全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 12 期 2016 年 6 月

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基于 ARISA 指纹图谱技术的浑源黄芪根际微生物菌群特征剖析
孙海峰 1，康宝玲 2，高彦云 1, 2，郭兰萍 3*，秦雪梅 2
1. 山西大学化学化工学院，山西 太原 030006
2. 山西大学 中医药现代研究中心，山西 太原 030006
3. 中国中医科学院中药资源中心，道地药材国家重点实验室培育基地，北京 100700
摘 要：目的 剖析浑源黄芪根际微生物菌群结构特征，为研究道地黄芪品质形成提供科学依据。方法 采用核糖体内转录
间隔序列法（Automated ribosomal intergenic spacer analysis，ARISA）建立微生物菌群指纹图谱，分别用软件 GeneMarker 2.2.0
和 PAST 对获得的原始图谱进行加工处理与分析。结果 与非根际土相比，种植 2～3 年的浑源黄芪根际微生物菌群结构发
生了明显改变，主要表现为相似度降低和多样性增加；种植 5 年的微生物菌群结构与非根际菌群间相似度无显著差异，多样
性趋于一致。与其他产地相比，浑源黄芪核心群体分类操作单元（OTUs）数较低，但相对丰富度较高。结论 浑源黄芪根
际微生物菌群结构与种植年限有关，且明显不同于其他产地。
关键词：道地药材；浑源黄芪；根际微生物；ARISA 指纹图谱；菌群结构
中图分类号：R282.1 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)12 - 2157 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.12.024
Characterization of rhizospheric microbial flora of Hunyuan Astragali Mongolici
Radix by ARISA fingerprinting
SUN Hai-feng1, KANG Bao-ling2, GAO Yan-yun1, 2, GUO Lan-ping3, QIN Xue-mei2
1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Shanxi University, Taiyuan 030006, China
2. Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, Shanxi University, Taiyuan 030006, China
3. State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs, National Resource Center of Chinese Materia Medica, China Academy of
Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China
Abstract: Objective To characterize rhizospheric microbial flora of Hunyuan Astragali Mongolici Radix (HAMR) and to provide
scientific evidence for understanding quality formation of the herb. Methods The soil microbial flora were fingerprinted by
automated ribosomal intergenic-spacer analysis (ARISA). The raw data were processed and analyzed by GeneMarker and PAST,
respectively. Results Compared with non-rhizospheric soil flora, the rhizospheric flora from 2- and 3-year-old herbs shifted
obviously, and the similarities were decreased but diversities increased. Meanwhile, the flora from 5-year-old herbs had no significant
similarity difference to non-rhizospheric ones and their sample rare fraction curves were more consistent with each other. When
compared to the ones from other production areas, the flora from HAMR had relatively lower core OTUs but had significantly higher
abundance of core OTUs shared by all areas. Conclusion The structure of rhizospheric microbial flora of HAMR is associated with
the herb’s age and is quite different from thoes from other areas.
Key words: Genuine medicinal materials; Hunyuan Astragali Mongolici Radix; rhizospheric microorganisms; ARISA fingerprinting; flora structure

道地药材是人们传统公认的、生长在特定生境
下的优质中药材的总称，在来源上具有强烈的地域
性，往往分布在狭小的区域，或虽分布较广，但只
有某些狭小生境区域内所产的药材质量最好，疗效
最佳。换言之，特定的生态环境是构成道地药材最
重要的外在因素[1]。作为根表面土壤微域的重要成
员，道地药材根际微生物菌群受产地气候、土壤特
性等环境因素影响，通过与宿主相互作用，影响着

