全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 22 期 2014 年 11 月

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• 药材与资源 •
基于叶绿体 DNA trnL 内含子序列变异的远志谱系地理学研究
韩雪婷，房敏峰＃，李忠虎，杨 佳，冯 力，赵桂仿*
西北大学生命科学学院，西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室，陕西 西安 710069
摘 要：目的 研究我国自然地理分布范围内远志 Polygala tenuifolia 的分子谱系地理情况，揭示其地理分布格局的形成原因，
推测该物种潜在的冰期避难所及冰期后的迁移扩散路线。方法 使用叶绿体非编码片段（trnL 内含子序列）对远志在我国自然
地理分布区内的 39 个居群 308 个个体的遗传变异分布模式进行检测。结果 共发现 26 个多态性位点，得到 12 种叶绿体单倍
型。单倍型系统发育分析显示远志自然居群可划分为南、北 2 个地理组群：北方（包括中国东北、中部、西北地区）组群和南
方组群，南北组群没有共享单倍型。居群遗传结构分析表明 2 个地理组群之间遗传分化较大（Gst＝0.783，P＜0.001），物种水
平遗传多样性较高（Ht＝0.755），北方组群不存在明显的谱系地理结构。结论 第四纪冰期时远志在中国北方和南方地区存在
多个避难所；冰期后或间冰期，北方地区发生了明显的居群扩张事件；南、北组群的分化可能是由于长期的地理隔离所致。
关键词：远志；谱系地理学；冰期避难所；扩张；居群结构
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)22 - 3311 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.22.018
Phylogeography of Polygala tenuifolia inferred from chloroplast DNA trnL intron
sequence variation
HAN Xue-ting, FANG Min-feng, LI Zhong-hu, YANG Jia, FENG Li, ZHAO Gui-fang
Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China, Ministry of Education, College of Life Sciences,
Northwest University, Xi’an 710069, China
Abstract: Objective To study the molecular phylogeography of natural populations of Polygala tenuifolia (Polygalaceae) in China,
reveal the forming reasons of geographic distribution pattern of extent populations, and further determine the potential glacial refuges and
colonization/migration routines of P. tenuifolia during the postglacial or interglacial periods. Methods We investigated the distribution
patterns of genetic variation of 308 individuals from 39 natural populations of P. tenuifolia in China based on one chloroplast DNA
fragment (cpDNA trnL intron). Results A total of 26 polymorphic sites were identified and 12 cpDNA haplotypes were recovered.
Phylogenetic analysis of cpDNA haplotypes suggested that the natural populations of P. tenuifolia could be divided into two different
groups: northern part (including populations of northeast, center, and northwest of China) and southern part. There were no shared cpDNA
haplotypes between the two groups. And the population genetic analysis suggested that the high level of genetic differentiation (Gst =
0.783, P < 0.001) between the two groups, the high level of the genetic diversity were found (Ht = 0.755) at the species level. No significant
phylogeographic structure was detected in the North group. Conclusion The present studies revealed that the multiple glacial refuges of
P. tenuifolia are identified in the northern and southern parts of China during the Quaternary periods. And northern populations have
occurred the expansion events during the post-glacial or interglacial periods. The genetic divergence between the north and south groups of
natural populations of P. tenuifolia may be caused by the long term geographic isolation.
