全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 3 期 2014 年 2 月

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基于 16S rDNA 序列分析研究根腐病三七根内可培养细菌的多样性
张智慧 1，张倩茹 2，付晓萍 2，李凌飞 2*
1. 云南省农业科学院药用植物研究所，云南 昆明 650223
2. 云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201
摘 要：目的 分析根腐病三七根内可培养细菌的多样性。方法 用牛肉膏蛋白胨培养基分离根腐病三七根内的细菌，经细
菌通用引物 27F/1492R 扩增 16S rDNA 后，分别用 Rsa I 和 Hin6 I 限制性内切酶对扩增产物进行酶切，结合限制性片段长度
多态性（RFLP）分析方法和 DNA 测序技术，对分离自根腐病三七根内的细菌进行初步鉴定。结果 根腐病三七根内的细
菌分属于 8 个类群，依占总菌数的比例分别是芽孢杆菌属 Bacillus 22.47%、无色杆菌属 Achromobacter 5.62%、寡养单胞菌
属 Stenotrophomonas 5.62%、类芽孢杆菌属 Paenibacillus 4.49%、鞘氨醇杆菌属 Sphingobacterium 1.12%、苍白杆菌属
Ochrobactrum 1.12%、不动杆菌属 Acinetobacter 1.12%及肠杆菌科的一些属 58.43%。结论 泛菌属和芽孢杆菌属是根腐病三
七根中的两大优势细菌类群。
关键词：三七；根腐病；细菌；限制性片段长度多态性分析；DNA 测序；16S rDNA；泛菌属；芽孢杆菌
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)03 - 0415 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.03.021
Cultivable bacterial diversity in rotting roots of Panax notoginseng based on 16S
rDNA sequence analysis
ZHANG Zhi-hui1, ZHANG Qian-ru2, FU Xiao-ping2, LI Ling-fei2
1. Institute of Medicinal Plant, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650223, China
2. College of Food Science and Technology, Yunnan Agriculture University, Kunming 650201, China
Abstract: Objective To analyze the cultivable bacterial diversity in the roots of Panax notoginseng with root rot disease. Methods
Bacterial strains were isolated from the diseased roots of P. notoginseng using beef extract-peptone medium. The 16S rDNA was
amplificated by Primer 27F/1492R, the product was digested by restriction endonuclease Rsa I and Hin6 I, and PCR-RFLP analysis and
DNA sequencing technology were used to identify the bacterial strains in the rotting roots of P. notoginseng. Results The bacteria could
be divided into eight groups including Bacillus (22.47%), Achromobacter (5.62%), Stenotrophomonas (5.62%), Paenibacillus (4.49%),
Sphingobacterium (1.12%), Ochrobactrum (1.12%), Acinetobacter (1.12%), and some bacterial generain Enterobacteriaceae (58.43%).
Conclusion The dominant groups in the rotting roots of P. notoginseng are identified as genera of Pantoea and Bacillus.
Key words: Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen; root rot; bacteria; RFLP analysis; DNA sequencing; 16S rDNA; Pantoea; Bacillus

三七 Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen 为五
加科人参属植物，是驰名中外的名贵中药材。因三
七是多年生宿根草本植物，性喜温暖阴湿，极易诱
发各种病害，其中以根腐病最为严重，常年损失达
5%～20%，严重的损失 70%以上[1]。
目前，已报道的三七根腐病病原菌主要是腐皮
镰孢菌 Fusarium solani、细链格孢菌 Alternaria
tenuis、坏损柱孢菌 Cylindrocarpon destructans 和黄
腐病菌 Cylindrocarpon didynum 等真菌[2-3]。也有研
究证明三七根腐病与病原细菌有密切关系[3-6]，此类
病原细菌主要是假单胞菌 Pseudomonas 和一些厌氧
细菌，但未明确指出是哪些厌氧菌，此外，难以查
阅到相关的文献报道。
传统的细菌分类鉴定主要依靠形态学特征、培
养特征、生理生化特征等进行，但存在着鉴定准确
性差、繁琐耗时、耗力等缺点。随着分子生物学技

收稿日期：2013-04-01
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30900963）；国家科技支撑项目（2011BAI13B01-02）；云南省中青年学术和技术带头人后备人才项目
（2011HB027）；中国科学院“西部之光”人才培养计划项目
作者简介：张智慧（1980—），女，助理研究员，主要从事药用植物资源研究。E-mail: ynzhangzhihui@126.com
*通信作者 李凌飞 Tel: (0871)65228661 E-mail: lilingfei1006@gmail.com
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术的发展，16S rDNA 基因的同源性分析已经成为
细菌种属鉴定的标准方法，在细菌的分类研究中起
着重要的作用。细菌 16S rDNA 基因大小适中，既
含有高度保守序列，又具有相当的变异，其限制性
片段长度多态性（RFLP）分析能较好地反映出属、
种和亲缘关系较近的菌株间的差异，因此，基于 16S
rDNA 的 PCR-RFLP 方法已广泛应用到环境微生物
和动植物微生物的研究中[7]。本研究通过 16S rDNA
的 PCR-RFLP 分析，结合 DNA 测序技术，可以克
服传统细菌鉴定方法的限制，快速、简便地对根腐
病三七根内细菌的多样性进行研究，以期为深入了
解三七根腐病病原细菌种类，研究三七根腐病综合
防治技术奠定基础。
1 材料与仪器
1.1 材料
于 2011 年 8 月三七根腐病发病的高峰期，从云
南省文山州文山市和砚山县采集人工种植的两年生
和三年生的根腐病三七Panax notoginseng (Burk.) F.