收稿日期：2015-09-23
基金项目：教育部第 48 批“留学回国人员科研启动基金”；山西省回国留学人员科研资助项目（2013-021）；山西省科技厅基础研究面上项目
（2014011047-3）；第 56 批中国博士后科学基金面上项目（2014M560170）
作者简介：孙海峰（1972—），女，山西汾阳人，博士，主要从事中药质量评价与品质形成研究。Tel: (0351)7019178 E-mail: haifeng@sxu.edu.cn
*通信作者 郭兰萍，宁夏人，研究员，主要从事中药资源与生态研究。Tel: (010)64011964 E-mail: glp01@126.com
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道地药材品质的形成[2]。江曙等[3]发现岷当归根际
微生态种群结构较云南和四川等产区稳定，多样性
指数和丰富度指数最高；潘惠霞等[4]发现道地药材
人工种植伊犁贝母根际真菌数量与西贝素量极显著
正相关。因此，研究道地药材根际微生物对于其品
质形成研究具有重要意义。
黄芪原名黄耆，始载于《神农本草经》，列为上
品。针对黄芪产地的考证发现，在唐、宋、元、明
等朝代，黄芪的产地有甘肃、四川、陕西和山西，
其中以山西绵上所产者为道地[5]。民国名医曹炳章
《增订伪药条辨》进一步明确“山西太原府里陵地方
出者，名上芪……最为道地”。现代化学研究亦表明，
山西浑源、应县境内恒山山脉所产黄芪即浑源黄芪
（Hunyuan Astragali Mongolici Radix，HAMR）品质
最佳[6]。目前，研究者已从种植方式、产地海拔和
经纬度、气候、土壤营养和微量元素等角度对浑源
黄芪品质形成进行了研究[7-10]。但是，浑源黄芪产
地微生物菌群特征目前并不清楚。
核糖体内转录间隔序列法（automated ribosomal
intergenic spacer analysis，ARISA），由美国学者 Fisher
和 Triplett 于 1999 年提出[11]。该方法以荧光标记引
物扩增微生物群体基因组 DNA 中的 16 S～23 S
rRNA 间 隔 区 ， 再 通 过 毛 细 管 电 泳 法 分 析
ARISA-PCR 产物大小和对应的荧光强度，并假设每
一片段大小对应于一群体分类操作单元（operational
taxonomic unit，OTU），获得菌群组成和相对丰富度
信息，用于菌群结构分析。目前，该方法已成功地
应用于淡水、鳃、瘤胃、土壤等环境微生物菌群结
构分析，是多数研究者认可的一种快速、高效、可
以衔接宏基因组测序等技术的环境微生物分析方
法[12-14]。孙海峰等[15]亦采用该方法成功地分析了丁
桂儿脐贴辅助治疗儿童腹泻对肠道菌群的影响。本
实验即采用该方法，以黄芪根围 5 cm 处和根表面土
为实验材料，以非根际土和其他产地黄芪根围土为
对照，对浑源黄芪根际微生物的菌群特征进行剖析。
以期阐述浑源黄芪根际菌群组成特征，并找出代表
性样本，为下一步采用宏基因组技术研究黄芪根际
微生物组成及其功能基因表达奠定基础。
1 材料和方法
1.1 样本收集
采样点位于山西浑源县千佛岭乡泽青岭黄芪种
植基地，分别于 2012、2013 年 10 月上旬采集。其
中非根际土取自距黄芪 50 cm 远、10～20 cm 深处
土壤，根围土取自距黄芪根 5 cm 远、10～20 cm 深
处，涉及的种植年限有 2、3 和 5 年。根表土采自 2、
3、5 年生黄芪，抖落法收集。
甘肃陇西和黑龙江加格达奇塔河样本分别采自
2013 年 10 月，前者采自种植 2 年的黄芪根围，后
