓冲液（50 mmol/L Tris，
pH 7.4，含有 320 mmol/L 蔗糖，10 μg/mL 亮抑蛋
白酶肽，10 mmol/L 还原型谷胱甘肽，10 mmol/L
二硫苏糖醇和 1 mmol/L 苯甲基磺酰氟），研细后在
4 ℃，12 000 r/min 离心 10 min。以 L-[U-14C] Arg
为底物，通过测定 L-[U-14C] 瓜氨酸的生成量表示
NOS 活性。取 40 μL 上述离心上清液，加入 100 μL
测定缓冲液 [40 mmol/L HEPES，pH 7.2，含有 10
μmol/L FDA，10 μmol/L FMN，1 mmol/L 二硫苏糖
醇，1.25 mmol/L CaCl2，50 μmol/L 6(R)-5, 6, 7,
8-tetrahydrobiopterin，10 μg/mL 钙调蛋白，1 mmol/L
NADPH 和 1 μmol/L（1 580 Bq）L-[U-14C] Arg]。室
温下放置 30 min 后，加入 1 mmol/L Dowex-Ag 50
W[以含 10 mmol/L EDTA（1∶1.5）的 100 nmol/L
HEPES 溶解]，15 ℃，12 000 r/min 离心 10 min，
取 40 μL 反应液用 LS 6000（Beckman，Fullerton CA）
测定仪测定。采用考马氏亮蓝法测定蛋白质量，以
每小时内 1 mg 瓜氨酸中含有 L-[U-14C]瓜氨酸的量
表示 NOS 活性。
2.6 外源硝普钠（SNP）、cPTIO 和 PBITU 对苍术
细胞的处理方法
选用培养 12 d 的苍术细胞，添加 NO 专一性淬灭
剂 cPTIO（2, 4-carboxyphenyl-4, 4, 5, 5-tetramethylimi-
dazoline-1-oxyl-3-oxide）和 NOS 抑制剂 PBITU [l,
3-phenylene-bis (1, 2-ethanediyl)-bis-isothiourea]，添加
时间为内生真菌诱导子或 SNP 处理前 20 min，NO
和 SA 量测定时间分别为处理后 9 h 和 15 h，苍术
素的测定时间为处理后的第 9 天；NOS、PAL 及
ACC 酶活性测定时间分别为处理后 9、12、24 h。
所测数值为 5 次实验的平均值，诱导子质量浓度为
40 μg/mL，对照组细胞加入等体积的水。
2.7 SA 合成抑制剂对 PAL、NOS、ACC 酶活性及
苍术素积累的影响
在培养 12 d 的苍术悬浮细胞培养液中加入 SA
合成抑制剂 AOPP（L-α-aminooxy-β-phenylpropionic
acid）20 min 后，再加入终质量浓度为 40 μg/mL 的
内生真菌诱导子，处理后 9、12、24 h 分别测定 NOS、
PAL 及 ACC 酶活性，苍术素的测定时间为处理后
的第 9 天；所测数值为 5 次实验的平均值，对照组
细胞加入等体积的水。
3 结果与分析
3.1 内生真菌诱导子诱发苍术细胞 NO 迸发、SA 积
累和苍术素合成及对 NOS、PAL、ACC 活性的影响
苍术活性成分苍术素属于一种聚炔类化合物，
从生源途径来看，聚炔类化合物的生物合成与脂肪
酸类似，都是由乙酸、乙酰辅酶 A 及丙二酰辅酶 A、
多酮类化合物而合成的。一般认为聚炔类合成途径
是油酸通过代谢中间体还阳参油酸，再经过连续脱
氢等变化，产生一系列聚炔类化合物。其中 ACC 是
脂肪酸及聚炔类化合物生物合成途径中的关键酶和
限速酶[16]。ACC 的表达容易受到外界因子（微生物
感染、H2O2、茉莉酸等）的诱导，如真菌诱导子可使
ACC 的表达显著增强[17]。本课题组前期从茅苍术新
鲜植株中分离到一株内生真菌 Rhizoctonia SP1，以其
菌体制备的诱导子显著促进苍术素的生物合成[10]。
本实验主要研究介导Rhizoctonia SP1诱导子促
进苍术素合成的苍术细胞内信号分子及信号转导途
径。在苍术细胞培养至第 12 天时，添加 40 mg/L 的
Rhizoctonia SP1 诱导子，以不加诱导子的实验组作
为对照。结果表明，Rhizoctonia SP1 诱导子不仅可
以诱发苍术细胞中的 NO 迸发，同时还可以促进细
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胞中 SA 和苍术素量的增加。细胞中 NO 量在诱导
子处理后迅速增加，约在 9 h 时达到最高；SA 量的
增加滞后于 NO 量的变化，在诱导子处理 9 h 后开
始增加，并在 15 h 左右达到最高峰；苍术素量增加
是苍术细胞在诱导子处理下最晚出现的反应，在处
理 12 h 后才开始增加（图 1）。已有研究报道，NO
迸发是多种植物细胞在真菌诱导子处理下出现的早
期反应之一[18-19]。此外，在经过内生真菌诱导子处
理后，苍术细胞中NO、SA、苍术素合成关键酶NOS、
PAL 以及 ACC 的活性均出现了相应的动态变化（图
2），未经诱导子处理的对照，NOS、PAL 以及 ACC

