全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 13 期 2014 年 7 月

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• 药材与资源 •
当归 DXR 基因保守区克隆和组织特异性表达分析
雒 军 1, 2，王引权 1, 2*，温随超 1，张金林 3*，夏 琦 1
1. 甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000
2. 甘肃省高校中（藏）药化学与质量研究省级重点实验室，甘肃 兰州 730000
3. 兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020
摘 要：目的 克隆当归 Angelica sinensis 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR）编码基因部分保守区序列，分析 DXR
基因在当归根、茎、叶中的特异性表达。方法 根据已克隆的植物 DXR 保守序列设计一对简并引物，以当归叶片总 RNA 为模
板，采用 RT-PCR 方法扩增出 DXR 片段并连接到 pGEM-T Easy 载体上，转化大肠杆菌菌株 Escherichia coli DH5α，阳性克隆经
PCR 检测后测序。运用 RT-qPCR 方法，以当归肌动蛋白基因 Actin 为内参基因，检测 DXR 在当归不同组织中的表达量。结果 得
到一段 564 bp 的 DXR 基因序列，并在 GenBank 注册（登录号：KJ000259）。序列分析表明，该片段编码 187 个氨基酸，与 GenBank
中注册的海岛棉 Gossypium barbadense 等 6 个物种的 DXR 核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性均在 80%以上；DXR 在叶中
表达量最高，相对表达量分别是茎和根组织中的 2.5 倍和 3.2 倍（P＜0.01）。结论 本研究首次从当归中克隆出了 DXR 部分保
守区序列，并揭示了 DXR 在不同组织中的差异表达，为有效利用该基因奠定前期工作基础。
关键词：当归；1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶；克隆；肌动蛋白；RT-PCR
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)13 - 1907 - 07
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.13.019
Cloning and tissue-specific expression analysis of conserved fragments of DXR
gene from Angelica sinensis
LUO Jun1, 2, WANG Yin-quan1, 2, WEN Sui-chao1, ZHANG Jin-lin3, XIA Qi1
1. Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China
2. Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese Medicines of the College of Gansu Province, Lanzhou 730000, China
3. College of Pastoral Agricultural Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, China
Abstract: Objective To clone the conserved cDNA fragment of 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase (DXR) gene from
Angelica sinensis and to analyze its tissue-specific expression in roots, stems, and leaves. Methods A pair of degenerate primers were
designed according to the conservative sequences of the cloned DXR from other plant species. The total RNA from the leaves of A. sinensis
was as template, DXR fragment was obtained by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), connected to pGEM-T Easy
vector then transformed into Escherichia coli DH5α. The positive clone identified by PCR was sequenced. Taking Actin of A. sinensis as a
reference gene, SYBR Green quantitative RT-PCR was used to detect the relative expression levels of DXR different tissues of A. sinensis.
Results The DXR fragment of A. sinensis containing 564 bp encoding 187 amino acids was registered in Genbank (No.KJ000259). The
sequence identity analysis suggested that both the obtained nucleotide sequence and its corresponding amino acid sequence shared more
than 80% of homology with GenBank DXRs from Gossypium barbadense and other five higher plant species. DXR was expressed at the
highest level in the leaves, and the relative expression levels in the leaves were 2.5 and 3.2 times relative to the stems and roots,
respectively (P < 0.01). Conclusion A novel DXR fragment is cloned from A. sinensis and its tissue-specific expression in A. sinensis is
investigated. This work might establish an experimental basis for the effective application of DXR in the future.
