全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 18 期 2014 年 9 月

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三七 3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶 A 还原酶基因的克隆和生物信息学分析
张 萍，刘迪秋，葛 锋*，赵恒伟
昆明理工大学生命科学与技术学院，云南 昆明 650500
摘 要：目的 克隆三七总皂苷甲羟戊酸合成途径中的 1 个关键酶 3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶 A 还原酶（3-hydroxy-3-
methylglutaryl coenzyme-A reductase，HMGR）基因，为进一步研究 HMGR 蛋白的功能及开展三七皂苷的合成生物学研究奠
定基础。方法 根据 NCBI 上已公布的同属人参的 HMGR 基因全长序列（登录号 GU565097.1）设计特异性引物。利用 RT-PCR
技术，以三七愈伤组织总 RNA 反转录的 cDNA 为模板扩增基因片段；并对其编码的蛋白进行生物信息学预测和基因表达分
析。结果 序列分析表明，获得的三七 HMGR（命名为 PnHMGR）基因的 cDNA 序列大小为 1 893 bp，该序列与人参、刺
五加和杜仲中 HMGR 基因的一致性分别达到 98%、93%、80%，且含有大小为 1 725 bp 的开放阅读框，经 Genbank 查询为
一新的 cDNA。生物信息学预测 PnHMGR 基因编码蛋白包含 2 个跨膜区，不含信号肽，具有 HMGR 催化作用的活性中心结
构域。实时荧光定量 PCR 检测到 PnHMGR 基因在三七细胞生长 30 d 表达量最高。结论 首次从药用植物三七中克隆得到
HMGR 基因的编码区序列，为进一步鉴定 PnHMGR 的功能和开展三七皂苷的合成生物学研究奠定了基础。
关键词：三七；三七总皂苷；3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶 A 还原酶（HMGR）；基因克隆；生物信息学
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)18 - 2684 - 07
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.18.021
Cloning and bioinformatic analysis of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme-A
reductase gene from Panax notoginseng
ZHANG Ping, LIU Di-qiu, GE Feng, ZHAO Heng-wei
Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China
Abstract: Objective Panax notoginseng is an important medicinal plant and its secondary metabolites, P. notoginseng saponins
(PNS), synthesized by the mevalonate pathway are the active ingredients. The study on the gene of the key enzyme 3-hydroxy-3-
methylglutaryl-coenzyme-A reductases (HMGR) in the mevalonate pathway is helpful for the regulation of PNS syntheses. Methods
The primers were designed according to P. ginseng HMGR (accession number: GU565097.1) from NCBI. Total RNA was extracted
from the callus of P. notoginseng. The fragment of HMGR gene was amplified by reverse transcription PCR technology and analyzed.
Results Sequence analysis showed that the cDNA sequence of obtained fragment (PnHMGR) was 1 893 bp, containing an ORF
spaning 1 725 bp, and exhibited 98%, 93%, and 80% sequence identity with HMGR in P. ginseng, Eleutherococcus senticosus, and
Eucommia ulmoides. The cDNA was a new one as searching in the Genbank. The bioinformatic analysis showed that
PnHMGR-encoding protein contained two transmembrane regions and the HMGR catalytic domain, without signal peptide. The
expression level of PnHMGR was the highest when the callus of P. notoginseng has grown for 30 d. Conclusion It is the first time to
report HMGR gene isolated from P. notoginseng. The results will provide a groundwork for exploring the molecular function of
PnHMGR involved in PNS biosynthesis based on the synthetic biology of P. notoginseng.
Key words: Panax notoginseng (Burk) F. H. Chen; P. notoginseng saponins; 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme-A reductase
(HMGR); gene cloning; bioinformatics

三七 Panax notoginseng (Burk) F. H. Chen 又名
田七、人参三七、金不换等，为五加科人参属多年
生草本植物，是我国特有的药食两用的名贵中药材。
其味甘、微苦、性温，归肝、胃、小肠经，具有散
瘀、止血、消肿、止痛等功效，可用于治疗糖尿
病、冠心病、心绞痛、血栓等，三七总皂苷（Panax

