全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 17 期 2016 年 9 月

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独行菜磷酸甲羟戊酸激酶 LaPMK 基因克隆、生物信息学分析及原核表达
赵 乐 1, 2，马利刚 1, 2，杨方方 1，冯卫生 1, 2，郑晓珂 1, 2*
1. 河南中医学院药学院，河南 郑州 450046
2. 呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心，河南 郑州 450046
摘 要：目的 从独行菜 Lepidium apetalum 中克隆萜类合成途径关键酶磷酸甲羟戊酸激酶（phosphomevalonate kinase，PMK）
基因，进行序列分析和原核表达。方法 根据独行菜转录组数据中 LaPMK 基因序列设计特异性引物，克隆得到 LaPMK 基
因的开放阅读框（open reading frame，ORF），构建 pET32a-LaPMK 原核表达载体，在大肠杆菌 BL21（DE3）中用 IPTG 诱
导表达 LaPMK 融合蛋白。结果 LaPMK 基因 ORF 全长为 1 518 bp（Genbank 注册号 KT004541），编码 505 个氨基酸。生
物信息学分析结果显示 LaPMK 蛋白没有跨膜区，不含信号肽，位于细胞质中，含有 GHMP 激酶家族特异的 N 末端和 C 末
端的保守结构域。系统进化树结果显示 LaPMK 蛋白与芜菁的 PMK 蛋白具有 92%的序列相似性，亲缘关系较近。构建
pET32a-LaPMK 原核表达载体，在大肠杆菌中成功表达 LaPMK 融合蛋白。结论 克隆了 LaPMK 基因，建立其稳定的原核
表达体系，为 LaPMK 蛋白纯化、抗体的制备，进一步研究 LaPMK 基因在独行菜萜类合成途径中的作用奠定了基础。
关键词：独行菜；磷酸甲羟戊酸激酶；萜类合成；基因克隆；原核表达
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)17 - 3087 - 07
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.17.021
Cloning, bioinformatic analysis, and prokaryotic expression of LaPMK gene in
Lepidium apetalum
ZHAO Le1, 2, MA Li-gang1, 2, YANG Fang-fang1, FENG Wei-sheng1, 2, ZHENG Xiao-ke1, 2
1. School of Pharmacy, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China
2. Collaborative Innovation Center for Respiratory Disease Diagnosis and Treatment & Chinese Medicine Development of Henan
Province, Zhengzhou 450046, China
Abstract: Objective To obtain the key enzyme gene involved in terpenoid biosynthesis pathway, phosphomevalonate kinase (PMK)
gene was cloned from Lepidium apetalum, and sequence analysis and prokaryotic expression were performed. Methods Based on the
transcriptome data of L. apetalum, by designing specific primers of LaPMK gene, an open reading frame (ORF) of LaPMK gene was
isolated from L. apetalum. Escherichia coli BL21 (DE3) cells were transformed with the prokaryotic expression vector pET32a-
LaPMK and used for prokaryotic expression under IPTG induction. Results LaPMK gene has ORF of 1 518 bp (GenBank accession
number KT004541), which encoded a protein of 505 amino acid residues. Bioinformatic analysis indicated that LaPMK protein which
located in cytoplasm had no transmembrane domain and signal peptide, and exhibited the specific N-terminal domain and C-terminal
domain of GHMP kinase super family. Phylogenetic analysis indicated that LaPMK protein showed the highest homology, 92%
similarity, with PMK protein from Brassica rapa. The recombinant LaPMK protein was successfully expressed in E. coli BL21 (DE3)
cells. Conclusion The LaPMK gene is cloned from L. apetalum, and the stable prokaryotic expression system of pET32a-LaPMK is
constructed. This study will provide the fundamental information for the further purification and the antibody preparation of LaPMK
protein be helpful for the functional researches of LaPMK gene in terpenoid biosynthesis pathway.
Key words: Lepidium apetalum Willd.; phosphomevalonate kinase; terpenoid biosynthesis; gene cloning; prokaryotic expression