H. Chen 根样品，所有样品经云南省农业科学院药
用植物研究所张金渝研究员鉴定。取样时选取植株
地下部分局部腐烂的块根。所采集的样品置于已灭
菌的自封袋中，4 ℃冰箱保存，并于 2 d 内处理完。
1.2 主要仪器
T100 型 PCR 仪（Bio-Rad，美国）、DYY-6C
电泳仪（北京六一仪器厂，中国）、GelDoc XR 凝胶
成像系统（Bio-Rad，美国），3700 型 DNA 测序仪
（ABI 公司，美国）。
2 方法
2.1 根腐病三七根内细菌的分离和纯化
将局部腐烂的三七主根去除表面土壤后，用无
菌水清洗干净，再用 70%乙醇表面消毒 1 min，无
菌水清洗 3 次。剖开根部，切取病健交界的中间组
织块，涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上 37 ℃培养。
待长出菌落后重新于牛肉膏蛋白胨培养基平板上划
线纯化。纯化的细菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜
面上，4 ℃保存备用。共分离到 89 株细菌，对分离
菌株进行统一编号，记为 SQB1～SQB89。
2.2 根腐病三七根内细菌 16S rDNA 的 PCR-RFLP
分析
2.2.1 DNA 制备 用细菌基因组 DNA 提取试剂盒
（北京三博远志生物技术有限责任公司）提取细菌基
因组 DNA，方法参见试剂盒说明书。
2.2.2 PCR 扩增 采用细菌 16S rDNA 通用引物
27F/1492R 进行 PCR 扩增。PCR 反应体系为：
10×PCR 缓冲液（含 Mg2+）5 μL，2.5 mmol/L dNTP
4 μL，上下游引物（10 pmol/μL）各 1 μL，5 U/μL Taq
DNA 聚合酶 0.5 μL（PCR 反应所用试剂均购自
TaKaRa 公司），DNA 模板 1 μL，再用无菌去离子
水补至 50 μL 反应总体积。PCR 扩增条件：94 ℃预
变性 4 min；94 ℃变性 1 min，50 ℃退火 1 min，72
℃延伸 2 min，共 30 个循环；72 ℃后延伸 10 min。
2.2.3 RFLP 分析 分别用 2 种限制性内切酶（Rsa
I 和 Hin6 I）进行 RFLP 分析。酶切体系为：10×反
应缓冲液 2 μL，PCR 产物 10 μL，限制性内切酶 10
U，无菌去离子水补足至 20 μL。37 ℃反应 3 h 后，
用 2%的琼脂糖凝胶电泳检测，用紫外凝胶成像系
统观察并拍照，分析酶切图谱类型。
2.3 代表菌株 16S rDNA 序列分析
根据酶切分析结果，每一酶切类型选取一个代
表菌株分别用引物对 27F（5’-AGAGTTTGATC-
CTGGCTCAG-3’）和 1492R（5’-TACGGCTACCTT-
GTTACGACTT-3’）进行双向测序。所获得的 DNA
序列与 GenBank 数据库中的序列进行比对分析。采
用 Mega 4.0 软件构建系统发育树。
2.4 根腐病三七根内细菌群落组成分析
利用 SPSS 19.0 统计软件，通过 2 个相关样本
的非参数检验分别对两年生和三年生、以及文山和
砚山产地间的根腐病三七根内的细菌群落组成进行
分析。
3 结果与分析
3.1 根腐病三七根内细菌的分离结果
对局部腐烂的三七块根内的细菌进行分离，结
果发现培养基上长出大量菌落，经过纯化及镜检，
根据菌落形态和菌体形态差异，从中选择 89 株代表
菌株进行后续分析。
3.2 根腐病三七根内细菌 16S rDNA 的系统发育
利用限制性内切酶 Rsa I 和 Hin6 I 分别对 89
个菌株的扩增片段进行 RFLP 分析。共获得 30 种
酶切类型，每一酶切类型选择一个代表菌株进行
测序。将所获得的细菌 DNA 序列与 GenBank 数
据库中的序列进行比对，选择一些与测定序列同
源性较高的已知种序列作为参考序列，构建系统
发育树（图 1）。系统发育分析表明，根腐病三七根
内的细菌分属于 8 个类群，即芽孢杆菌属 Bacillus、