者采自野生膜荚黄芪根围。取样方法同上。采集后，
所有样本于室温条件下送回实验室，液氮冷冻后置
于−80 ℃保存。
1.2 ARISA 指纹图谱构建与数据分析
1.2.1 基因组 DNA 的提取与纯化 参照文献报道[16]，
球磨法提取土壤微生物基因组 DNA。参照文献报
道[17]，用 Sephadex G-200（GE，美国）小柱去除基
因组 DNA 中的腐殖酸。0.8%琼脂糖凝胶电泳检测
DNA 完整性，Nanodrop 2000 分光光度计（Thermo，
美国）测定含量，无菌水稀释至 20 ng/μL，−20 ℃
保存，作为 PCR 反应用模板。
1.2.2 ARISA 指纹图谱构建、原始数据加工与分析
除模板 DNA 用量为 20 ng 外，ARISA 指纹图谱构
建用引物序列、荧光素标记及 PCR 反应体系和反应
条件，ARISA 图谱数据加工及后续数据分析方法同
文献[15]。简言之，用 GeneMarker2.2.0（Soft Genetics，
美国）进行 ARISA 指纹图谱加工，将图谱信息转
换成 OTUs 组成（由不同大小的 DNA 片段表示）
和相对丰富度数据，并导入 Excel 中。用软件包
Paleontological statistics（PAST）对 Excel 表中的数
据进行分析，获得菌群结构信息。
2 结果与分析
2.1 浑源黄芪根围土微生物菌群结构分析
根际范围的划分，在学术界颇受争议，一般指
植物根与土界面不足 1 mm 到几毫米范围的微区土
壤，但林木研究是在根际附近较大区域展开的[18]。
此外，植物根释放出的挥发性有机化合物（volatile
organic compounds，VOCs）易于扩散至更大的土壤
微域，进而影响更大范围内的土壤栖息者[19]。由于
黄芪根中含有多种抑制微生物生长的 VOCs[20-21]，
所以本研究除采集根表土外，还采集了距离根 5 cm
处的根围土，以较为全面地考察浑源黄芪根际微生
物菌群特征。以非根际菌群为对照，根围菌群布雷
柯蒂斯相似性数据（Bray-Curtis index）聚类结果见
图 1。从图 1 可以看出，浑源黄芪根围菌群与非根
际土明显分开，提示浑源黄芪生长导致其根围 5 cm
处土壤微生物菌群迁移，菌群结构发生了改变。相
比较而言，根围菌群样本较分散，提示黄芪生长可
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图 1 浑源黄芪近根际土样本聚类分析图
Fig. 1 Non-metric multidimensional scaling plot of bulk
and surrounding soils of HAMR
能导致根围微生物菌群相似度减少。Bray-Curtis 相
似度分析结果表明，非根际菌群相似度为 0.514 6±
0.113 1，根围菌群相似度为 0.492 3±0.126 9，二者
差异显著（P＜0.000 1），即浑源黄芪生长的确导致
根围菌群相似度下降。
除菌群相似性外，黄芪生长是否还影响着根
围菌群的多样性，针对此问题，采用样本稀释曲
线法（sample rarefraction）分析了黄芪根围菌群
的多样性，结果见图 2。就个体而言，根围菌群
多样性均高于非根际菌群（对照），提示黄芪生长
导致根围菌群多样性增加。就多样性曲线总体趋
势而言，随着样本数的增加，根围菌群多样性曲
线趋向于与非根际样本曲线重合，提示两类型菌
群组成相近，浑源黄芪生长对根围菌群组成影响
较小。换言之，黄芪生长对根围菌群的影响主要
体现在菌群的相似度上。
2.2 浑源黄芪根表土微生物菌群结构分析
采用根围菌群相同类型的数据，以非根际菌群