独行菜 Lepidium apetalum Willd. 为十字花科
（Cruciferae）独行菜属 Lepidium L. 植物，其成熟种
子为传统中药北葶苈子，具有泻肺平喘、利水消肿、
强心之功效，含有强心苷、黄酮、三萜、甾醇、香

收稿日期：2016-02-13
基金项目：国家重点基础研究发展计划“973 计划”项目（2013CB531802）；河南中医学院博士科研基金（BSJJ2011-07）
作者简介：赵 乐（1983—），男，博士，讲师，主要从事药用植物分子生物学研究。E-mail: zhaole1983@126.com
*通信作者 郑晓珂，女，博士，教授，博士生导师，主要从事中药活性成分及作用机制研究。E-mail: zhengxk.2006@163.com
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豆素、生物碱、酚酸、挥发油等多种成分，对心血
管、高血脂等疾病具有显著功效，具有降压、抗
癌、细胞毒、抗氧化等药理活性[1]。独行菜强心
苷类化学成分伊夫单苷[2]等，对其进行结构分析
可知属于植物甾醇（五环内酯），目前，对植物甾
醇和三萜类皂苷的生物合成途径已有初步认识，
从生物合成来源分析，植物甾醇与三萜类似，在
生物体内也是由鲨烯以不同方式环化而成，即通
过甲羟戊酸途径（MVA）衍生而来[3]。
MVA 途径存在于细胞质中，是植物萜类物质
合 成 的 主 要 途 径 。 磷 酸 甲 羟 戊 酸 激 酶
（phosphomevalonate kinase，PMK）是 GHMP 激酶
超家族中的一员[4]，是萜类化合物生物合成 MVA 途
径中的一个重要限速酶，在这个途径中有 3 个连续
依赖 ATP 的限速反应，其中 PMK 催化第 2 个限速
反应，其作用是将 ATP 上的 γ磷酸基团转移到甲羟
戊酸-5-磷酸（MVAP）上生成甲羟戊酸-5-二磷酸
（MVAPP），是控制整个代谢途径的关键酶之一[5-6]。
目前，关于植物中 PMK 基因的研究较少，杨恩泽
等[7]首次从药用植物阳春砂中克隆了 AvPMK 基因，
并使用生物信息学的方法初步分析了酶结构特点和
功能。对于哺乳类动物的 PMK 基因研究的较多，
如果 PMK 基因突变将可能致使哺乳动物产生甲羟
戊酸缺乏症（导致动物夭折），或产生半乳糖激酶缺
乏症（导致动物产生白内障）[8]。
在对本实验室前期获得的大量独行菜转录组数
据的分析中，发现多个参与 MVA 途径的基因，本
研究首次从独行菜中克隆了 PMK 基因（LaPMK）
的 cDNA 序列，进行生物信息学分析和原核表达，
为进一步研究 PMK 基因在独行菜萜类合成途径中
的作用奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
样品采自河南省伏牛山区，由河南中医学院董
诚明教授和谢小龙博士鉴定独行菜 Lepidium
apetalum Willd. 种子，种子采集后，种植于人工气
候培养箱中，光照强度为 3 000 lx，在 16 h、23 ℃
光照，8 h、20 ℃黑暗，70%相对湿度条件下培养。
种子萌发，长出 4 片真叶后，移至培养罐，每个培
养罐放置 4 颗幼苗，每隔 3 d 更换 1 次 Hoagland 营
养液，培养 60 d 的独行菜幼苗，取根、茎、叶，采
集后样品经液氮速冻，保存于−80 ℃超低温冰箱中
备用。本研究所用的实验材料为独行菜幼苗叶片。
1.2 试剂
植物总 RNA 提取试剂盒、质粒小提试剂盒、
PCR 产物纯化试剂盒购自北京天根生化科技公司；
TransScript II Reverse Transcriptase 、大肠杆菌
Escherichia coli DH5α感受态细胞和BL21感受态细
胞购自北京全式金生物技术公司；Ex Taq 酶、限制
性核酸内切酶、T4 DNA 连接酶、pMD19-T vector
购自 Takara 公司；引物由北京三博远志生物技术公
司合成。一般试剂均参照《分子克隆实验指南》配
制，所使用化学试剂均为分析纯试剂。
1.3 RNA 提取及 cDNA 合成
取 100 mg 独行菜幼苗的叶片，在液氮中研磨，
根据天根公司植物总 RNA 提取试剂盒说明书提取
独行菜叶片的总 RNA，用 NanoDrop 2000 和 1%琼
脂糖凝胶电泳检测 RNA 的量和完整性。用全式金
公司的 TransScript II Reverse Transcriptase 试剂盒反
转录合成 cDNA。
1.4 LaPMK 基因克隆
根据已获得的独行菜转录组数据，用 Primer 5
设计 LaPMK 基因的特异性引物，正向引物：
LaPMK-Exp-F（5’-CGGAATTCATGGCTGTAGTTG-
CT-3’，下划线部分为 EcoRI 酶切位点）；反向引物：