无 色 杆 菌 属 Achromobacter 、 寡 养 单 胞 菌 属
Stenotrophomonas、类芽孢杆菌属 Paenibacillus、鞘
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图 1 根腐病三七根内细菌的 16S rDNA 系统发育树
Fig. 1 16S rDNA phylogenetic tree of bacteria in P. notoginseng with root rot disease
SQB43
成团泛菌（EU275357）
成团泛菌（AB004691）
成团泛菌（AM184272） 泛菌属
SQB2
SQB1
成团泛菌（GU929212）
阴沟肠杆菌（HM030748）
阿式肠杆菌（HQ455820）
SQB39
阿式肠杆菌（JQ795804）
SQB59
河生肠杆菌（DO481471） 肠杆菌属
SQB78
河生肠杆菌（DO223879）
河生肠杆菌（NR024642）
土生拉乌尔菌（NR037085） 肠杆菌科
SQB53
土生拉乌尔菌（AF129442） 克雷伯菌属
SQB37
赫氏埃细菌（EF059889）
赫氏埃细菌（AB479110） 埃希氏菌属
SQB60
果胶杆菌（JF926749）
果胶杆菌（JF926745） 果胶杆菌属
SQB73
耶尔森氏菌（EF717344） 耶尔森氏杆菌属
耶尔森氏菌（HO222845）

SQB3
Acinetobacter rhizosphila（FN600413）
醋酸钙不动杆菌（FU118781） 不动杆菌属
醋酸钙不动杆菌（FJ867346）
稀有无色杆菌（FM162561）
木糖氧化无色杆菌（DO659433）
SQB69 无色杆菌属
SQB56
木糖氧化无色杆菌（AF439314）
SQB71
嗜麦芽寡养单胞菌（GQ861456）
嗜麦芽寡养单胞菌（AB294555）
SQB89
嗜麦芽寡养单胞菌（FJ811851）
嗜根寡养单胞菌（GQ359352） 寡养单胞菌属
SQB74
嗜根寡养单胞菌（FM955853）
SQB58
嗜根寡养单胞菌（AJ131117）
Ochrobactrum rhizosphilia
Ochrobactrum rhizosphilia 苍白杆菌属
烟碱降解细菌（AM490633）
SQB72
SQB75
多食鞘氨醇杆菌（AB020205）
多食鞘氨醇杆菌（AB680559） 鞘氨醇杆菌属
泗阳鞘氨醇杆菌（NR044391）
饲料类芽孢杆菌（AM087615）
Paenibacillus tundrae（HF545335）
SQB23
Paenibacillus tundrae（HF545335）
巴塞罗那类芽胞杆菌（DO870733） 类芽孢杆菌属
SQB19
SQB12
SQB22
巴塞罗那类芽胞杆菌（NR044525）
巴塞罗那类芽胞杆菌（AJ716019）
南海芽孢杆菌（DO363432）
SQB26
砒酸芽胞杆菌（GO304748）
砒酸芽胞杆菌（EJ927409）
SQB35
简单芽孢菌（FN397515）
简单芽孢菌（FJ577334）
SQB7
巨大芽孢杆菌（JX312585）
巨大芽孢杆菌（JX144725）
SQB11 芽孢杆菌属
SQB21
越南芽孢杆菌（JO799107）
海水芽孢杆菌（JX501683）
海水芽孢杆菌（JO030912）
SQB20
蜡状芽孢杆菌（JX218990）
SQB51
蜡状芽孢杆菌（JO248587）
蜡状芽孢杆菌（GU826149）
嗜热古细胞（AB603518）
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氨 醇 杆 菌 属 Sphingobacterium 、 苍 白 杆 菌 属
Ochrobactrum、不动杆菌属 Acinetobacter 及肠杆菌
科（Enterobacteriaceae）。其中肠杆菌科占总菌株数
的 58.43%，主要是泛菌属 Pantoea，占总菌株数的
39.33%，此外还有肠杆菌属 Enterobacter，以及少