收稿日期：2014-03-24
基金项目：国家自然科学基金资助项目（31260070，31060044）
作者简介：张 萍，女，硕士在读，研究方向为生物技术制药。Tel: 18826731619 E-mail: zhangping861022@126.com
*通信作者 葛 锋，男，博士，教授，硕士生导师，主要从事生物技术制药。Tel: (0871)65920621 E-mail: gefeng@tsinghua.org.cn
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notoginseng saponins，PNS）为其主要活性成分[1]。现
代化学和药理学研究发现，PNS在血液和造血系统、
心脑血管系统、神经系统、免疫系统、泌尿系统、
物质代谢、抗衰老、抗氧化、抗肿瘤等方面均有较
好的生理活性[2-3]。
迄今为止已经从三七组织中分离鉴定出 70 余
种三萜类皂苷，它们均属于达玛烷型四环三萜类。
研究发现，植物萜类化合物其生物合成有 2 条途径：
位于质体中的 2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）
途径和位于细胞质中的甲羟戊酸（MVA）途径，这
2 条途径产生萜类物质的共同前体为异戊烯基焦磷
酸（IPP），再由它生成各种萜类化合物[4-5]。普遍认
为，MVA 途径为三七皂苷的主要生物合成途径。而
3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶 A 还原酶（HMGR）
是植物 MVA 途径中的第 1 个关键酶，连同 NADPH
催化 3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶 A 生成甲羟戊
酸，该反应是一个不可逆的过程，也是萜类合成过
程中的重要调控点[6]。
鉴于 HMGR 基因在萜类物质生物合成中的关
键作用，目前已从西洋参[7]、人参[8]、刺五加[9]、
球药隔重楼 [10]和丹参 [11]等多种药用植物中克隆
到相应的 HMGR 基因或者基因片段。三七作为传
统中药材，目前国内外尚未见到有关其 HMGR 基
因的研究报道。本实验室首次克隆出三七 HMGR
基因（命名为 PnHMGR 基因）的编码区序列，并
对其编码的蛋白进行生物信息学预测。利用实时
荧光定量 PCR检测该基因在三七愈伤组织不同生
长阶段的表达量。其结果对于在分子水平实现
PNS 生物合成的定向调节具有重要意义，对进一
步研究药用植物中萜类次生代谢产物合成机制具
有参考价值。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
植物材料三七愈伤组织为本实验室保存的细胞
株，该愈伤组织由三七子叶诱导。大肠杆菌 DH5α
感受态购于北京全式金生物科技有限公司。M-MVL
逆转录试剂盒、pGEM-T easy 载体购自 Promega 公
司。高保真 DNA 聚合酶、dNTPs、Taq DNA 聚合
酶均购于 TaKaRa 公司。SanPrep 柱式 DNA 胶回收
试剂盒和SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒购
于上海生工生物工程有限公司。本研究所用引物及
相关测序均由上海生工生物工程有限公司完成。其
他试剂均为国产或进口分析纯。
1.2 方法
1.2.1 RNA的提取和 cDNA的合成 取新鲜的三
七愈伤组织 0.2 g，在液氮中研磨成粉，采用改良
的异硫氰酸胍法提取三七总 RNA[12]。利用紫外分
光光度计进行纯度和浓度测定，1.2%的琼脂糖电
泳检测 RNA 完整性。取一定量提取的三七总
RNA，以 Oligo(dT)15 为引物，按照 M-MLV 逆转
录酶说明书反转录成第一链 cDNA，将产物置于
−20 ℃保存备用。
1.2.2 PnHMGR 基因 cDNA 的扩增和测序 根据
GenBank 中报道的人参 HMGR 基因全长序列（登录
号 GU565097.1）设计特异性引物（表 1）。以三七
cDNA 为模板，按照以下体系对三七的 PnHMGR 基
因进行扩增：cDNA 3.0 μL，ex Taq 酶 0.5 μL，10
μmol/L 上下游引物各 0.5 μL，dNTPs 4 μL，10×缓
冲液 5.0 μL，ddH2O 36.5 μL，终体积为 50.0 μL。
反应程序：95 ℃预变性 5 min；然后进行 30 个循环：
95 ℃、30 s，53 ℃、30 s，72 ℃、2 min；循环结束
后 72 ℃、10 min 延伸反应，16 ℃保温。1%琼脂糖
凝胶电泳检测 PCR 产物，对扩增所得目的片段进行
切胶回收。
表 1 PnHMGR 基因克隆和荧光定量分析的引物序列
Table 1 Primers for PnHMGR gene cloning and real-time
PCR analysis
目标引物 引物序列 (5’ →3’)
基因克隆 正向 CCGCCGGAATATCCAATTCCATG
反向 CACAATTTGCCAAACTTTACAGC
RT-PCR 正向 ACTCACCGCCATTGTCTCCCTTAT
反向 ACCACGGATTTCACGATTTCTTCG
18 S rRNA 正向 AACCATAAACGATGCCGACCAG
反向 TTCAGCCTTGCGACCATACTCC