图 1 内生真菌诱导子对 NO、SA 以及苍术素合成的影响
Fig. 1 Effects of endophytic fungal elicitor on biosynthesis
of NO, SA, and atractylodin

图 2 内生真菌诱导子对 NOS、PAL 以及 ACC 酶活性的影响
Fig. 2 Effects of endophytic fungal elicitor on activities
of NOS, PAL, and ACC
活性分别在（2.6±0.2）、（90.5±6.2）、（1.8±0.2）/
[nmol·(mg·h−1)] 波动。NOS和PAL活性在Rhizoctonia
SP1 诱导子处理 3、6 h 后开始增加，分别在第 9 小
时和第 12 小时达到最高值，分别是对照的 4.4 和 4.7
倍。随着处理时间的延长，NOS、PAL 活性逐步减
弱。ACC 活性的动态变化落后于 NOS 和 PAL 活性
的变化，在诱导子处理 9 h 后开始逐步增强，且在相
对较长的时间内维持了较高的活性，显著高于对照
组ACC的活性，从而有利于促进苍术素的大量合成。
上述结果表明，内生真菌 Rhizoctonia SP1 诱导
子能够诱发苍术细胞 NO 迸发，SA 积累和苍术素的
合成，从诱发的时间顺序来看，SA 和苍术素的合
成滞后于 NO 迸发，且诱导子诱发的相应关键酶活
性变化和 NO、SA、苍术素量的变化一致。
3.2 NO 介导内生真菌诱导子诱发苍术细胞中 SA
和苍术素的合成及对 NOS、PAL、ACC 活性的影响
上述实验结果虽然证实 NO 和 SA 是介导内生
真菌诱导子诱发苍术细胞苍术素合成的 2 种信号分
子，然而对于 NO 和 SA 在介导过程中的相互关系
尚不清楚。为了进一步探讨信号分子 NO 和 SA 在
介导内生真菌诱导子促进苍术素合成中的相互作
用，考察了 NO 专一性猝灭剂 cPITO 以及 NOS 专
一性酶抑制剂 PBITU 对 NO 迸发、SA 积累和苍术
素合成的影响。在对苍术细胞进行诱导子处理前 20
min 分别加入 cPITO 和 PBITU，结果表明，cPITO
能够有效地清除苍术细胞中的 NO，PBITU 对诱导
子诱发苍术细胞中 NO 合成具有显著的抑制作用，
抑制率达到 75.7%（图 3-a）。cPITO 和 PBITU 处理
也对诱导子诱发细胞中 SA 的产生具有显著的抑制
作用，通过添加一种常用的 NO 供体 SNP 提供外源
NO，可以逆转 PBITU 对细胞中 SA 合成的抑制作
用（图 3-b）。NO 猝灭剂以及 NOS 抑制剂均能够显