图 2 黄芪根围土 OTUs 数量分析
Fig. 2 Analysis on OTUs numbers in surrounding soils of
HAMR
为对照，不同种植年限的浑源黄芪根表菌群聚类分析
结果见图 3。相对于非根际样本而言，2～3 年生根表
土样本较为分散，菌群发生了明显迁移；而种植 5 年
的根表土样本较为集中，与非根际样本距离较近，即
种植5年的浑源黄芪根表土微生物菌群相似度与非根
际菌群更为接近。由此可见，浑源黄芪根表微生物菌
群结构与药材的种植年限有关，随种植年限的延长，
浑源黄芪生长对根表菌群迁移的影响逐渐减弱，根表
菌群有逐渐恢复至非根际菌群结构的趋势。


图 3 不同种植年限浑源黄芪根表土聚类分析
Fig. 3 Non-metric multidimensional scaling plot of surface
soil specimens of different ages of HAMR
为了定量描述不同种植年限浑源黄芪根表土微
生物菌群结构的迁移特征，采用 One-way ANOSIM
对上述种植年限根表菌群与非根际菌群相似性差异
显著性进行了分析。结果表明，除种植 5 年的浑源
黄芪根表菌群外，种植 2、3 年的根表微生物菌群明
显不同于非根际菌群，具有显著性差异，P 值分别
为 0.011 6、0.010 2。上述种植年限的浑源黄芪根表
土与非根际土微生物菌群的相似度分别为 0.450 5±
0.104 4、0.480 5±0.083 3、0.545 7±0.097 5，即 2
年生相似度最小、5 年生相似度最高。因此，就菌
群相似度而言，多年生浑源黄芪根表土微生物菌群
的确具有逐渐恢复至非根际菌群结构的特性。
不同种植年限浑源黄芪根表土微生物菌群样本
稀释曲线见图 4。从图 4 可以看出，种植 3 年的菌
群多样性最高，种植 2 年的菌群多样性较非根际低，
但随着样本数的增加，其稀释曲线有高于非根际稀
释曲线的趋势。从稀释曲线图趋势来看，2 年生和 3
年生菌群随样本数增加的变化趋势较为一致，较非
根际稀释曲线高。相比较而言，种植 5 年的浑源黄
芪根表土稀释曲线低于非根际曲线，但随着样本数
根围
对照 0.24
0.16
0.08
−0.08
−0.16
−0.24
−0.32
−0.40
−0.24 −0.16 −0.08 0.08 0.16 0.24 0.32
相
关
系
数
2

相关系数 1
根围
对照
2 4 6 8 10
样本数
O
TU
s数

300
250
200
150
100
−0.40 −0.32 −0.24 −0.16 −0.08 0.08 0.16 0.24
0.16
0.12
0.08
0.04
−0.04
−0.08
−0.12
−0.16
−0.20
对照
2 年生根表土
3 年生根表土
5 年生根表土
相
关
系
数
2

相关系数 1
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图 4 不同种植年限黄芪根表土 OTUs 数量分析
Fig. 4 Analysis on OTUs numbers in surface soils of HAMR
with different ages
的增加，该曲线趋向于与非根际曲线重合，即种植
5 年的浑源黄芪根表土微生物多样性趋向于种植前
的土壤微生物菌群状态。综上所述，浑源黄芪种植
2～3 年内对其根表土微生物菌群结构的影响较大，
随种植年限的延长，影响变小，并趋向于与非根际
土壤微生物菌群结构一致。
2.3 浑源黄芪与其他产地黄芪根围土微生物菌群
特征分析
针对浑源黄芪根围菌群多样性分析结果表
明，只要样本数量足够多，同一产地根围菌群组
成与非根际菌群趋于一致。因此，本课题组比较
了实验室现有山西浑源、甘肃陇西和黑龙江塔河
黄芪根围土样本微生物菌群多样性，以进一步了
解浑源黄芪根际微生物的菌群特征，有关结果见
图 5。从图 5 可以看出，浑源黄芪根围土菌群多
样性较甘肃陇西和黑龙江塔河的低，但变化趋势
与黑龙江塔河基本一致。此外，就样本个体而言，
虽然甘肃黄芪根围微生物多样性较山西黄芪的
高，但整体增加趋势较缓，随着样本数的增加，
山西浑源黄芪总体多样性将高于甘肃陇西黄芪。



图 5 不同产地黄芪根围土 OTUs 数量分析
Fig. 5 Analysis on OTUs numbers of surrounding soils of
Astragali Mongolici Radix from different production areas
在适应产地生态环境的过程中，宿主植物根际
微域逐渐形成其特有的核心微生物组（Core
microbiota），并通过与宿主植物的相互作用，影响
着宿主的营养、健康和防御应答。ARISA 指纹图谱
中，假定每个片段长度对应于 1 个独立的 OTU，因
此，同一样本群共有 OTUs 即可以认为是该样本群
的核心 OTUs。以同一产地样本中检出概率大于
60%作为标准，对 3 个产地黄芪根围共享及独有的
核心 OTUs 数量进行了统计，结果见图 6。从图 6
可以看出，无论是与其他产地共享 OTUs 数，还是
产地独有 OTUs 数，山西浑源的数值均最低，甘肃
陇西最高。