将回收产物与 pGEM-T easy 载体连接，转化大
肠杆菌 DH5α 菌株，在含有氨苄青霉素抗性的 LB
平板上进行培养，挑取单克隆经菌落 PCR 扩增和电
泳检测后选择阳性克隆送上海生工生物工程有限公
司测序。利用 Blast 对测序结果进行分析。
1.2.3 PnHMGR 的生物信息学分析 利用
GenBank “ORF finder”查找所获得基因序列的开
放阅读框（open reading frame，ORF，http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）。PnHMGR 基因编
码蛋白的理化性质预测采用 ExPASy Proteomics
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Server 提供的在线工具 Protparam（http://www.
expasy.ch/tools/protparam.html）进行分析。利用在
线工具 Interpro 数据库（http://www.ebi.ac. uk/inter-
pro/）对 PnHMGR 蛋白结构域进行分析。采用
SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）进
行蛋白质二级结构分析和三维建模。利用在线软件
TMHMM Server，v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/
services/TMHMM/）预测 PnHMGR 蛋白的跨膜区。
分 泌 蛋 白 预 测 使 用 SignalP 4.1 Server
（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）。WOLFP-
SORT（http://wolfpsort.org/）用于 PnHMGR 蛋白的
定位信号预测。氨基酸序列相似性通过 NCBI
（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的蛋白质序列数据库
进行，并利用 DNAMAN 软件进行氨基酸多重序列
比对。通过 MEGA 5.1 构建 Neighbor-joining 系统进
化树。其他序列资料来源于 NCBI 蛋白质数据库中
已注册的 HMGR 信息。
1.2.4 实时荧光定量 PCR 为了检测 PnHMGR
基因在三七愈伤组织不同生长阶段的表达情况，
采用实时荧光定量 PCR 方法检测该基因在三七
愈伤组织不同生长阶段的表达量。选取生长状态
较好的愈伤组织，从其生长到 10 d 开始，每隔
10 天取 1 次样，液氮速冻，−80 ℃保存。到第
50 天时进行最后 1 次取样。实时荧光定量 PCR
检测的反应体系如下：cDNA 1.0 μL，Go Taq®
qPCR Master Mix（2×）25 μL，10 μmol/L 上下
游引物各 0.2 μL，加无核酸酶纯水补齐至体积为
50.0 μL。每个反应重复 3 次。扩增程序如下：热
启动 95 ℃、2 min；然后进行 40 个循环：95 ℃、
15 s，60 ℃、1 min。该反应以 18 S rRNA 基因为
内参，以第 10 天时细胞中 PnHMGR 的表达量为
对照。
1.2.5 三七愈伤组织 PNS 的测定 利用香草醛-冰
醋酸、高氯酸显色法测定三七愈伤组织中 PNS 的
量。选取生长状态较好的愈伤组织，从其生长到 10
d 开始，每隔 10 天取 1 次样，到第 50 天结束。每
个时间点共设置 3 次重复实验，每次重复实验取样
量为 7 g，显色完成后在波长 550 nm 下测其吸光度
值。根据标准曲线计算皂苷量（C），由 C×稀释倍
数/愈伤组织样品干质量计算出 PNS 量。
2 结果与分析
2.1 三七总 RNA 的提取
通过琼脂糖凝胶电泳检测三七总 RNA（图 1）：

