全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 6 期 2014 年 3 月 ·801·

• 药理与临床 •
三七抗增殖作用的有效成分筛选及机制研究
高 洁 1*，张楠楠 2，韩彦琪 1，李红艳 3，邹敏杰 3，侯媛媛 1，白 钢 1
1. 南开大学药学院，天津 300071
2. 天津中医药大学，天津 300193
3. 天津嘉氏堂科技有限公司，天津 300457
摘 要：目的 筛选三七抗瘢痕成纤维细胞（human hypertrophic scar fibroblasts，HSF）增殖作用的有效成分并研究其作用
机制。方法 采用索氏提取法将三七药材按照极性依次提取；以 MTS 法筛选其中具有较好抗 HSF 增殖作用的提取物，结合
流式细胞仪检测其对细胞周期的影响；进一步采用 HPLC 对其有效成分进行谱效分析，将其中高活性成分进行
UPLC-Q/TOF-MS 鉴定及验证，通过反向对接技术预测有效成分的抗增殖作用机制。结果 三七醋酸乙酯提取部位有较高
的抗 HSF 细胞增殖活性（P＜0.01），能显著增加 G0/G1期细胞的比例（P＜0.01），降低增殖指数（proliferation index，PI）
（P＜0.01），其中主要活性成分为皂苷类化合物；以人参皂苷 Rh1 和人参皂苷 Rg1 为例的验证结果显示，这 2 种成分均能抑
制细胞的增殖且呈剂量依赖性。反向对接预测结果显示，皂苷类化合物可能通过 MAP2K1、MAPK14、HRAS 等靶点作用于
抗 HSF 细胞增殖相关信号通路。结论 三七醋酸乙酯提取物对瘢痕成纤维细胞增殖有抑制作用，主要成分为其中的皂苷类
化合物，其作用机制可能与调节 MAPK、黏着斑等信号通路有关。
关键词：三七；瘢痕成纤维细胞；谱效分析；UPLC-Q/TOF-MS；反向对接
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)06 - 0801 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.06.012
Screening of constituents with antiproliferative activity in Panax notoginseng
and their underlying mechanisms
GAO Jie1, ZHANG Nan-nan2, HAN Yan-qi1, LI Hong-yan3, ZOU Min-jie3, HOU Yuan-yuan1, BAI Gang1
1. College of Pharmacy, Nankai University, Tianjin 300071, China
2. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China
3. Tianjin Jiashitang Technology Co., Ltd., Tianjin 300457, China
Abstract: Objective To screen the components with potent antiproliferative effects on human hypertrophic scar fibroblasts (HSF) in
Panax notoginseng and to explore their mechanisms. Methods The Soxhlet extraction method was used to obtain the different
extracts from P. notoginseng by solvents with different polarities. MTS method was used to screen the ingredients with antiproliferative
activity on HSF and flow cytometry was used to detect their influence on cell cycle. Then, spectrum-activity relationship of the active
ingredients was analyzed by HPLC. UPLC-Q/TOF-MS was used to identify the ingredients with obvious activity. The antiproliferative
mechanism was predicted by reverse docking. Results The ethyl acetate extract of P. notoginseng showed higher antiproliferative
activity (P < 0.01), significantly increased the proportion of cells in G0/G1 phase (P < 0.01), and reduced the proliferation index (PI)
(P < 0.01). The main active components were saponins. The result of confirming experiment showed that ginsenosides Rh1 and Rg1
could inhibit the cell proliferation in a dose-dependent manner. Results of reverse docking indicated the antiproliferative effects might
be related to the regulation of some target proteins such as MAP2K, MAPK14, and HRAS, as well as the related pathways. Conclusion
The ethyl acetate extract of P. notoginseng shows the antiproliferative activity on HSF, and the antiproliferative ingredients are
saponins. The underlying mechanisms might be related with the regulation of MAPK and focal adhesion signaling pathways.
Key words: Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen; hypertrophic scar fibroblast; spectrum-activity relationship; UPLC-Q/TOF-MS;
reverse docking