LaPMK-Exp-R（5’-CCCAAGCTTTTACTCGAGAC-
GAAT3’，下划线部分为 Hind III 酶切位点）。PCR
反应体系为 cDNA 模板 1 μL，LaPMK-Exp-F 1 μL，
LaPMK-Exp-R 1 μL，10×Ex Taq buffer 5 μL，2.5
mmol/L dNTP 4 μL，Ex Taq 酶 0.25 μL，加水至 50
μL。反应程序为 95 ℃预变性 2 min，然后进行 30
个循环：95 ℃变性 10 s，55 ℃退火 15 s，72 ℃延
伸 1 min 40 s，最后 72 ℃延伸 8 min。PCR 产物用
1%琼脂糖凝胶电泳检测分析，用 PCR 产物纯化
试剂盒纯化后与 pMD19-T vector 连接，转化大肠
杆菌 DH5α 感受态细胞，在氨苄抗性平板上进行
筛选，经菌液 PCR 和电泳检测后，挑选阳性克隆
送北京三博公司测序。
1.5 LaPMK 基因的生物信息学分析
LaPMK 基因编码的蛋白质使用 ExPASy
Protemics Server 提 供 的 在 线 工 具 ProtParam
（http://web.expasy.org/protparam/）预测其相对分子
质量与理论等电点（PI），使用 InterPro Scan
（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）进行蛋白的保守结
构域预测，使用 SWISS-MODEL（http://swissmodel.
expasy.org/）进行三维同源建模，使用 TargetP
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1.1Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）
分 析 蛋 白 质 亚 细 胞 定 位， SignalP 4.1 server
（http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/）分析蛋白
质信号肽，使用 TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/
services/TMHMM/）进行跨膜区预测。
将 LaPMK 基因编码蛋白质的氨基酸序列提
交到美国国立生物技术信息中心 NCBI 的蛋白质
序 列 数 据 库 进 行 BLASTP 搜 索 相 似 序 列
（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），从搜索结
果中选取与 LaPMK 基因编码的蛋白质相似性较
高的其他植物的蛋白质序列作为参考（包括模式
植物拟南芥、水稻、玉米，药用植物丹参、三七、
长春花等植物），使用 MEGA4 软件的相邻连接法
（neighbor-joining）构建系统进化树[9]。
1.6 LaPMK 原核表达载体的构建与诱导表达
用限制性内切酶EcoRI和HindIII分别对原核表达
载体 pET-32a (+) 和测序正确的 pMD19-T-LaPMK 质
粒进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶回收
载体片段和目的基因片段，T4 DNA 连接酶 16 ℃连
接过夜。将连接产物转化 E. coli BL21（DE3）感受
态细胞，在氨苄抗性平板上进行筛选，挑取单克隆，
经菌液 PCR 和双酶切鉴定后送北京三博公司测序。
将测序正确的单克隆，接种于含氨苄青霉素的 LB
液体培养基中，37 ℃培养过夜后，按照 1∶100 比
例稀释到含氨苄青霉素的 LB 液体培养基中，220
r/min 振荡培养至对数生长期[（600 nm 吸光度
（A600）至 0.6]，在 0.4 mmol/L IPTG，28 ℃，150 r/min
条件下培养8 h，诱导独行菜LaPMK重组蛋白的表达。
诱导完成后，用 SDS-PAGE 检测重组蛋白的表达。
2 结果与分析
2.1 LaPMK 的基因克隆
通过分析本实验室前期获得的独行菜转录组数
据，发现多个参与 MVA 途径的基因，其中有一个
注释为 PMK 的转录本，长度为 1 925 bp，利用 NCBI
ORF Finder 分析其含有一个完整的 ORF，根据该基
因开放阅读框（ORF）序列设计特异性引物
LaPMK-Exp-F 和 LaPMK-Exp-R，以独行菜叶片总
RNA 反转录得到的 cDNA 为模板，PCR 扩增得到 1
条 1 500 bp 左右的片段，电泳结果如图 1 所示，与
预期大小相符，进行测序后得到独行菜 LaPMK 基
因的编码序列，大小为 1 518 bp，编码 505 个氨基
酸（图 2），序列信息已经提交到 NCBI Genbank，
登录号为 KT004541。