Key words: Polygala tenuifolia Willd.; phylogeography; glacial refuges; expansion; population structure

全球气候变化，尤其是第四纪冰期与间冰期气
候反复波动，影响了全球特别是北半球动植物的地
理分布和居群遗传结构[1]。近年来，通过追踪物种
自然地理居群遗传变异的时空分布来阐述植物响应
过去气候波动的分子谱系地理学研究获得了长足的
发展[2-4]。研究结果表明，冰期产生的历史气候波动

收稿日期：2014-02-19
基金项目：陕西省教育厅科学研究项目（2013jk0808，2013Jk0713）
作者简介：韩雪婷（1987—），女，甘肃定西人，硕士，主要从事分子资源植物学方面的研究。Tel: 18392017922 E-mail: tshan2011@ 126.com
*通信作者 赵桂仿 Tel: (029)88305207 E-mail: gfzhao@nwu.edu.cn
﹟共同第一作者
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对分布于我国植物的遗传结构产生了很大影响[5-6]。
根据古孢粉学和化石证据对中国植被的重建研究发
现，在距今 18 000～20 000 年前的末次盛冰期时，
中国北方的草原和荒漠植被一直延伸到了今天的东
南部海岸线附近[7]，而另外一些学者研究认为在末
次盛冰期时中国北方地区存在有多个独立的植物冰
期避难所，冰期后发生了局域性的居群扩张[8]。然
而，这些研究主要集中在中国北方和南方地区多年
生木本树木植物物种的居群历史动态方面，对于该
地理分布范围内的草本植物物种研究较少。
叶绿体 DNA（cpDNA）在大部分被子植物中
为母系遗传，最大限度地保留了植物长期进化的历
史遗传痕迹，这使得 cpDNA 非常适合于植物谱系
地理历史研究。近年来，利用叶绿体 DNA 非编码
区序列研究植物物种的群体遗传结构和谱系地理历
史已经取得了一系列研究成果[9-11]。这些研究结果
表明：在末次盛冰期（LGM）来临时，植物迁移到
低海拔环境相对稳定的避难所地区得以幸存，而在
间冰期或冰期过后，这些物种居群以避难所为中心
重新向外回迁或扩散。
远志 Polygala tenuifolia Willd. 是我国一种重要
的多年生草本药用植物，隶属于远志科（Polygalaceae）
远志属 Polygala Subgen，具有祛痰安神、益智、消散
肿痛等功效[12]。目前，对该物种的研究主要集中在化
学成分、药理功能和部分取样居群的遗传多样性等方
面[13-14]。该物种在我国的自然地理分布范围较广，这
为研究草本植物在中国北方是否存在冰期避难所以
及冰期后的迁移/扩散路线等问题提供了良好的研究系
统。本研究通过检测我国自然地理分布范围内的 31 个
远志自然居群的 308个个体的叶绿体DNA序列变异
模式，进一步进行该物种分子谱系地理历史研究，以
期揭示远志现今地理分布格局的形成原因，推测远志
潜在的冰期避难所及冰期后可能的迁移/扩散路线。
1 材料
对分布于我国范围内的远志自然地理居群进行
采样，共收集到 31 个居群共 308 个个体的样品。野
外采取嫩叶，用硅胶快速干燥并带回西北大学进化
植物学实验室保存。具体采样信息及编号见表 1。
样品由西北大学生命科学学院房敏峰教授和李佳硕
士采集并鉴定为远志 Polygala tenuifolia Willd.。
2 材料
2.1 DNA 提取、PCR 扩增和测序
用小型植物基因组 DNA 提取试剂盒（天根生
化科技有限公司）从干燥叶片中提取远志总 DNA。
叶绿体 trnL intron 扩增引物来自 Taberlet 的文献报
道[15]。此外，本课题组选择跟远志同属物种卵叶远
志 Polygala sibirica Willd. 和 瓜 子 金 Polygala
japonica Houtt. 作为外类群。
PCR 反应在 PTC—200（MJ Research，美国）热
循环仪上来进行。20 μL PCR 反应体系包括 10 μL
2×Taq PCR Mix（西安润德生物技术有限公司），DNA
模板 2 μL，引物 0.3 μL，加 ddH2O 补至 20 μL。反应
程序：94 ℃预变性 4 min，35 个循环；94 ℃加热变
性 40 s；61.7 ℃退火 1 min，72 ℃ 延伸 1 min；然后
在 72 ℃终延伸 10 min，最终 PCR 产物于 4 ℃保存。
PCR 扩增产物首先在 1.2%琼脂糖凝胶上检测，
用溴化乙锭染色，在紫外灯下观察并拍照查看有无
扩增产物，然后将 PCR 产物送到上海生工生物有限
公司进行测序（ABI 3730xl 遗传分析仪）。
2.2 数据处理
测序原始序列用 BioEdit 7.0.9 软件[16]编辑后进
行序列比对，不准确位点通过原始序列图谱在
MEGA 5.0 软件[17]中进行适当手工校正。用 DnaSP