收稿日期：2013-09-10
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81173638，81102835，81001682）
*通信作者 高 洁（1981—），女，讲师，研究方向为中药药理。Tel: (022)23506930 E-mail: gaojie@nankai.edu.cn
·802· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 6 期 2014 年 3 月

传统中药三七为五加科植物三七 Panax
notoginseng (Burk.) F. H. Chen 的干燥根或根茎，具
有散瘀止血、消肿定痛的功效，临床应用非常广泛，
研究证实三七提取物可改善心肌缺血[2]、调血脂[3]、
降血压[4]、抗血栓[5]等，并具有较好的抗纤维化[6]
作用。然而，三七抗纤维化作用的物质基础仍未十
分明确，本研究以抗瘢痕成纤维细胞（HSF）增殖
为导向，研究三七不同溶剂提取物的抗纤维化作
用，寻找其抗 HSF 增殖的物质基础，并探讨其可能
的作用机制。
1 材料
1.1 药材与试剂
三七，购自天津中医药大学第一附属医院，经
天津药物研究院张铁军教授鉴定为五加科植物三
七 Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen 的干燥根；
氢化可的松注射液（批号 1006281）天津药业焦作
有限公司；人参皂苷 Rh1（质量分数＞98%），购于
天津马克生物技术有限公司；人参皂苷 Rg1（质量
分数＞98%），购于四川维克奇生物科技有限公司；
DMEM 高糖培养基（美国 Hyclone 公司）；特级胎
牛血清（FBS，以色列 Biological Industries 公司）；
胰蛋白酶（美国 Gibco 公司）；MTS（美国 Promega
公司）；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（南京建成生
物工程研究所）；碘化丙啶（PI）、RNase A（美国
Sigma 公司）；HE 染色试剂盒（上海碧云天生物技
术有限公司）。
1.2 细胞
HSF，上海拜力生物技术有限公司
1.3 仪器
Agilent 1200 高效液相色谱仪（美国 Agilent 公
司）；Waters UPLC-Q-TOF Primer 串联质谱仪（美
国 Waters 公司）；Masslynx 工作站（Waters 公司）；
BD FACS Calibur 流式细胞仪（BD 公司）；生物安
全柜（ESCO 公司）；HF151UV 二氧化碳细胞培养
箱（Heal Force 公司）；倒置生物相差显微镜（重庆
奥特光学仪器公司）；酶标仪（美国 Bio-Rad 公司）。
2 方法
2.1 三七药材的分段提取
取三七药材 20 g，粉碎，采用索氏提取法依
次用 200 mL 的石油醚、氯仿、醋酸乙酯、饱和正
丁醇和水回流提取 2 次，每次 5 h，各提取液分别
回收溶剂至膏状，真空干燥后备用。分别得到石
油醚提取物 0.53 g（提取率为 2.65%）、氯仿提取
物 0.13 g（提取率为 0.65%）、醋酸乙酯提取物 0.40
g（提取率为 2.00%）、正丁醇提取物 1.31 g（提取
率为 6.55%）以及水提取部位 0.92 g（提取率为
4.60%）。
2.2 HSF 细胞增殖抑制率的测定
将对数生长期的HSF细胞用 0.25%胰蛋白酶消
化重悬于 DMEM 高糖培养基（含 10% FBS、100
U/mL 的青霉素和链霉素）中，计数，调整细胞浓
度为 5×104/mL，接种于 96 孔培养板，每孔 100 μL，
5% CO2、37 ℃培养 12 h 后更换含药培养基。实验
分为对照组（含 1% FBS 的 DMEM 高糖培养基），
阳性对照药氢化可的松组（200 μg/mL，加与对照
组相同的培养基）、三七各溶剂提取物组（50
μg/mL，加与对照组相同的培养基），每组设 6 个复
孔，各溶剂提取物均用 DMSO 助溶，且 DMSO 终
体积分数小于 0.1%。培养 24 h 后，取上清备用，
每孔加入 MTS 溶液，5% CO2、37 ℃细胞培养箱
中继续培养 4 h 后，在酶标仪上测定 490 nm 处吸
光度（A）值，并计算增殖抑制率（增殖抑制率＝
1－A 样品/A 对照）。
2.3 HSF 细胞上清液 LDH 活性的测定[7]
取“2.2”项各组细胞的培养基，按 LDH 试剂
盒（酶标法）说明书进行，于 450 nm 处测定 A 值，
计算 LDH 的活性。
2.4 流式细胞仪分析细胞周期
细胞处理及给药同“2.2”项。细胞分为对照组
（含 1% FBS 的 DMEM 高糖培养基）、阳性药氢化
可的松组（200 μg/mL，加与对照组相同的培养基）、
三七醋酸乙酯提取物组（50 μg/mL，加与对照组相
同的培养基），加药后继续培养 24 h，收集各组细
胞，PBS 冲洗 2 次，70%乙醇−20 ℃固定过夜，PBS
洗涤离心去上清，先加 2.5 μL RNaseA（10 mg/mL），
再加 2.5 μL PI 染液（10 mg/mL），轻轻吹匀，37 ℃
孵育 30 min 后，用 BD FACS Calibur 流式细胞仪检
测，并采用 CELLQUEST 软件对结果进行分析，计算
各期细胞百分率及增殖指数 [PI，PI＝ (S＋G2/M) /
(G0/G1＋S＋G2/M)]。
2.5 抗 HSF 细胞增殖药效成分的分析及鉴定
上述实验结果表明三七醋酸乙酯提取物有较
强的抑制 HSF 细胞增殖的作用，故对其进行成分分
析。取三七醋酸乙酯提取物以色谱甲醇溶解，经 0.22
μm 微孔滤膜滤过后，按以下条件进行 HPLC 分离，
并同时按时间富集流出液于深孔板中，真空干燥
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 6 期 2014 年 3 月 ·803·