M-Marker 1-LaPMK 基因 PCR 扩增产物
M-Marker 1-PCR product of LaPMK gene
图 1 PCR 扩增 LaPMK 基因
Fig. 1 PCR amplification of LaPMK gene
2.2 LaPMK 基因编码蛋白的生物信息学分析
LaPMK 基因预测编码 505 个氨基酸（图 2），
利 用 ExPASy Proteomics Server 的 在 线 工 具
Protparam 对其编码蛋白的理化性质进行预测分析。
推测分子式为 C2411H3840N650O742S20，相对分子质量
54 450，pI：5.49；正电残基（Arg＋Lys）：44，负
电残基（Asp＋Glu）：56。不稳定指数为 33.13，说
明 LaPMK 蛋白较稳定，亲水性总平均系数为
−0.073，说明 LaPMK 蛋白为亲水性蛋白。
利用 InterPro Protein 进行 LaPMK 蛋白的保守结
构域预测（图 3），结果显示 LaPMK 蛋白含有 5 种保
守结构域，分别在氨基酸序列的 1～495 位是磷酸甲
羟戊酸激酶（IPR016005）、2～259 位是核糖体蛋白
质-5S 区域（2 类型折叠，IPR020568）、2～109 和 157～
257 位是核糖体蛋白质-5S 区域（2 类型折叠小组）
（IPR014721）、179～250 位是 GHMP 激酶 N 端区域
（IPR006204）、397～467、295～350 与 391～484 位是
GHMP 激酶 C 端区域（IPR003750），含有 GHMP 激
酶家族特异的 N 末端和 C 末端的保守结构域。
SignalP 4.1 server 预测（图 4），LaPMK 蛋白不含
信号肽，为非分泌蛋白，TargetP 1.1 server 预测，显
示 LaPMK 蛋白可能定位于细胞质，TMHMM server
预测该蛋白不含跨膜域（图 5）。用 PredictProtein 对
LaPMK 蛋白的二级结构进行预测，结果显示在该蛋
白中 α-螺旋结构占 37.82%，β-折叠占 14.65%，无规
则卷曲占 47.52%。用 SWISS-MODEL 以哺乳动物甲
羟戊酸激酶蛋白（PDB ID：1kvk）为模板，预测 LaPMK
蛋白的三维结构，序列相似度为 20.4%，在第 3～495
位氨基酸建模，模型覆盖率 72%。从预测的三维模型
中可以看到LaPMK可能以二聚体形式发挥作用，ATP
结合位点位于 LaPMK 蛋白三维结构所形成的一个口
袋状结构中（图 6），推测 LaPMK 催化的底物磷酸化
反应可能在这个口袋状结构中进行[7]。
M 1
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
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黑色下划线：ATP 结合位点
ATP binding sites are underlined
图 2 LaPMK 基因 cDNA 编码区序列及氨基酸序列
Fig. 2 Coding sequence and amino acid sequence of LaPMK gene cDNA

图 3 LaPMK 基因的编码蛋白质保守结构域预测
Fig. 3 Prediction of conserved domain of LaPMK protein encoding by LaPMK gene
1
1
76
26
151
51
226
76
301
101
376
126
451
151
526
176
601
201
676
226
751
251
826
276
901
301
976
326
1 051
351
1 126
376
1 201
401
1 276
426
1 351
451
1 426
1 501
501
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图 4 LaPMK 基因的编码蛋白质信号肽预测分析 (SignalP
预测)
Fig. 4 Prediction of signal peptide of LaPMK protein
encoding by LaPMK gene (SignalP prediction)