Key words: Angelica sinensis (Oliv.) Diels; 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase; gene cloning; actin; RT-PCR

收稿日期：2014-02-28
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81060327，81260616）
作者简介：雒 军（1981—），男，硕士，研究方向为中医药分子生物学研究。
*通信作者 王引权，博士生导师，教授，研究方向为药用植物生理生态研究。Tel/Fax: (0931)8768293 E-mail: kjkfpp@163.com
张金林，博士生导师，教授，研究方向为植物生理及分子生物学研究。E-mail: jlzhang@lzu.edu.cn
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挥发油（volatile oil）又称精油（essential oil），
是当归 Angelica sinensis (Oliv.) Diels 活性成分的重
要组分之一，其量约占当归总成分的 0.62%[1]。现
代药理研究表明，当归挥发油能松弛子宫平滑肌、
降低血压、改善心肌缺血、抗心律失常，并且具有
平喘、抑制中枢神经系统、提高机体免疫功能及抗
炎镇痛等作用[2]。萜类（terpenoids）是构成当归挥
发油的主要组分之一[3]。近年来，随着生物化学、
生物信息学、分子生物学等学科的不断发展，有关
萜类物质生物合成途径已基本阐明[4]。萜类物质通
常存在 2 个相对独立的合成途径，即位于细胞质中
的甲羟戊酸（mevalonate，MVA）途径和位于质体
中的 2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-
erythritol-4-phosphate，MEP）途径[5]。MVA 途径
是在动物和酵母中首先发现的萜类合成途径，主
要合成甾醇、倍半萜、三萜等，而 MEP 途径是在
高等植物中质体中主要合成单萜、二萜等物质的
途径[6-7]。MEP 途径初始物丙酮酸（pyruvate）和
3-磷酸甘油醛（D-GAP）在 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸
合酶（ 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase ，
DXS）的作用下转化成 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸
（DXP）。DXP 在 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶
（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，
DXR）及还原型辅酶 II（NADPH）的催化下分子
重排形成 MEP。MEP 在 4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-
赤藓糖醇合成酶（4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-
erythritol synthase，CMS）等一系列酶的催化反应下
转化成萜类合成的前体物质异戊基焦磷酸（IPP）和
二甲烯丙基焦磷酸（DMAPP）[8]。
甘肃是当归主产区，年栽培面积和总产量都占
全国 90%以上，目前对当归的研究主要集中在栽培
耕作方式和药效药理等方面，在基因层次的研究鲜
有报道。为了阐明当归药材道地性的分子生物学基
础，需要对当归主要药效物质的生物合成途径和基
因调控进行探索。在 MEP 途径中 DXS 虽然是第一
步催化反应的酶，但其催化产物 DXP 同时也是维
生素 B1 和维生素 B6 生物合成的前体物质，因此催
化 DXP 转化为 MEP 的 DXR 才是 IPP 合成的关键
酶[9]。DXR 已成为当前的研究热点[10-15]，但有关当
归藁本内酯合成关键基因 DXR 及其表达规律的研
究尚未见报道。本研究首次克隆当归 DXR 保守区序
列；并对其进行序列分析，以及对当归 DXR 的组织
特异性表达进行分析，以期为当归 DXR 的全长克隆
及研究其在当归中萜类物质的生物合成与调节中的
作用提供理论基础。
1 材料
当归植株于2013年8月采自甘肃岷县茶埠镇试
验基地（海拔 2 780 m，东经 104°06′，北纬 34°29′），
经甘肃中医学院王引权教授鉴定为伞形科当归属植
物当归 Angelica sinensis (Oliv.) Diels。田间挖取当归
全株，将其冷冻于装有干冰的泡沫箱中，于当天带
至实验室后迅速用去离子水冲洗干净，将根、茎、
叶分离后液氮迅速冷冻，保藏于−80 ℃超低温冰箱，
供作 RNA 提取材料。大肠杆菌菌株 Escherichia coli
DH5α由本实验室保存。
所用的分子生物学试剂主要包括：RNA 提取试
剂十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、LiCl 和聚乙烯
吡咯烷酮 360（PVP-360，Sigma 公司），cDNA 合
成试剂盒（TaKaRa，大连），Ex Taq DNA Polymerase
（TaKaRa，大连）、PCR 产物回收试剂盒（TransGen，
北京）、PCR 产物克隆试剂盒（Promega，美国），
DNA Marker（TransGen，北京），SYBR Green 荧光
定量试剂盒（Promega，美国），其他生化试剂均为
进口或国产分析纯产品。
2 方法
2.1 引物设计与合成
通 过 对 GenBank 中 拟 南 芥 Arabidopsis
thaliana (L.) Heynh.（Accession：NM_001203671）、
丹 参 Salvia miltiorrhiza Bunge （ Accession ：
FJ476255）、薄荷 Mentha piperita Linn. （Accession：
AF116825 ）、 金 鱼 草 Antirrhinum majus L.