图 1 三七总 RNA 电泳图
Fig. 1 Electrophoresis of total RNA in P. notoginseng
28 S rRNA 和 18 S rRNA 条带清晰完整，亮度均匀，
比例约为 2∶1，点样孔周围无污染，并且无明显的
拖尾现象，说明总 RNA 具有良好的完整性。紫外
分光光度法测得 A260/A280 值为 1.99，表明采用该方
法提取的 RNA 纯度较高，质量较好。可用于后续
实验。
2.2 PnHMGR 基因的克隆
根据同源克隆的原理，从三七愈伤组织的
cDNA 中克隆到 1 个约为 2 000 bp 的片段（图 2）。
用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒按照说明书对目
的片段进行切胶回收，胶回收后的目的片段进行
T-A 克隆获得连接产物 pGEM-T-PnHMGR，将连接
产物转入大肠杆菌 DH5α，氨苄青霉素筛选后经菌
液 PCR 鉴定获得阳性克隆。随机挑选几个阳性克隆
送测序。

图 2 PnHMGR 的 PCR 产物
Fig. 2 PCR product of PnHMGR
测序结果是 1 个大小为 1 893 bp 的片段。在
NCBI 上用 Blast 对此序列进行在线比对，发现该序
列与人参、刺五加和杜仲中 HMGR 基因的序列相似
性很高，分别为 98%、93%、80%，说明得到的这
条序列可能为三七的 HMGR 基因。并且通过 NCBI
“ORF finder”分析发现：该序列包含 1 个 1 725 bp

28 S
18 S

5 S

Marker 产物
2 000 bp
样品 1 样品 2
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的开放阅读框，编码 574 个氨基酸。同源性分析发
现，推衍的三七 HMGR 氨基酸序列与人参、刺五加
和杜仲 HMGR 的氨基酸序列一致性分别为 97%、
93%、81%。已有报道[13]表明不同植物 HMGR 基因
的开放阅读框的碱基数和所编码的氨基酸残基数相
似。说明本研究已经成功克隆得到三七 HMGR 基因，
并将该基因命名为 PnHMGR 基因，提交到 NCBI 中
GenBank 数据库，获得的登录号为 KJ578757。
2.3 PnHMGR 基因编码蛋白序列相似性分析
将PnHMGR 基因编码蛋白的氨基酸序列提交至
美国国立生物信息技术中心 NCBI 的蛋白质序列数
据库（http://blast.ncbi.nim.gov/blast.cgi）进行 BLASTP
在线比较，结果显示，PnHMGR 蛋白序列与人参
Panax ginseng C. A. Meyer 的 HMGR（ADI80346.1）
序列相似度最高，达到 97%；其次为刺五加
Eleutherococcus senticosus (Rupr. et Maxim.) Harms
（93%，AFM77981.1）、杜仲 Eucommia ulmoides Oliv.
（81%，AAV54051.1）、蓖麻 Ricinus communis Linn.
（80%，XP_002510732.1）、马铃薯 Solanum tuberosum
L. （ 78% ， XP_006342182.1 ）、 秦 艽 Gentiana
macrophylla Pall.（79%，AFN89600.1）、葡萄 Vitis
vinifera Linn.（79%，XP_002275827.1）和毛果杨
Populus trichocarpa Torr. & Gray（78%，XP_002301-
898.1）。
2.4 PnHMGR 基因编码蛋白的理化性质分析
利用 Expasy Proteomics Server 的在线软件
Protparam 预测 PnHMGR 基因编码蛋白的理化性
质。该蛋白由 574 个氨基酸组成，分子式为
C2729H4386N740O819S34，总原子数为 8 708。相对分
子质量是 61 757.3；理论等电点（pI）为 6.60，带
正电残基（Arg＋Lys）为 54，带负电残基（Asp＋
Glu）为 56。该蛋白的不稳定系数为 46.43，表明
PnHMGR 基因编码的蛋白质不稳定。脂肪系数为
95.12，亲水性系数为 0.124。
2.5 PnHMGR 基因编码蛋白二级结构分析及三级
结构预测
使用 SWISS-MODEL（http://beta.swissmodel.
expasy.org/）进行 PnHMGR 基因编码蛋白的二级结
构分析，该蛋白二级结构中 α-螺旋占 42.16%、β-
折叠占 14.11%、无规则卷曲占 43.73%。
在 SWISS-MODEL 依据保守结构域作图工具
中，以人类的 HMGR 基因（1dqa.1.A）为模板，对
PnHMGR 编码蛋白进行三维结构建模[14]（图 3）。