量 的 克 雷 伯 菌 属 Raoultella 、 埃 希 氏 菌 属
Escherichia、果胶杆菌属 Pectobacterium、耶尔森氏
菌属 Yersinia 等。芽孢杆菌属在根腐病三七根中的
分离频率也比较高，占总菌株数的 22.47%。因此泛
菌属和芽孢杆菌属是根腐病三七根中的两大优势细
菌类群。
3.3 根腐病三七根内细菌群落组成差异分析
两年生和三年生、文山和砚山两产地间根腐病
三七根内的细菌各类群的菌株数见表 1。两个相关
样本的非参数检验结果表明，两年生和三年生根
腐病三七根内的细菌群落组成没有显著差异（P＞
0.05）。并且砚山和文山两产地间根腐病三七根内细
菌群落组成也没有显著差异（P＞0.05）。
表 1 根腐病三七根内的细菌各类群的菌株数
Table 1 Number of bacterial strains in roots
of P. notoginseng with root rot disease
菌株数 类群
两年生 三年生 砚山 文山
肠杆菌科 27 25 29 23
芽孢杆菌属 0 1 0 1
无色杆菌属 1 3 4 0
寡养单胞菌属 10 10 19 1
类芽孢杆菌属 4 1 0 5
鞘氨醇杆菌属 1 0 0 1
苍白杆菌属 2 3 0 5
不动杆菌属 1 0 1 0

4 讨论
本研究首次基于 16S rDNA 序列分析对根腐病
三七根内可培养细菌进行了研究，从 2 个三七主产
区已发生根腐病的三七根内分离到了大量细菌。通
过 2种限制性内切酶的RFLP分析和系统发育分析，
发现根腐病三七根内的细菌主要是泛菌属
（39.33%）和芽孢杆菌属（22.47%）。泛菌属的一些
种类能对许多重要经济农作物造成广泛危害，本实
验分离到的 SQB1、SQB43 等菌株与成团泛菌
Pantoea agglomerans 的 16S rDNA 序列相似性为
100%。研究表明，成团泛菌是造成棉花细菌性烂铃
病、玉米细菌干茎腐病、香蕉叶鞘腐败病的主要病
原菌[8-10]。芽孢杆菌属细菌也是哈密瓜、烟草、玉
米等植物中的优势细菌种群[11-13]。这可能与该属细
菌抗逆性强有关，容易通过偶然途径进入植物内部
并定殖，但目前尚未见其作为植物病原菌的报道。
本实验中分离到的 SQB39 和 SQB60 菌株与阴
沟肠杆菌 E. cloacae 和胡萝卜软腐果胶杆菌 P.
carotovorum 的相似性均达到 99%，它们是报道较多
2 种植物病原菌，可以引起洋葱、生姜、半夏、朝
鲜蓟等作物的茎腐病和软腐病[14-22]。三七与人参同
属，均为喜阴植物，Jeon 等[23-24]研究发现类芽孢杆
菌属中的多粘类芽孢杆菌 P. polymyxa 在人参根部
达到一定的定殖密度，会失去生防作用引起人参根
腐病。本研究在根腐病的三七根内也分离到了该属
细菌，但其分离频率比较低，仅为 4.49%。
罗文富等[3-4]研究三七根腐病复合侵染时，发现
假单胞杆菌 Pseudomonas 是该病初始病原，真菌腐
皮镰孢和细链格孢为继入病原（后期还有小杆线虫
参与）加速腐烂的复合侵染病害，因此细菌在三七
根腐病的发生发展中起了主要作用。盆栽试验表明，
经人工接种发病症状与田间症状相似，发病率达
90%以上。然而，在本实验中没有分离到该属细菌。
本研究的统计分析结果表明，不同生长年限（两年
生和三年生）、不同采样地点（砚山和文山）的根腐
病三七根中可培养细菌群落组成没有显著差异，说
明根腐病三七根内的可培养细菌类群不受三七生长
年限和生境的影响。
当然，本研究中根腐病三七根内的细菌分离方
法存在一定的局限性。由于采用了离体培养的方法
先分离和纯化根内细菌，这可能会使某些厌氧类群，
以及不适宜在牛肉膏蛋白胨培养基中培养的类群无
法生长，从而使得分离到的细菌种类偏少，因而不
能全面地代表根腐病三七根内细菌的群落结构。在
今后的研究中，可考虑将传统分离培养方法与免培
养方法结合起来，以更全面地反映三七根内细菌的
多样性。
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