图 6 不同产地样本共享及独有的核心 OTUs 数量分析
Fig. 6 Analysis on shared and unique core OTUs of soil
specimens from different regions
在 3 产地共享的 42 个核心 OTUs 中，片段长度
为 459、597、617、619、659、661 bp 的 OTUs 在
各产地样本中的检出概率为 100%，属上述产地黄
芪根围的优势菌。为了进一步考察产地的影响，对
上述 6 个共享 OTUs 在各个产地样本中的相对丰富
度进行了分析。除片段长度为 597和 517 bp的OTUs
相对丰富度在 3 产地样本间无显著差异外，其余核
心 OTUs 结果见图 7。从图 7 可以看出，上述 OTUs
在山西浑源样本中的相对丰富度明显高于黑龙江塔
河样本。此外，甘肃陇西样本中片段长度为 659 bp
的 OTU 相对丰富度亦明显低于山西浑源样本。
3 讨论
在黄芩中，随着种植年限的延长，根表土微生
物总数趋于增加，而多样性和均匀度趋于减少[22]。
在大蒜中，种植 15 年的近根区土壤细菌数量最少，
2 年最多，且随着种植年限的延长，菌群相似性和
均匀性持续下降[23]。连作 2 年的地黄根际土壤细菌
种群多样性降低，并显著低于 1 年土壤；设施栽培
芦笋根际土壤细菌多样性和丰富度指数均随种植年
对照
2 年生
3 年生
5 年生
O
TU
s数

350
250
150
50 1 3 5 7 9 11
样本数
300
200
100 2 4 6 8
样本数
黑龙江塔河
甘肃陇西
山西浑源
O
TU
s数

山西浑源
5

11 10
42
甘肃陇西 黑龙江塔河
51
38 24
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不同的字母代表具显著性差异，P＜0.05
Different letters represent significant difference (P < 0.05)
图 7 不同产地黄芪根围核心 OTUs 相对丰富度分析
Fig. 7 Relative abundance of core OTUs in surrounding soils collected from different areas
限的延长而减小[24-25]。本研究中，种植 2～3 年的浑
源黄芪根表土菌群多样性增加、相似度减小，而种
植 5 年的根表土多样性减少、相似度增加，且趋向
于与非根际土一致。提示随种植年限延长，浑源黄
芪根表土菌群具有恢复至非根际菌群的趋势。产地
实地调研亦发现，多年生浑源黄芪不存在连作障碍
的问题。概言之，浑源黄芪根际微生物既有与其他
药用植物相同之处，也有不同的地方。具体而言，
种植年限较短时，根际菌群结构均发生变化；但随
着种植年限的延长，浑源黄芪根际菌群具有逐渐恢
复至非根际菌群状态的特性，而上述研究涉及的其
他药用植物无此特性。
岷当归属当归道地药材，其根际微生态种群结
构较云南和四川等产区稳定，多样性指数和丰富度
指数最高[3]。与其他产地黄芪相比，浑源黄芪根围
土多样性和核心 OTUs 数均较低，但核心 OTUs 相
对丰富度明显高于其他产地。一方面说明，浑源黄
芪根围土微生物菌群特征不同于其他产地黄芪，同
时亦说明道地药材根际微生物菌群特征与道地药材
品种有关，根际微生物很可能参与了道地药材的品
质形成。为了探究不同的道地药材品质形成，很有
必要研究其根际微生物。
目前在生产中，黄芪采收年限一般为种植 2～3
年。本研究发现，2～3 年生浑源黄芪根际微生物菌
群结构迁移明显，根际菌群微生态系统未恢复至种
植前即非根际菌群状态，而种植 5 年的浑源黄芪根
际菌群与非根际菌群相似度接近，二者无显著差异。
基于此，建议在黄芪人工种植中，应该尽量延长其
种植年限，至少达到 4 年以后再采挖，以保证根际
微生物菌群结构的稳定，有利于采挖后土壤微生态
系统的恢复。
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459 bp 619 bp
25
20
15
10
5
0
8
6
4
2
0
山西浑源 甘肃陇西 黑龙江塔河 山西浑源 甘肃陇西 黑龙江塔河
a
a
ab
b
b
b
b






b
ab
ab
a

a
659 bp 661 bp
山西浑源 甘肃陇西 黑龙江塔河 山西浑源 甘肃陇西 黑龙江塔河
4
3
2
1
0
15
10
5
0
相
对
丰
富
度
/%

相
对
丰
富
度
/%

相
对
丰
富
度
/%

相
对
丰
富
度
/%

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