图 3 PnHMGR 基因编码蛋白三维结构模型
Fig. 3 Three dimensional structure of PnHMGR-encoding
protein
结果显示 PnHMGR 基因编码蛋白与人类的 1 个
HMGR 基因具有 56.17%的序列相似性的类似空间
结构。
2.6 PnHMGR 基因编码蛋白信号肽、亚细胞定位、
跨膜区预测分析
使用 SignalP 程序（http://www.cbs. dtu.dk/serv-
ices/SignalP/）预测 PnHMGR 基因编码蛋白不具有
信号肽。在线工具（http://www.wolfpsort.org/）预测
该蛋白的亚细胞定位情况如下：质体的定位系数为
8.0（plas 8.0）；内质网的定位系数为 5.0（E. R.：5.0），
表明该蛋白最可能定位于质体或内质网。
利用 TMHMM Server，v.2.0（http://www. cbs.-
dtu.dk/services/TMHMM/）预测 PnHMGR 基因编码
蛋白具有 2 个跨膜区（图 4），分别是位于 A49～A71
以及 A84～A106 的多肽链。

图 4 PnHMGR 基因编码蛋白跨膜螺旋区预测
Fig. 4 Predicted transmembrane helix regions
of PnHMGR-encoding protein
2.7 PnHMGR 基因编码蛋白的功能结构域预测和
分析
利用 Interpro 数据库（http://www.ebi.ac.uk/ interpro/）
对 PnHMGR 基因编码蛋白的功能结构域进行预
测，结果见表 2。选取药用植物人参（ADI80346.1）、
刺五加（AFM77981.1）、杜仲（AAV54051.1）、
0 100 200 300 400 500
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
概
率

跨膜 膜内 膜外
氨基酸位置
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表 2 PnHMGR 蛋白功能结构域预测
Table 2 Prediction of functional domains of PnHMGR
登录号 功能描述 结构域所处氨基酸序列位置
IPR004554 真核类/古生菌类 3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶 A 还原酶结构域 160～564
IPR009029 3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶 A 还原酶家族 I/II 底物结合结构域 147～278，395～553
IPR023282 3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶 A 还原酶 N-末端结构域 155～230
IPR023074 3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶 A 还原酶家族 I/II 催化结构域 231～277，397～566
IPR009023 3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶 A 还原酶家族 I/IINAD/NADP 结合结构域 281～396，281～397
IPR023076 3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶 A 还原酶家族 I/II 保守结构域 340～354，495～502，549～562

秦艽（AFN89600.1）、丹参（AEZ55673.1）、西洋
参（ACV65036.1）和 PnHMGR 的氨基酸序列利
用 DNAMAN 软件进行多重序列比较分析，得出
PnHMGR 蛋白与其他药用植物的 HMGRs 一样，
均具有 HMG-CoA 结合基序（EMPIGYVQIP 和
TTEGCLVA）和 NADP（H）结合基序（DAMGMNM
和 GTVGGGT）（图 5）。底物 HMG_CoA 结合基
序和 NADP 结合基序对于植物 HMGRs 的功能非
常重要，并且在进化时具有较高的稳定性（图 5）。
不同植物中 HMGR 的 C-末端序列较 N-末端序列
保守，而 PnHMGR 基因编码蛋白的 C-末端序列
和 N-末端序列同样具有上述特点[8]（图 5）。