图 5 LaPMK 基因的编码蛋白质的跨膜区预测结果
(TMHMM 预测)
Fig. 5 Prediction of transmembrane domains of LaPMK
protein encoding by LaPMK gene (TMHMM prediction)

图 6 LaPMK 蛋白三维结构预测
Fig. 6 Prediction of 3D structure of LaPMK protein
将 LaPMK 基因编码蛋白质的氨基酸序列提
交到 NCBI 的蛋白质序列数据库进行 BLASTP 搜
索，结果表明：LaPMK 与芜菁的 PMK 蛋白序列
相似性最高，达 92%。从 BLASTP 搜索结果中选
取与 LaPMK 基因编码的蛋白质相似性较高的 13
条蛋白质序列，绘制系统进化树（图 7）。可以看

图 7 LaPMK 蛋白与其他物种 PMK 蛋白的系统进化树分析
Fig. 7 Phylogenetic tree of LaPMK protein and PMK
proteins from other species
出 LaPMK 蛋白与芜菁 Brassica rapa Linn.、拟南芥
Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh. 和 亚 麻 芥
Camelina sativa (Linn.) Crantz 等十字花科植物的
PMK 蛋白处于同一分支上，亲缘关系较近，都属于
双子叶植物。
2.3 LaPMK 基因原核表达载体的构建
用限制性内切酶 EcoRI 和 HindIII 分别对原核
表 达 载 体 pET-32a (+) 和 测 序 正 确 的
pMD19-T-LaPMK 质粒进行双酶切，连接得到重组
质粒 pET32a-LaPMK，然后转化E. coli BL21（DE3），
挑取单克隆，进行双酶切鉴定，结果显示有 1 500 bp
左右的目的条带（图 8）。将酶切正确的单克隆送测
序公司测序，测序结果显示与目的基因 LaPMK 序
列一致，未发生移码突变，表明已成功将 LaPMK
基因克隆到原核表达载体 pET-32a 上。

M-Marker 1、2-EcoRI 和 HindIII 双酶切
M-Marker 1, 2-double digestion results by EcoRI and HindIII
图 8 原核表达载体 pET32a-LaPMK 的双酶切鉴定
Fig. 8 Identification of prokaryotic expression vector
pET32a-LaPMK with double digestion
1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0


C-得分
S-得分
Y-得分
0 10 20 30 40 50 60 70
位点/bp
得
分

1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
机
率
/%


0 100 200 300 400 500
transmembrane inside outside
口袋状结构
ATP
ATP
芜菁 Brassica rapa (XP 009108002.1)
拟南芥 Arabidopsis thaliana (NP 174473.1)
亚麻芥 Camelina sativa (XP 010499741.1)
独行菜 Lepidium apetalum LaPMK *
醉蝶花 Tarenaya hassleriana (XP 010518937.1)
长春花 Catharanthus roseus (ADR65112.1)
丹参 Salvia miltiorrhiza (AEZ55665.1)
葡萄 Vitis vinifera (XP 002275808.1)
人参 Panax ginseng (AGZ15314.1)
三七 Panax notoginseng (AIK21748.1)
玉米 Zea mays (NP 001266751.1)
水稻 Oryza brachyantha (XP 006651223.1)
0.02
M 1 2
1×104 bp
7×103 bp
4×103 bp
2×103 bp
1×103 bp
500 bp
250 bp