（Accession：AY770406）和美丽帽柱木 Mitragyna
speciosa Korth.（Accession：JQ038374）等植物 DXR
编码基因 CDS 序列进行同源比对，找出高度保守区
段，按照相似性高和简并性低的原则，利用 Primer
6.0 生物软件设计一对简并引物（P1、P2），用于扩
增当归 DXR 片段，推测目的片段长度为 564 bp。P1：
5’-GGCTCCATTGGVACTCAGAC-3’，P2：5’-CTT-
CAGAGCATCBGCTACTTT-3’，其中 V＝G、A、C，
B＝G、T、C。
参照克隆并测序的当归 DXR 片段序列，利用
Primer 6.0 生物软件设计出一对用于 DXR 荧光定量
PCR 检测的特异引物（P3、P4），扩增长度为 112 bp。
P3：5’-GCCGATTCAGAGCATTCTGC-3’，P4：
5’-TCCACAGGCAAGTCCCTAAA-3’ 。参照当归
Actin 片段序列[16]，设计出一对荧光定量 PCR 内参
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基因检测的特异引物（P5、P6），扩增长度为 109 bp。
P5：5’-TGGTATTGTGCTGGATTCTGGT-3’，P6：
5’-TGAGATCACCACCAGCAAGG-3’。以上所有引
物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
2.2 总 RNA 的提取
当归根、茎及叶组织总 RNA 的提取参照文献
方法进行[17]，并略作修改。实验中所用到玻璃容
器、离心管和去离子水在 RNA 提取前均用焦炭酸
二乙酯（DEPC）处理，以变性灭活 RNase。具体
操作步骤如下：取 1 g 材料置于含液氮和少量石英
砂的研钵中充分研磨成粉末状。取约 1/10 的粉末
转入内含 0.9 mL 65 ℃预热的提取缓冲液的离心管
中，提取缓冲液成分包括 100 mmol/L Tris-Cl、2%
CTAB、2% PVP-360、30 mmol/L EDTA、1.5 mol/L
的 NaCl 和 2%的 β-巯基乙醇。充分振荡混匀后置
于 65 ℃水浴锅孵育 20 min，期间每 5 分钟充分振
荡 1 次。冷却至室温后，加等体积氯仿-异戊醇
（24∶1），剧烈振荡 30 s，12 000×g、4 ℃离心 10
min。水相转入另一离心管，加约 1/3 体积 10 mol/L
的 LiCl，混匀后置−20 ℃冰箱 30 min。12 000×g、
4 ℃离心 10 min，沉淀溶解于 0.5 mL 无 RNase 的
去离子水，加 0.5 mL 水饱和酚抽提 1 次，再加入
等体积氯仿-异戊醇（24∶1）抽提 1 次，12 000×g、
4 ℃离心 10 min。水相转入另一离心管，加 1/10
体积 3 mol/L pH 5.4 的醋酸钠，再加 1 体积预冷的
异丙醇，置−20 ℃冰箱 30 min。12 000×g、4 ℃离
心 10 min，沉淀悬浮于 500 μL 无 RNase 的去离子
水配制的 70%乙醇。12 000×g、4 ℃离心 10 min，
弃去上清液，沉淀干燥后溶于 50 μL 无 RNase 的去
离子水。
将提取到的总 RNA 在使用和保存之前进行检
测，使用分光光度计（Thermo BioMate 3，美国），
根据吸光度（A）值测定所提总RNA的纯度（A260/A280
在 1.8～2.0，说明 RNA 无污染）及浓度；并依照测
定出的 RNA 浓度确定下一步实验中合成 cDNA 所
需模板的用量，未使用的 RNA 保存于−80 ℃超低温
冰箱；采用非变性琼脂糖凝胶电泳方法判断总 RNA
的完整性。
2.3 cDNA 模板合成和 PCR 扩增
按照试剂盒说明书，以当归叶片总 RNA 合成
cDNA，然后以 cDNA 为模板进行 PCR 反应。反应
体系是在 200 μL PCR 管中加入下列组分：无菌去离
子水 35.8 μL、MgCl2（25 mmol/L）5 μL、10×PCR
缓冲液 5 μL、dNTP（2 mmol/L）1.2 μL、正反向引
物（10 μmol/L）1 μL、cDNA 0.5 μL 和 Taq DNA
polymerase（5 U/μL）0.5 μL，总体积为 50 μL。反
应程序：95 ℃预变性 3 min；95 ℃变性 30 s、56 ℃
退火 30 s、72 ℃延伸 60 s，30 个循环；最后 72 ℃