A-对照 B-诱导子 C-诱导子＋cPITO（20 mmol/L） D-诱导子＋PBITU（20 mmol/L） E-SNP（5 mmol/L）＋cPITO（20 mmol/L）
F-SNP（5 mmol/L） G-诱导子＋PBITU（20 mmol/L）＋SNP（5 mmol/L）
A-control B-elicitor C-elicitor＋cPITO（20 mmol/L） D-elicitor＋PBITU（20 mmol/L） E-SNP（5 mmol/L）＋cPITO（20 mmol/L）
F-SNP（5 mmol/L） G-elicitor＋PBITU（20 mmol/L）＋SNP（5 mmol/L）
图 3 cPITO 和 PBITU 对苍术细胞中 NO 迸发 (a)、SA 积累 (b) 及苍术素 (c) 合成的影响
Fig. 3 Effects of cPITO and PBITU on biosynthesis of NO (a), SA (b), and atractylodin (c) in A. lancea cells
NO
SA
苍术素
0 3 6 9 12 15 18 21 24
16
12
8
4
0 苍
术
素
/
(μ
g·
L−
1 )

N
O
/
(μ
m
ol
·L
−1
)
SA
/
(μ
g·
g−
1 )

4
3
2
1
0
t / h
500
400
300
200
100
0 P
A
L
/ (
nm
ol
·m
g−
1 ·h
−1
) NOS
ACC
PAL
N
O
S
/ (
nm
ol
·m
g−
1 ·h
−1
)
A
C
C
/
(n
m
ol
·m
g−
1 ·h
−1
)
0 3 6 9 12 15 18 21 24
t / h
14
12
10
8
6
4
2
0

N
O
/
(μ
m
ol
·L
−1
) 4
3
2
1
0
3
2
1
0
SA
/
(μ
g·
g−
1 )

苍
术
素
/
(μ
g·
L−
1 )
40
30
20
10
0
a b c
A B C D E A B C D F G A B C D F G
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著抑制诱导子诱发苍术素的合成（图 3-c）。由此证
实 cPITO 和 PBITU 是通过抑制细胞中 NO 的产生，
进而影响诱导子诱发 SA 的合成，导致苍术素产量
的降低。结果提示 NO 对诱导子诱发苍术细胞 SA
的产生具有较强的促进作用。此外，由于 cPITO 对
NO 的猝灭作用以及 PBITU 对 NOS 酶活性的抑制
作用，显著降低细胞中 NO 量，结果导致细胞中
PAL、ACC 酶活性大幅度降低，SA 和苍术素的合
成显著减少。NO 单独处理也能够触发苍术细胞中
PAL、ACC 的活化，SNP＋cPITO 处理组苍术细胞
中 PAL、ACC 活性与对照组无明显差异，PBITU
处理对诱导子诱发的 NOS 活性抑制率达到 96.1%
（图 4）。上述结果表明，NOS 是苍术细胞在内生真
菌诱导子处理下产生 NO 的主要途径，外源 NO 单
独处理以及内生真菌诱导子处理，均可诱发苍术细
胞中 PAL、ACC 的活化，显著促进 SA 和苍术素的
生物合成。由此可见，NO 是 SA 和苍术素生物合成
所必需的上游信号分子。