后，按照“2.2”项方法进行细胞增殖抑制作用分析，
并对较高活性成分段进行 UPLC-Q/TOF-MS 鉴定。
HPLC 条件：Aglient Zorbax SB-C18 色谱柱（250
mm×4.6 mm，5 μm）；流动相水（A）-乙腈（B）；
二元梯度洗脱：0～10 min，5%～30% B；10～15
min，30%～55% B；15～30 min，55%～90% B；
30～35 min，90%～100% B；35～44 min，100% B；
44～45 min，100%～5% B；体积流量 1 mL/min；
检测波长 203 nm；柱温室温；进样量 100 μL。
质谱条件：Waters UPLC/Q-TOF-MS 串联质谱
仪，扫描方式：负离子；扫描范围（m/z）为 50～
2 000；毛细管电压为 3 kV（负模式）；锥孔电压 30
V；脱溶剂气为氮气，脱溶剂温度 300 ℃，脱溶剂
气体积流量 600 L/h；锥孔气流量 50 L/h，源温 100
℃；Q-TOF 扫描率 0.1 s，内扫描延时 0.02 s；数据
采集工作站为 MassLynx 4.1。
2.6 有效成分抗 HSF 细胞增殖的验证
2.6.1 对 HSF 增殖的影响 按“2.2”项方法进行，
实验设对照组（含 1% FBS 的 DMEM 高糖培养基）、
阳性药氢化可的松组（200 μg/mL，加与对照组相
同的培养基）、三七醋酸乙酯提取物组（50 μg/mL，
加与对照组相同的培养基），人参皂苷 Rh1 组（500、
250、100 μg/mL，加与对照组相同的培养基）和人
参皂苷 Rg1组（500、250、100 μg/mL，加与对照组
相同的培养基），MTS 测各给药组对 HSF 细胞增殖
抑制率。
2.6.2 HE 染色观察 HSF 细胞形态 细胞处理方法
同“2.6.1”项，实验设对照组、氢化可的松组、三
七醋酸乙酯提取物组、人参皂苷 Rh1（250 μg/mL）
组和人参皂苷 Rg1（250 μg/mL）组，培养结束后按
HE 染色试剂盒说明书对各组细胞进行染色，于显
微镜下观察细胞形态。
2.7 有效成分的反向对接与靶点预测
将“2.5”项中鉴定的药效成分立体结构通过
PharmMapper Server 网站进行反向对接，预测其可
能作用靶点[8]，并利用 Kyoto Encyclopedia of Genes
and Genomes（KEGG）通路数据库进行通路分析，
预测抗成纤维细胞增殖的机制。
2.8 统计学分析
实验数据均以 ±x s 表示，应用 SPSS 13.0 软件
进行统计学分析。两组间数据比较采用 t 检验，多
组间数据比较采用单因素方差分析（One-way
ANOVA）。
3 结果
3.1 三七各溶剂提取物抗 HSF 细胞增殖作用
细胞增殖实验表明，三七石油醚、氯仿和醋酸
乙酯提取物均能抑制 HSF 细胞的增殖（P＜0.01），
但石油醚和氯仿提取物对正常细胞有毒性（LDH 活
性与对照组比较显著升高，P＜0.01），综合细胞增
殖率和 LDH 活性，三七醋酸乙酯提取物有较好的
抑制 HSF 细胞增殖的作用（P＜0.01），结果见图 1。