延伸 10 min，4 ℃结束，PCR 扩增产物进行 1.5%琼
脂糖凝胶电泳，用凝胶-化学发光成像系统（Bio-Rad
CHEMI DOC XRS，美国）检测。目的片段回收和
纯化按照回收试剂盒说明书进行。
2.4 阳性克隆的筛选、鉴定及测序
DNA 片段与 T 载体连接体系包括：T4 DNA 连
接酶的 2×连接缓冲液 5 μL、pGEM-T Easy 载体 0.5
μL、纯化的 PCR 产物 1.2 μL（加入量以 PCR 产物-
载体物质的量比1∶1估算）、T4 DNA连接酶0.8 μL，
无菌去离子水补充至 10 μL，4 ℃连接过夜。连接产
物全部加入到 100 μL 置于冰上的感受态 E. coli
DH5α细胞中，冰浴 20 min；42 ℃热激 50 s；冰浴
2 min。加入 900 μL 平衡至室温的液体 LB 培养基，
摇菌 1.5 h（37 ℃，150 r/min）。取 100 μL 菌液涂布
于含有氨苄青霉素的 LB 固体培养基上，37 ℃培养
过夜。次日挑选单菌落，进行菌落 PCR 检测，阳性
克隆接种于含氨苄青霉素的液体培养基培养（37
℃，150 r/min），培养过夜后装入菌种保藏管送生工
生物工程（上海）有限公司测序。
2.5 序列的生物信息学分析
利用NCBI网站Blast工具进行基因序列同源性
比对，序列的翻译和氨基酸序列同源性比对及作图
等在 DNAMAN 6.0 生物软件中进行，序列保守区分
析 在 NCBI 网 站 Conserved Domain Database
（CDD）中进行。
2.6 DXR 在当归植株组织中的特异表达
采用实时荧光定量 PCR（Bio-Rad CFX96，美
国）测定 DXR 在当归植株组织中的特异表达。分别
称取约 0.1 g 当归根、茎、叶组织提取总 RNA，每
个组织重复 3 次，然后用分光光度计测定浓度，计
算并量取总 RNA 约 100 ng。按试剂盒说明书进行
cDNA 的第一链合成，将 cDNA 用无菌去离子水稀
释至 30 μL 后取 1 μL cDNA 作为模板进行荧光定量
PCR，每个 cDNA 模板做 3 管重复。反应体系：在
200 μL PCR 管中加入无菌去离子水 7.4 μL、
2×qPCR mix 10 μL、正反向引物（10 μmol/L）0.8
μL、cDNA 1 μL，总体积为 20 μL。反应程序：95 ℃
预变性 3 min；95 ℃变性 15 s、60 ℃退火 30 s、72 ℃
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延伸 30 s，40 个循环。荧光采集时间在 72 ℃延伸
步骤，扩增完成后利用 PCR 仪自带的程序进行溶解
曲线测定。求取 3 个平行管的平均 Ct值，采用 2−ΔΔCt
分析方法对 DXR 进行相对定量表达分析。
2.7 统计与分析
所有数据采用SPSS 16.0软件进行统计和分析。
根、茎、叶间 DXR 相对表达量差异性利用 ANOVA
分析，数据通过 LSD 检验。
3 结果与分析
3.1 总 RNA 的提取及检测
采用非变性琼脂糖凝胶电泳法对当归不同组织
总 RNA 进行检测，结果显示：28 S rRNA 和 18 S
rRNA 条带清晰，没有其他杂质条带（图 1），说明
提取的叶片总 RNA 的完整性较好；经分光光度计
测定 A260/A280 平均值为 1.98，表明总 RNA 的纯度
较高，可用于 cDNA 制备和 PCR 扩增。

M-Marker RNA-叶片总 RNA
M-Marker RNA-Total RNA from leaves
图 1 叶片总 RNA 非变性琼脂糖凝胶电泳
Fig. 1 Nondenaturing agrose gel electrophoresis of total
RNA from leaves
3.2 RT-PCR 扩增
以当归叶片总 RNA 反转录所得到的第一链
cDNA 为模板，用 DXR 简并引物 P1 和 P2 进行 PCR
扩增。经检测，扩增产物在 500～750 bp 处有一条
亮带（图 2），与目的片段大小基本一致，推测为
DXR 片段，需要进一步测序鉴定。
3.3 阳性克隆的筛选、鉴定及测序
将回收纯化的目的片段连接到 pGEM-T Easy
克隆载体上，转化 Escherichia coli DH5α，从转化的
平板上随机挑取 5 个克隆并进行菌落 PCR 扩增，经
检测 1～5 号克隆扩增出大小约为 500～750 bp 的亮
条带，与 RT-PCR 结果一致，可能为阳性克隆，然