图 5 HMGRs 蛋白的序列比对
Fig. 5 Alignment of amino acid sequences of selected HMGRs

人参
三七
刺五加
秦艽
丹参
西洋参
人参
三七
刺五加
秦艽
丹参
西洋参

人参
三七
刺五加
秦艽
丹参
西洋参


人参
三七
刺五加
秦艽
丹参
西洋参
人参
三七
刺五加
秦艽
丹参
西洋参

人参
三七
刺五加
秦艽
丹参
西洋参



人参
三七
刺五加
秦艽
丹参
西洋参


人参
三七
刺五加
秦艽
丹参
西洋参


79
80
79
77
77
62
66


145
146
143
152
148
124
144

208
209
205
224
213
185
224

288
289
285
304
293
265
304


368
369
365
384
373
345
384
448
449
445
464
453
425
464



528
529
525
544
533
505
544


573
574
570
590
580
550
589

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2.8 PnHMGR 基因编码蛋白的系统进化树分析
为了分析 PnHMGR 基因编码蛋白与其他
HMGRs 的系统进化关系，从 GenBank 数据库中共
选取 20 个物种的 21 条 HMGR 蛋白序列，其中人
参有 2 条不同序列。经过 ClustalW 比对并利用
MEGA5.1 中的 Neighbor-joining 方法，构建植物、
真菌、古细菌和动物各种不同生物 HMGRs 的进化
树。古细菌包括 Caldivirga maquilingensis IC-167
（YP_001540247.1）、Pyrobaculum sp. 1860（YP_0050
84125.1）、Thermococcus gammatolerans EJ3（YP_002
959512.1）；真菌包括粗糙脉孢菌 Neurospora crassa
（ BAJ83615.1 ）、 黑 曲 霉 Aspergillus niger
（CAK48210.1）、酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae
S288c （ NP_013636.1 ）、灵 芝 Ganoderma lucidum
（ ABY84848.1 ）； 动 物 包 括 斑 马 鱼 Danio rerio
（NP_001014314.1）、小鼠Mus musculus（EDL00884.1）、
家兔 Oryctolagus cuniculus（XP_ 002723079.1）、人
类 Homo sapiens（NP_001124468.1）、野猪 Sus scrofa
（NP_001116460.1）；植物包括人参 Panax ginseng
HMGR2（AGL08682.1）、人参（ADI80346.1）、西
洋参 Panax quinquefolius（ACV65036.1）、荔枝 Litchi
chinensis（ABF56518.2）、丹参 Salvia miltiorrhiza
（ AEZ55673.1 ）、 胡 黄 连 Picrorhiza kurrooa
（ ABC74565.1 ）、 杜 仲 Eucommia ulmoides
（ AAV54051.1 ）、 秦 艽 Gentiana macrophylla
（AFN89600.1）、刺五加 Eleutherococcus senticosus
（AFM77981.1）；采用上述生物的 HMGRs 序列构
建的系统进化树（图 6），结果表明，HMGR 蛋
白质具有明显的种族特异性，这些序列分别聚类
为植物、古细菌、真菌和动物的 HMGR 群。真
菌和动物形成一个分枝，又和植物形成一个大的
分枝。从进化树可以看出植物、古细菌、真菌和
动物的 HMGRs 起源于同一个祖先。本研究克隆
得到的 PnHMGR 基因编码蛋白聚类到植物
HMGR 群，并且与人参的 HMGR（ADI80346.1）
亲缘关系最近。
2.9 三七愈伤组织不同生长阶段 PnHMGR 基因表
达和 PNS 量的变化
利用实时荧光定量PCR方法检测PnHMGR基因
在三七愈伤组织不同生长阶段表达量的变化情况
（图 7）。结果表明 PnHMGR 基因的表达量先升高后
降低，在细胞生长 30 d 时，表达量最高，但 PNS 量
在培养 40 d 达到最高。PnHMGR 基因的表达情况和