与对照组比较：**P＜0.01
**P < 0.01 vs control group
图 1 三七各溶剂提取物对HSF细胞增殖和LDH活性的影响
( 6=± n , sx )
Fig. 1 Effects of various extracts from P. notoginseng
on proliferation and LDH activity of HSF cells
( 6=± n , sx )
3.2 三七醋酸乙酯提取物对 HSF 细胞周期的影响
流式细胞仪分析显示，与对照组相比，氢化可
的松组和三七醋酸乙酯提取物组 G0/G1 期细胞比例
均显著增加（P＜0.01），S 期和 G2/M 期细胞比例显
著降低（P＜0.05、0.01），表明三七醋酸乙酯提取物
能明显降低 HSF 细胞的 PI（P＜0.01）。结果见图 2。
3.3 抗 HSF 细胞增殖成分的谱效分析及鉴定
采用 HPLC 法进行谱效分析的结果见图 3，13～
16 min 的组分有较好的抗增殖作用。进一步对高活
性组分进行 UPLC-Q/TOF-MS 鉴定（图 4），发现主
要含有人参皂苷 Rg1、三七皂苷 R2、人参皂苷 Rg2、
人参皂苷 Rh1等成分（表 1）。选取其中的人参皂苷
Rg1和人参皂苷 Rh1为例进行后续的验证实验。
3.4 人参皂苷 Rh1 和人参皂苷 Rg1对 HSF 细胞增
殖抑制作用的验证
MTS的研究结果显示人参皂苷Rh1和人参皂苷
Rg1 各剂量组均能明显抑制 HSF 细胞的增殖（P＜
0.01），且人参皂苷 Rh1和人参皂苷 Rg1 对细胞的抑
制作用呈现剂量依赖性（图 5-A）。HE 染色后，显
微镜下观察对照组细胞形态规则，胞核呈椭圆形或
增殖抑制率
LDH 活性
对照 氢化可 石油醚 氯仿 醋酸乙酯 正丁醇 水
的松 三七提取物

LD
H
活
性
/
(U
·L
−1
) 80
60
40
20
0
增
殖
抑
制
率
/
%

160
120
80
40
0
**
**
**
**
**
**
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与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01，下同
*P < 0.05 **P < 0.01vs control group, same as below
图 2 三七醋酸乙酯提取物对 HSF 细胞周期的影响 ( 3=± n , sx )
Fig. 2 Effect of ethyl acetate extract from P. notoginseng on cell cycle of HSF ( 3=± n , sx )



流出液时间 / min
图 3 三七醋酸乙酯提取物HPLC色谱图 (λ＝203 nm, A) 和三七醋酸乙酯提取物HPLC流出液对HSF 细胞增殖的影响 (B)
Fig. 3 HPLC of ethyl acetate extract from P. notoginseng (λ = 203 nm, A) and effects of HPLC fractions of ethyl acetate
extract from P. notoginseng on HSF proliferation (B)