后将阳性克隆进行菌液培养并进行测序，测得一段

M-Marker 1～2-RT-PCR 产物
M-Marker 1—2-RT-PCR products
图 2 RT-PCR 产物琼脂糖凝胶电泳
Fig. 2 Agrose gel electrophoresis of RT-PCR products
长度为 564 bp 的序列，将该基因序列在 NCBI 网
站的 GenBank 数据库中注册，登陆号为 KJ000259。
3.4 序列分析
对克隆得到的基因片段进行初步的序列分析，
其编码 187 个氨基酸（图 3）。Blast比对结果显示该
序列与NCBI基因库中海岛棉Gossypium barbadense
L. 等 6 个植物物种DXR核苷酸序列的相似性在
80%以上（表 1），将推测的当归的DXR片段的氨基
酸序列和其他植物DXR的氨基酸序列进行多重比
较，结果发现完全一致的氨基酸多达 150 个，占总
氨 基 酸 数 的 80% ， 其 与 海 岛 棉 、 杭 白 菊
Chrysanthemum morifolium (Ramat.) Tzvel.、黄花蒿
Artemisia annua L.、紫茎泽兰Ageratina adenophora
(Spreng.) King & H. Rob.、杜仲Eucommia ulmoides
Oliv. 和蓖麻Ricinus communis L. 的氨基酸序列相
似性分别为 92.02%、86.17%、86.17%、85.64%、
90.96%和 88.83%（图 4），这表明本实验所克隆到
的基因片段为当归DXR片段，并将其命名为AsDXR，
将所编码的肽段命名为AsDXR。进一步对AsDXR
进行保守结构域分析，结果显示其为DXR的保守区
域，1～120 AA为DXP_reductoisom蛋白超家族
（ cl03657 ）序列区域， 130 ～ 187 AA 为部分
DXP_redisom_蛋白超家族（pcl07165）序列区域，
这 2 个保守结构域均在NADPH的存在下催化DXP
转化成MEP，为DXR的功能结构域[7]。
3.5 DXR 在当归植株组织中的特异表达
总 RNA 的非变性琼脂糖凝胶电泳结果表明，
根、茎、叶组织中总 RNA 的 28 S 条带和 18 S 条带
亮度相当（图 5），说明反转录总 RNA 浓度基本相
同。实时荧光定量 PCR 扩增曲线显示，对 Actin 和

28 S
18 S

5 S
-
-
-
-
-
-
-
-
M 1 2
8 000 bp
5 000 bp
3 000 bp
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
M RNA
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图 3 当归 DXR 片段的核苷酸序列及推测的氨基酸序列
Fig. 3 Nucleic acid sequence and deduced amino acid sequence of DXR fragment from A. sinensis
表 1 当归与部分植物 DXR 片段核苷酸序列相似性比对
Table 1 Similarity companison of DXR fragment nucleic acid sequences in A. sinensis and other plant species
物种名 相似度 / % 登录号
海岛棉 Gossypium barbadense 84 EF051345
杭白菊 Chrysanthemum morifolium 83 AB205045
黄花蒿 Artemisia annua 82 AF182287
紫茎泽兰 Ageratina adenophora 82 FJ752422
杜仲 Eucommia ulmoides 82 JX458820
蓖麻 Ricinus communis 81 XM_002511353

当归
海岛棉
杭白菊
黄花蒿
紫茎泽兰
蓖麻
Consensus g
G
G
G
G
G
G
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图 4 当归与部分植物 DXR 片段氨基酸序列相似性多重比较
Fig. 4 Multiple comparison of amino acid sequence of DXR fragment in A. sinensis and other plant species