5.0[18]对 cpDNA 单倍型进行统计并计算每个居群单
倍型多态性（Hd）和核苷酸多态性（Pi）[19]。用
失配分布分析来检测居群历史动态变化情况[20]，
群体扩张或增长时，失配分布呈现为单峰分布，
反之，出现双峰或多峰，则处于动态平衡。用
Tajima’s D 检验[21]、Fu and Li’s D*[22]、Fu and Li’s F*
检验以及 Fu’s FS[23]进行中性检验。
远志居群总的遗传多样性（Ht）和居群内平均
遗传多样性（Hs），居群间遗传分化系数（Gst）以
及基因流系数（Nst）值用软件 PERMUT 进行 1 000
次置换检验计算。同时比较 Gst 和 Nst，如果 Nst 值显
著大于 Gst（P＜0.05），说明亲缘关系相近的单倍型
更可能发生在相同的居群中，表明存在谱系地理结
构[24]。利用 NETWORK 4.2.0 软件[25]构建叶绿体单
倍型网状关系图。组间、组内居群间和居群内的遗
传差异分析用ARLEQUIN 3.0软件包[26]中的分子变
异分析（AMOVA）进行检测。利用 MEGA 5.0 软
件[15]中的最大简约法进行单倍型的系统发育分析，
通过 1 000 次重复自展分析（Bootstrap）推断出节
点的置信度。
3 结果与分析
3.1 单倍型变异及其分布
对远志所有个体测序结果进行比对以及人工矫
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表 1 31 个远志居群的地理位置及样本大小
Table 1 Sample sizes (N) and locations of 31 populations of P. tenuifolia
居群代号 采样地点 纬度 (N) / (°) 经度 (E) / (°) 海拔 / m 样本数量
GSLZ 甘肃兰州 36.03 103.82 1 833.0 10
GSLX 甘肃陇西 35.09 104.44 1 833.0 10
HBLY 河北涞源 39.34 114.58 957.2 9
HBTX 河北唐县 38.78 114.98 121.0 10
HBWC 河北围场 41.95 117.77 1 004.0 10
HNHX 河南辉县 35.45 113.81 100.0 10
HNLS 河南卢氏 34.08 111.07 674.5 10
HBFX 湖北房县 32.57 110.70 153.7 10
JSXZ 江苏徐州 34.17 117.08 106.1 10
JXGC 江西广昌 26.91 116.21 109.9 10
LNBP 辽宁北票 41.62 121.00 166.6 10
LNJZ 辽宁锦州 41.20 121.10 108.0 10
NMBT 内蒙包头 40.63 109.84 1 452.0 10
NMCF 内蒙赤峰 42.26 118.95 569.0 10
NMHS 内蒙呼市 40.84 111.74 1 734.0 9
NXYI 宁夏盐池 37.76 107.14 1 565.0 10
NXYU 宁夏银川 38.71 105.99 1 601.0 10
QHXH 青海循化 35.83 102.69 2 011.0 10
SDFX 山东费县 32.17 117.88 248.9 10
SXPS 山西平顺 36.19 113.43 1 134.0 10
SXPY 山西平遥 37.21 112.27 826.2 10
SXWT 山西五台 38.83 113.41 1 101.0 10
SXXJ 山西新绛 35.49 111.07 564.8 10
SXYC 山西运城 34.85 110.57 604.7 10
SXHY 陕西合阳 35.14 110.29 575.3 10
SXSM 陕西神木 38.82 110.50 1 053.0 10
SXYX 陕西耀县 35.19 108.84 1 250.0 10
SXWN 陕西渭南 34.48 109.50 352.0 10
SXYH 陕西延川 36.86 110.20 790.1 10
SCMX 四川茂县 31.68 103.84 1 568.0 10
ZJKH 浙江开化 29.01 118.39 108.8 10

正，结果显示 trnL 内含子间隔区对齐后总长度为 545
bp，包含 26 个变异位点，其中 8 个简约信息位点，
具体变异位点如表 2 所示。分析得到总单倍型多态性
和总核苷酸多态性分别是 Hd＝0.183 和 Pi＝0.001 54，
总共得到的 12 种单倍型见表 3。大多数居群含有单倍
型 H1 和 H2，而且所占频率较高。这 2 种单倍型主要
分布于中国北部、西北和中部的居群中。此外，H2
在东北居群中也有分布。H9、H10、H11、H12 为南
部居群的特有单倍型。H4、H6、H7、H8 分布范围有
限，H7、H8 仅分布于陕西耀县的居群中，H6 仅在陕
西合阳居群中有分布，H5 仅在辽宁 2 个居群中分布，