图 6 HMGRs 蛋白的系统进化树
Fig. 6 Phylogenetic tree of HMGRs protein

图 7 三七愈伤组织不同生长阶段 PnHMGR 基因表达量和
PNS 量
Fig. 7 Content of PNS and expression analysis
of PnHMGR in different growth periods
of P. notoginseng
PNS 的合成变化并没有“实时”对应关系，这是因
为在 PNS 生物合成的途径中，PnHMGR 基因处在比
较前端的调控位置，从 PnHMGR 基因的表达调控到
终产物的生成，中间还要经历多步酶催化反应，同
时，生物合成的调控是一个复杂体系，一条路径上
的关键酶可能有多个，这就使得个别关键酶基因的
表达情况不一定能够最终影响代谢产物的合成。
3 讨论
三七是我国的传统中药，具有广泛的生理活性，
更是治疗心脑血管疾病的特效药，市场需求高，价
格昂贵。然而，三七为多年生草本植物，生长周期
长且环境特殊，栽种地域较少且存在连作障碍，传
统栽培方法的产量难以满足快速增加的市场需求。

人参
三七
刺五加
秦艽
荔枝
杜仲
丹参
胡黄连
人参 HMGR2
西洋参
粗糙脉孢菌
黑曲霉
酸酒酵母 S288c
灵芝
斑马鱼
小鼠
野猪
家兔
人
Thermococcus gammatolerans EJ3
Caldivirga maquilingensis
Pyrobaculum sp.1860
40

30

20

10

0
PN
S
量
/
(m
g·
g−
1 )
PnHMGR 基因相对表达量
PNS 量
4

3

2

1
0
相
对
表
达
量

10 20 30 40 50
时间 / d
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 18 期 2014 年 9 月

·2690·
随着分子生物学向各学科领域的渗透以及生物信息
学和蛋白质组学的应用，找出生物合成途径中的关
键酶，实现其基因的克隆和高效表达，将成为以后
大规模生产药用植物有效成分可行的办法。这不仅
对于基础研究，而且对于增加中草药有效成分的含
量，提高经济效益都具有重大的意义。有研究表明
HMGR 活性的急剧提高，可以诱导倍半萜环化酶
活性，同时提高倍半萜植物抗毒素的产量 [15]。
HMGR 基因的超表达可使黄花蒿中的萜类化合物
的量提高 22.5%[16]。灵芝中 HMGR 基因的超表达
使灵芝酸的量增加 2 倍，中间体鲨烯和甾醇的积聚
也有所提高[17]。
在 PNS 生物合成的途径中，HMGR 蛋白处在
比较前端的调控位置，倍半萜、二萜、三萜的合成
都必须有该酶的参与。本研究首次成功地从三七中
扩增出 MVA 途径的关键酶 HMGR 的基因，生物信
息学分析表明,该基因编码的蛋白与前人所报道的
HMGR 蛋白特性非常相似，从 160～564 的氨基酸
残基是 HMGR 家族的特异性识别序列。有研究发
现，在植物中编码 HMGR 蛋白的通常是一个基因
家族，在这些基因家族中，不同 HMGR 基因的表达
可能控制着 MVA 代谢、“碳流”的流向，并决定着
各种萜类最终产物的比例 [11]。本实验克隆到的
PnHMGR 基因可能只是三七 HMGR 基因家族中的
一个成员，是否存在其他成员及该基因在三七皂苷
生物合成中的作用都有待进一步研究。目前，本研
究组正在进行三七中 PnHMGR 基因的超表达和
RNAi，力图从更深层地认识和了解 PnHMGR 基因
的功能，明确 PnHMGR 基因在 PNS 生物合成途径
中的地位和角色。
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