当归
海岛棉
杭白菊
黄花蒿
紫茎泽
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当归
海岛棉
杭白菊
黄花蒿
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当归
海岛棉
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海岛棉
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中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 13 期 2014 年 7 月

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M-Marker 1-叶 2-茎 3-根
M-Marker 1-leaves 2-stems 3-roots
图 5 当归根、茎、叶总 RNA 非变性琼脂糖凝胶电泳
Fig. 5 Nondenaturing agrose gel electrophoresis of total
RNA from roots, stems and leaves of A. sinensis
DXR 的扩增效率良好，Ct值在 21～28；熔点曲线分
析也充分表示扩增曲线有良好的特异性，表现为单
峰，无非特异性荧光峰，Actin 和 DXR 的熔点曲线
峰值分别出现在 86 和 84 ℃。将荧光定量 PCR 的产
物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示扩增条带大
小约为 110 bp，与目的片段大小一致，无引物二聚
体条带。
采用 2−ΔΔCt 方法分析当归根、茎、叶组织中 DXR
相对表达量，结果显示 DXR 在植株各组织中均有表
达，但以叶片中表达量最高，分别是茎和根中表达
量的 2.5 倍和 3.2 倍，差异性达到显著水平（P＜
0.01），而茎和根中表达量相当（图 6）。
4 讨论
MEP 途径是植物萜类合成的一条重要途径。许
多研究表明，DXR 是调控 MEP 途径的关键代谢酶，

不同小写字母代表显著性差异 P＜0.01
Different lower-case letters represent significant difference P < 0.01
图 6 DXR 在当归根、茎、叶中的相对表达量
Fig. 6 Relative expression levels of DXR in roots,
stems, and leaves of A. sinensis
对植物半萜、单萜、双萜和类胡萝卜素及其衍生物
的生物合成具有重要影响[4-5]。由于当归挥发油的组
分和量与萜类化合物的生物合成密切相关，因此深
入研究当归 DXR 基因功能及其调控具有重要意义。
本研究通过同源比对设计简并引物利用 RT-PCR 方
法，首次从当归叶片中扩增出 MEP 途径关键酶基
因 AsDXR。通过同源性比对，表明 AsDXR 与海岛
棉、杭白菊、黄花蒿、紫茎泽兰、杜仲、蓖麻的同
源性达 80%以上，由此可以推断 AsDXR 片段就是
当归 DXR 酶的 cDNA 片段。通过对 AsDXR 进行保
守结构域分析，显示该序列为当归DXR的保守区域，
其包含着 DXP_reductoisom 和 DXP_redisom 两个蛋
白超家族序列，因此 AsDXR 是高等植物 DXR 家族
的新成员，具有较高的保守性。当归 DXR 可能参与
到当归 MEP 萜类的生物合成途径，但其是否只有一
个基因家族，表达产物的亚细胞定位、结构及特性
等功能还有待于进一步研究。
通过 RT-qPCR 方法对 DXR 在当归叶、茎和根
组织中的表达分析发现，DXR 在当归叶、茎和根组
织中均有表达，但表达水平有明显差异，其中以叶
片中的表达量最高。这可能与 MEP 途径是定位于
质体中的萜类代谢途径和当归叶中含有丰富的叶绿
体、叶绿素、类胡萝卜素有关[18]。未来的研究方向
应该是进一步对当归 DXR 编码基因全长克隆，深入
研究其功能和当归阶段发育过程中的组织表达；同
时应探讨当归 DXR 过量表达和敲除对萜类合成的
效应，以及重要胁迫因子对其表达的调控效应，为
揭示当归药材品质形成及种质遗传改良提供新的研
究思路。
参考文献
[1] 丁 毅. 炮制对当归挥发油及多糖的影响 [J]. 时珍国
医国药, 2004, 15(8): 496-497.