A-对照 B-诱导子 C-诱导子＋cPITO（20 mmol/L） D-诱导子＋PBITU（20 mmol/L） E-cPITO（20 mmol/L） F-PBITU（20 mmol/L）
G-SNP（5 mmol/L） H-SNP（5 mmol/L）＋cPITO（20 mmol/L） I-诱导子＋PBITU（20 mmol/L）＋SNP（5 mmol/L）
A-control B-elicitor C-elicitor＋cPITO（20 mmol/L） D-elicitor＋PBITU（20 mmol/L） E-cPITO（20 mmol/L） F-PBITU（20 mmol/L）
G-SNP（5 mmol/L） H-SNP（5 mmol/L）＋cPITO（20 mmol/L） I-elicitor＋PBITU（20 mmol/L）＋SNP（5 mmol/L）
图 4 cPITO 和 PBITU 对苍术细胞中 NOS (a)、PAL (b) 及 ACC 酶 (c) 活性的影响
Fig. 4 Effects of cPITO and PBITU on activities of NOS (a), PAL (b), and ACC (c) in A. lancea cells
3.3 SA 合成抑制剂对 NOS、PAL、ACC 酶活性及
SA、苍术素积累的影响
PAL 广泛存在于高等植物、部分微生物（真菌
等）以及某些藻类细胞中，是植物细胞合成 SA 的关
键酶之一，调控 SA 的合成[20]。PAL 是一种胞内诱
导酶，各种类型的低温、机械损伤、微生物感染等
都可以诱导 PAL 基因的表达[21]。在考察 PAL 抑制剂
AOPP 对苍术细胞 NO、SA 和苍术素量及关键酶活
性的影响实验中，发现 AOPP 对 NOS 活性及 NO 的
合成没有明显的影响，但显著抑制 PAL 的活性和 SA
的合成，部分抑制 ACC 的活性和苍术素的积累。
相对于诱导子处理组，AOPP＋诱导子处理组中PAL
活性和 SA 量分别下降了 96.4%和 97.0%；ACC 活
性和苍术素量分别减少了 70.4%和 60.5%（图 5、6）。
而添加外源 SA 可以解除 AOPP 对诱导子诱发 ACC
活化和苍术素合成的抑制作用（图 5-b、图 6-b）。
因此进一步证实了 SA 处于信号分子 NO 的下游，
且 NO 通过 SA 的转导作用是介导内生真菌诱导子
促进苍术细胞合成苍术素的主要信号转导途径。
4 讨论
药用植物次生代谢物的生物合成是受细胞内部