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2.4 LaPMK 蛋白的表达
将测序正确的重组质粒 pET32a-LaPMK 转化
E. coli BL21（DE3）后，用 IPTG 诱导 LaPMK 蛋白
表达。在 28 ℃、IPTG 终浓度为 0.4 mmol/L、150
r/min 的条件下，诱导表达 8 h 后，提取总蛋白进行
SDS-PAGE 分析（图 9），蛋白相对分子质量与预测
结果相一致，结果表明 LaPMK 基因编码的蛋白质
原核表达成功。下一步研究需要检测原核表达
LaPMK 蛋白的可溶性，通过优化表达条件（温度、
诱导时间、IPTG 浓度等），提高原核表达 LaPMK
蛋白的可溶性，为纯化 LaPMK 蛋白和检测目的蛋
白活性奠定基础，避免因诱导时间过长（24 h 以上）、
温度过高（35～37 ℃）等因素降低目的蛋白的可溶
性，形成包涵体[10]。

M-Marker C-含 pET32a 空载体的 E. coli 菌株 1、2-IPTG 诱导
的含 pET32a-LaPMK 质粒的 E. coli 菌株
M-Marker C-E. coli containing pET32a used as control 1, 2- E.
coli containing pET32a-LaPMK under IPTG induction
图 9 重组 LaPMK 蛋白 SDS-PAGE 电泳
Fig. 9 SDS-PAGE analysis on recombinant LaPMK protein
3 讨论
丹参酮、紫杉醇、人参皂苷等萜类化合物具有
重要的药用和经济价值，而关于独行菜中萜类物质
生物合成途径的报道较少。独行菜以干燥成熟的种
子入药，本研究从独行菜种子萌发后，长成幼苗的
叶片中克隆得到了 PMK 基因，该基因编码蛋白的
氨基酸序列与其他植物中MVA途径PMK蛋白的序
列同源性高，表明 LaPMK 为 MVA 途径的第 2 个限
速酶 PMK，也是控制整个 MVA 代谢途径的关键酶
之一[11]，独行菜 PMK 蛋白作为其萜类物质生物合
成途径的关键酶，具有重要的研究价值。有研究表
明在植物体内的MVA途径中的MK和 PMK基因表
达量较低，提高它们的表达量可以提高萜类在植物
中的产量，同时若 PMK 在植物体内过量表达，可
以增加类异戊二烯衍生物的量[12-13]。目前 PMK 基
因在植物研究中的报道较少，仅在药用植物阳春砂
中克隆了PMK基因和检测不同组织中PMK基因表
达差异，结果显示在叶中 PMK 基因表达量较高，
茎、根中表达量相对较低，推测叶片可能是阳春砂
中萜类的最主要合成部位[7]。
萜类化合物是植物次生代谢产物中最大的一个
家族，在生物体内有着重要的生理作用，而且广泛
应用于工农业生产和医药卫生中，但是萜类化合物
在生物体内的量很低，在植物体内的量往往只达到
百万分之一的水平，如何提高植物萜类产量一直是
个热门研究方向[14]。近年来随着萜类化合物生物合
成途径及其关键酶研究的深入，以分子生物学技术
为基础的合成生物学和代谢工程，成为提高植物体
内萜类化合物产量最有潜力的途径之一。所以，通
过构建 PMK 基因的植物表达载体并通过农杆菌介
导的遗传转化体系转化独行菜，对其进行遗传改良，
有希望提高转基因独行菜中萜类物质的量，进一步
培育高品质的独行菜新品种，具有重要的商业价值
和现实意义。本实验首次从独行菜中克隆了 PMK
基因，利用 pET32a 原核表达载体和大肠杆菌 BL21
（DE3）进行原核表达，大肠杆菌 BL21（DE3）菌
株可以增加细胞质中蛋白质二硫键的形成，使得蛋
白的可溶性更好，同时，利用 pET32a 载体表达的
重组蛋白 N 端带有 6 个 His Tag 标签，方便后续重
组蛋白的纯化 [15] 。通过构建原核表达载体
pET32a-LaPMK，转入大肠杆菌 BL21（DE3），成
功诱导表达出 LaPMK 蛋白，并且目的蛋白表达量
较高，为下一步纯化 LaPMK 蛋白进行蛋白质结构
和生物学功能研究奠定了基础。该研究将有助于深
入认识独行菜萜类化合物生物合成途径及其调控机
制，也为独行菜萜类代谢工程提供候选基因。
参考文献
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M C 1 2
2.5×105
1.3×105
1.0×105
7.0×104
5.5×104
3.5×104
2.5×104
1.5×104

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