而 H4 仅在河南辉县居群中存在。
3.2 单倍型系统发育关系
基于叶绿体单倍型最大简约型的系统发育分析
显示，远志的叶绿体单倍型构成一个单系分支，而
且具有较高的支持率。在最大简约树（MP 树）中
（图 1），cpDNA 单倍型基本上可以分为 2 个不同的
地理族群，一个在中国北方（包括中部、西北、华
北、东北的居群），另一个在中国东南部地区，这与
Network 网状结构关系（图 2）基本一致。单倍型
H1 和 H2 位于网络连接图的中央位置，而且分布频
率较高，范围较广，推测可能是古老的祖先单倍型。
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表 2 远志 cpDNA trnL 内含子确定的 12 种单倍型间的变异
Table 2 Variable sites of aligned sequences of cpDNA fragment trnL intron of 12 haplotypes of P. tenuifolia
内含子 / bp
cpDNA 单倍型
22 72 94 109 144 320 321 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 338 339 340 365 398 413 430 468
H1 A T A A C − − A T A A A T − − − − − − − − C A A T −
H2 A T A A C − − A T A A A T A A A T − − − − C A A T −
H3 A T A A C − − A T − − − − − − − − − − − − C A A T −
H4 A T A A T − − A T A A A T − − − − − − − − C A A T −
H5 A T A A C − − A T A A A T A A A T A A A T C A A T −
H6 A T A A C − − A T A A A T A A A T − − − − C A A T A
H7 − T A A C − − A T − − − − − − − − − − − − C A A T −
H8 A T A A C − − − − − − − − − − − − − − − − C A A T −
H9 A G G T C − − A T A A A T − − − − − − − − A C A G −
H10 A G G T C − − A T A A A T − − − − − − − − A C T G −
H11 A G G T C − − A T A A A T − − − − − − − − A C A T −
H12 A G G T C T A A T A A A T A A A T − − − − A C A G −
表 3 12 种单倍型在 31 个居群中的分布以及各居群的遗传多样性
Table 3 Genetic diversity and distributions of 12 haplotypes from 31 populations of P. tenuifolia
居群 H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12 n N Pi Hd
GSLZ 9 1 10 2 0.000 38 0.2
GSLX 10 10 1 0 0
HBLY 8 2 10 2 0.000 67 0.355 56
HBTX 10 10 1 0 0
HBWC 10 10 1 0 0
HNHX 10 10 1 0 0
HNLS 10 10 1 0 0
HBFX 10 10 1 0 0
JSXZ 10 10 1 0 0
JXGC 2 4 4 10 3 0.003 0.711 11
LNBP 10 10 1 0 0
LNJZ 10 10 1 0 0
NMBT 10 10 1 0 0
NMCF 10 10 1 0 0
NMHS 10 10 1 0 0
NXYI 8 2 8 2 0.000 067 0.355 56
NXYU 10 10 1 0 0
QHXH 10 10 1 0 0
SDFX 10 10 1 0 0
SXPS 10 10 1 0 0
SXPY 10 10 1 0 0
SXWT 5 5 10 2 0.001 04 0.555 56
SXXJ 6 4 10 2 0.001 0.533 33
SXYC 6 4 10 2 0.002 0.533 33
SXHY 9 1 10 2 0.000 38 0.2
SXSM 10 10 1 0 0
SXYX 8 1 1 10 3 0.000 75 0.377 78
SXWN 9 9 1 0 0
SXYH 10 10 1 0 0
SCMX 10 10 1 0 0
ZJKH 4 6 10 2 0.001 0.533 33