A-对照 B-诱导子 C-诱导子＋AOPP（20 mmol/L） D-AOPP
（20 mmol/L） E-诱导子＋AOPP（20 mmol/L）＋外源 SA（5 mmol/L）
A-control B-elicitor C-elicitor＋AOPP（20 mmol/L） D-AOP（20
mmol/L） E-elicitor＋AOPP（20 mmol/L）＋exogenous SA（5 mmol/L）
图 5 SA 合成抑制剂 AOPP 对 NO、SA 积累 (a) 及苍术
素合成 (b) 的影响
Fig. 5 Effect of SA biosynthesis inhibitor AOPP
on accumulation of NO and SA (a)
and biosynthesis of atractylodin (b)
N
O
S
/ (
nm
ol
·m
g−
1 ·h
−1
)
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图 6 SA 合成抑制剂对 PAL、NOS 及 ACC 酶
活性的影响
Fig. 6 Effect of SA biosynthesis inhibitor on activities
of NOS, PAL, and ACC
相关基因调控的一系列复杂生化反应过程，内生真
菌诱导子作为外界刺激因子本身并不直接参与细胞
内的次生代谢过程，因此在药用植物细胞内必然存
在着相关的胞内信号分子和相应的信号转导机制来
感受并传递外界因子的刺激信号，调控药用植物次
生代谢物的生物合成[22-23]。研究探讨药用植物细胞
中与次生代谢物生物合成调控有关的信号分子及信
号转导途径将有助于揭示内生真菌调控药用植物次
生代谢物生物合成的机制，为生产实践中提高药用
植物培养细胞的次生物质产量提供理论基础。
信号转导是植物体内一种常见的生理生化现
象，细胞内部的信号转导系统是介导内生真菌诱导
子等外界因子诱发药用植物次生代谢物生物合成的
桥梁和纽带，在植物生长发育、抗病、抗逆等过程
中发挥着重要作用。目前，植物抗病、防御反应等
信号转导途径研究比较深入，关于药用植物次生代
谢信号转导机制的研究仍处在初步探索阶段[19]。内
生真菌诱导子调控植物次生代谢物的生物合成目前
已形成一个初步的假说，即诱导子首先与细胞膜上
受体结合，引起膜的通透性、膜内离子分布等变化，
最终导致胞内基因启动、酶活性的改变，这一系列
反应是一个级联过程，需要有物质充当胞内信使，
也即第二信使，主要包括 NO、SA、以 H2O2 为中
心的活性氧（reactive oxygen species，ROS）、Ca2+
等信号分子。信号被传递到细胞内以后，通过控
制次生代谢途径中关键酶的基因表达来调节次生
代谢物的生物合成[20,24]。其中 NO 是近年来发现
的一种脂溶性可扩散小分子新型植物信号分子，在
植物生长发育及抗病防御反应等过程中发挥着重
要作用[25]。在植物细胞中存在着与哺乳动物类似
的 NOS 酶，由 NOS 催化形成的 NO 在植物体内具
有促进种子萌发、植株根和叶的生长发育以及诱发
植物防卫反应和防御基因活化等多种功能[26-28]。虽
然目前大量的研究表明，NO 是植物细胞在诱导子
等处理下普遍产生的一种生化反应，是介导病原物
和微生物诱导子诱发植物防卫反应所必需的信号分
子之一，但是目前对内生真菌诱导子处理下植物细
胞合成 NO 的机制还不是十分清楚[29]。研究表明，
NOS 是动物细胞中 NO 产生的主要途径。虽然到
目前为止还没有在植物中发现 NOS 基因，但是在
大豆、烟草等植物细胞中已经检测到与动物 NOS
类似的酶活性，利用动物 NOS 抑制剂也可以抑制
真菌诱导子对红豆杉等植物细胞 NO 产生的诱发
作用，从而进一步揭示 NOS 可能是植物产生 NO
的途径之一[30-32]。本实验结果表明，在内生真菌诱
导子胁迫下，通过诱发苍术细胞 NOS 活性，进而
产生 NO，所产生的 NO 是介导诱导子触发苍术中
ACC 活化和苍术素合成加强所必需的信号分子。此
外，内生真菌诱导子对苍术细胞中 NO 迸发的诱发
作用可以被哺乳动物 NOS 抑制剂 PBITU 抑制，说
明苍术细胞中可能也存在与动物类似的 NOS，而且
该酶参与了内生真菌诱导子对细胞中 NO 迸发的诱
导作用。虽然 BPTIU 能够完全抑制 NOS 酶活性，
然而却不能完全消除 NO 的形成，这说明 NOS 不是
内生真菌诱导子诱发苍术细胞中 NO 产生的惟一途
径，除了 NOS 途径外，诱导子还可能通过非 NOS
途径诱发苍术细胞中 NO 的合成与积累。已有研究
报道表明，烟草等植物除了可以通过 NOS 途径合
成 NO 外，还可以利用硝酸还原酶（NR）等非
NOS 酶促途径产生 NO[33]，植物组织中也存在光
介导的非酶促 NO 的产生形式[34-35]。内生真菌诱
导子是否也可以通过 NR 等非 NOS 酶促途径或者
通过非酶促方式诱发苍术细胞中 NO 产生仍需进
一步研究。
各种信号分子在参与介导外界因子诱发植物次
生代谢物生物合成的过程中并不是完全独立，而是
通过特定的应答（cross-talk）机制，形成复杂的相
互关系，最终以特定的信号转导通道或信号转导网
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络形式介导外界因子诱发次生代谢物的生物合成。
如 JA 和 SA 具有协同作用，共同促进银杏细胞中银
杏黄酮苷的积累[36]。在苍术细胞中，内生真菌诱导
子可以诱发 NO 迸发，SA 积累和苍术素的合成，且
NO 的迸发早于 SA 和苍术素的增加。NO 猝灭剂
cPITO 可以完全抑制内生真菌诱导子诱发 SA 的合
成，外源 SA 单独处理也可以促进苍术细胞中苍术
素的合成，这表明 NO 是对 SA 和苍术素生物合成
具有调控作用的上游信号分子，NO 依赖 SA 诱发苍
术素的生物合成，且在苍术细胞中 NO 可能通过 SA
信号途径介导了内生真菌诱导子对苍术细胞中苍术
素合成的促进作用。SA 合成酶抑制剂 AOPP 可完
全抑制 PAL 的活性，完全阻断 NO 诱发 SA 的合成，
但其不能抑制诱导子诱发 NO 的迸发，也不能完全
抑制 ACC 的活性和苍术素的合成，这说明在信号
分子 NO 和苍术素合成酶之间，苍术细胞中还存在
着其他信号分子或其他信号途径共同参与介导 NO
诱导苍术素的合成与积累。显然，后续研究需要进
一步考察其他信号分子是否参与了介导苍术素的生
物合成以及与 NO 和 SA 的相关应答机制，从而有
助于全面揭示内生真菌诱导子促进苍术素合成的信
号转导机制。
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