[2] 杜俊蓉, 白 波, 余 彦, 等. 当归挥发油研究新进展
[J]. 中国中药杂志, 2005, 30(18): 1400-1406.
[3] 裴 媛, 谭初兵, 徐为人, 等. 当归苯酞类和萜类成分
作用的虚拟评价 [J]. 中草药, 2010, 41(6): 938-941.
[4] Yu F, Utsumi R. Diversity, regulation, and genetic
manipulation of plant mono-and sesquiterpenoid
biosynthesis [J]. Cell Mol Life Sci, 2009, 66(18):
3043-3052.
[5] Vranová E, Coman D, Gruissem W. Network analysis of
the MVA and MEP pathways for isoprenoid synthesis [J].
Annu Rev Plant Biol, 2013, 64: 665-700.
M 1 2 3
2 000 bp
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中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 13 期 2014 年 7 月

·1913·
[6] Eisenreich W, Rohdich F, Bacher A. Deoxyxylulose
phosphate pathway to terpenoids [J]. Trends Plant Sci,
2001, 6(2): 78-84.
[7] Rohmer M. The discovery of a mevalonate-independent
pathway for isoprenoid biosynthesis in bacteria, algae and
higher plants [J]. Nat Prod Rep, 1999, 16(5): 565-574.
[8] Roelofs A J, Jauhiainen M, Mönkkönen H, et al.
Peripheral blood monocytes are responsible for γ δ T cell
activation induced by zoledronic acid through
accumulation of IPP/DMAPP [J]. Br J Haematol, 2009,
144(2): 245-250.
[9] Takahashi S, Kuzuyama T, Watanabe H, et al. A
1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase catalyzing
the formation of 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate in an
alternative nonmevalonate pathway for terpenoid biosynthesis
[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95(17): 9879-9884.
[10] Souret F F, Weathers P J, Wobbe K K. The mevalonate-
independent pathway is expressed in transformed roots of
Artemisia annua and regulated by light and culture age
[J]. In Vitro Cell Devpl, 2002, 38(6): 581-588.
[11] Yan X, Zhang L, Wang J, et al. Molecular characterization
and expression of 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate
reductoisomerase (DXR) gene from Salvia miltiorrhiza [J].
Acta Physiol Plant, 2009, 31(5): 1015-1022.
[12] Dudareva N, Andersson S, Orlova I, et al. The
nonmevalonate pathway supports both monoterpene and
sesquiterpene formation in snapdragon flowers [J]. Proc
Natl Acad Sci USA, 2005, 102(3): 933-938.
[13] Kim S M, Kuzuyama T, Chang Y J, et al. Identification of
class 2 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase and
1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase genes
from Ginkgo biloba and their transcription in embryo
culture with respect to ginkgolide biosynthesis [J]. Planta
Med, 2006, 72(03): 234-240.
[14] Veau B, Courtois M, Oudin A, et al. Cloning and
expression of cDNAs encoding two enzymes of the MEP
pathway in Catharanthus roseus [J]. Biochim Biophys
Acta, 2000, 1517(1): 159-163.
[15] Wungsintaweekul J, Sirisuntipong T, Kongduang D, et al.
Transcription profiles analysis of genes encoding 1-
deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase and 2-C-methyl-
D-erythritol-4-phosphate synthase in plaunotol biosynthesis
from Croton stellatopilosus [J]. Biol Pharm Bull, 2008,
31(5): 852-856.
[16] 吴永娜, 胡 静, 王引权, 等. 当归肌动蛋白基因片段
的克隆及序列分析 [J]. 中草药 , 2012, 43(12):
2485-2489.
[17] Pandit S S, Mitra S S, Giri A P, et al. A quick method for
isolating RNA from raw and ripe fleshy fruits as well as
for co-isolating DNA and RNA from polysaccharide and
polyphenol-rich leaf tissues [J]. J Plant Biol, 2007, 50(1):
60-64.
[18] 王惠珍, 张新慧, 李应东, 等. 轮作与连作当归光合特
性和挥发油的比较 [J]. 草业学报, 2011, 20(1): 69-74.