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图 1 远志 12 种叶绿体 trnL 内含子单倍型的 MP 树
Fig. 1 MP tree of chloroplast trnL intron in 12 haplotypes
of P. tenuifolia

图 2 trnL 内含子的单倍型网状关系
Fig. 2 Networks of 12 chloroplast haplotypes
of trnL intron region
3.3 居群遗传结构和谱系地理历史
基于采样居群的地理区域和单倍型的组成
将所有的居群划分为北部组（中西部、华北、东
北）和南部组。AMOVA 分析显示中国北部和南
部组间存在明显的遗传分化（ 59.95%， P＜
0.001）。组内居群间的分化为 37.77%（ P＜
0.001），而居群内的分化较小（6.28%，P＜0.001），
居群内基因流较低（Nm＝0.06），居群间遗传分
化明显（Fst＝0.819 7）。
Permut 分析显示居群间遗传分化较大，物种水
平上遗传多样性较高，总的 Nst（0.717）小于 Gst
（0.783），表明没有明显的谱系地理结构。北部组
Nst（0.889）大于 Gst（0.856），表明北部组也没有
明显谱系地理结构。失配分布分析结果显示北部组
为单峰，推测可能发生了快速的居群扩张事件。同
样，北部组 Fst 值为负数也与扩张的结论一致。
4 讨论
4.1 群体遗传结构和分化
基于叶绿体DNA trnL内含子间隔区序列的系统
发育分析显示，我国远志自然地理居群可以分为明
显的 2 大谱系分支，遗传变异显著（59.95%，P＜
0.001）。北部组包括单倍型 H1～H8，其中 H1 和 H2
存在于大多数居群中。南部组包含 4 个单倍型 H11、
H9、H10、H12，南北 2 组之间不存在共享的单倍型。
分子变异分析（AMOVA）和 Permut 分析结果也显
示远志居群间的遗传分化水平较高（Gst＝0.783）。远
志自然居群中，物种水平上存在较高的的遗传多样
性（Ht＝0.783），推测可能是由于其明显的群体结构
所致；居群内遗传多样性水平较低（Hs＝0.164）。造
成我国南、北方远志自然居群遗传分化的主要原因
可能是由于存在地理隔离屏障，以及种子传播距离
有限和基因流水平较低等原因所致。一般来说，母
系遗传的叶绿体 DNA 通过种子传播，传播距离较
短。结果显示远志居群间的 Nm为 0.06，基因流较小。
推测远志种子长距离传播能力有限，加之有长江等
河流以及其他的地理隔离因素（如山脉、沟谷等），
所有这些都阻碍了远志南、北居群之间的基因交流，
导致了明显的遗传分化。
4.2 冰期避难所及居群动态历史
基于叶绿体 DNA trnL 内含子间隔区，本实验在
远志自然分布区总共鉴定得出 12 种单倍型，单倍型
网状结构显示单倍型 H1、H2 位于网络图的中央位
置，可能是古老单倍型。居群 GSLZ 地理上属于西
北地区，它除了包含高分布频率的古老单倍型 H1，
还包括西北居群的代表单倍型 H3，且此区域遗传多
样性较高，故推测居群 GSLZ 是远志在冰期时的一
个避难所。远志在秦岭西部存在可能的冰期避难所
的假设与栎属植物研究发现的植物冰期避难所位置
相似[25]。此外，位于中国东北部的居群LNJZ和LNBP
只固定单倍型 H5，在北方其他居群中也没有发现该
单倍型的存在，因此推测居群 LNJZ 和居群 LNBP
所在区域可能是远志冰期时一个避难所，这与对蒙
古栎和辽东栎的研究中发现的在末次盛冰期沿着长
白山的东北中部有避难所的结果类似 [27]。居群
SXYX 和 SXHY 中，不仅含有特有单倍型 H7、H8、
H6、H3，而且还包括广布单倍型 H2，这些居群的
单倍型多样性较高，因此，推测这些区域可能也是

H1
H5
H3
H4
H7
H2
H6
H8
H11
H10
H12
H9
卵叶远志
瓜子金



北部





南部
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远志的冰期避难所。冰期过后单倍型 H2 向西、向北、
向南进行扩散。单倍型 H9、H10、H11、H12 仅出现
在南部的居群 ZJKH 和 JXGC 中，南方居群中的特
有单倍型在系统发育树中处于基部位置，暗示了其
早期的起源和分化，表明这些居群在南部稳定的避
难所中有着长期的进化历史。这些居群经过长期的
适应性进化，或者由于早期的奠基者效应或是进化
过程中的瓶颈效应，再加上与北部居群的长时期的
地理隔离，造成现今南北地区远志叶绿体单倍型显
著的差异。
综上，基于 cpDNA trnL 内含子序列对远志自然
居群谱系地理研究结果表明，该物种在冰期时在中
国北方和南方都存在避难所。冰期过后，北部区域
明显地发生了居群扩张事件。南、北部组群的分化
可能由于河流、山脉等形成的长期的地理隔离所致。
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