图 4 三七醋酸乙酯各活性段 (13 min 和 14～16 min) 总离
子流图 (负离子)
Fig. 4 Total ion current of each active period (13 and 14—16 min)
ethyl acetate extract from P. notoginseng (negative mode)
圆形，胞体呈梭形；氢化可的松、三七醋酸乙酯提
取物、人参皂苷 Rh1 和人参皂苷 Rg1 组均出现不同
程度的细胞数量减少，细胞突起变短或缺失，细胞
质及胞核浓缩。（图 5-B）。
3.5 反向靶点对接及作用通路分析预测
反向对接的结果显示（图 6），上述活性成分据
推测与 MAP2K1、MAPK14、HRAS 等蛋白可能有
较强的结合能力，提示其能够通过与相应蛋白结合，
调节促丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein
细
胞
数

细
胞
数

细
胞
数

800
600
400
200
0
1 200
1 000
800
600
400
200
0
1 600
1 200
800
400
0
0 40 80 120 160 200 0 40 80 120 160 200 0 40 80 120 160 200
DNA 的量 (FL2-A)
三七醋酸乙酯提取物 氢化可的松对照
细
胞
比
例
/
%

80
60
40
20
0
对照
氢化可的松
三七醋酸乙酯提取物
****
**
**
**
**
*
G0/G1 期 S 期 G2/M 期 PI
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
t / min
增
殖
抑
制
率
/
%

70
50
30
10
对照氢化可
的松
**
A
B
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8
t / min
1
2 3
4
13 min 14～16 min
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 6 期 2014 年 3 月 ·805·

表 1 三七醋酸乙酯提取物中抗 HSF 增殖成分的 Q/TOF-MS 分析
Table 1 Q/TOF-MS analysis of antiproliferative ingredients in ethyl acetate extract from P. notoginseng on HSF cells
峰号 化合物 分子式 tR / min
实验值 m/z
[M＋HCOO]−
理论值 m/z MS/MS 偏差
1 人参皂苷 Rg1 C42H72O14 1.389 845.487 3 800.492 2 845 [M＋HCOO]−, 637 [M－H－Glc]−, 205 [M＋H－H2O－CO－CO]＋ 3.24
2 三七皂苷 R2 C41H70O13 3.206 815.483 9 770.481 6 815 [M＋HCOO]−, 637 [M－H－Xyl]−, 475 [M－H－Xyl－Glc]− 4.15
3 人参皂苷 Rg2 C42H72O13 3.463 829.298 0 784.497 3 829 [M＋HCOO]−, 637 [M－H－Rha]−, 475 [M－H－Rha－Glc]− −3.95
4 人参皂苷 Rh1 C36H62O9 3.533 683.435 9 638.439 4 683 [M＋HCOO]−, 475 [M－H－Glc]− 1.72



图 5 人参皂苷 Rh1和人参皂苷 Rg1对 HSF 细胞增殖 (A) 和细胞形态 (B) 的影响 ( 6=± n , sx )
Fig. 5 Effects of ginsenosides Rh1 and Rg1 on proliferation (A) and morphology (B) of HSF cells ( 6=± n , sx )


图 6 三七活性成分抗 HSF 细胞增殖作用可能的靶点通路
Fig. 6 Prospective targets and pathways involved in antiproliferative effect of active components from P. notoginseng
kinases，MAPK）、黏着斑（focal adhesion）等信号通
路，形成了复杂的调控网络而发挥抗增殖作用。
4 讨论
本研究将三七药材按溶剂极性依次提取，筛选
出三七的醋酸乙酯提取部位具有较好的抑制 HSF
细胞增殖的活性，流式细胞术检测发现其能阻断
HSF 细胞由 G0/G1 期向 S 期、G2/M 期转变，进而抑
制细胞的 DNA 合成，抑制细胞的分裂，使细胞周
期进程减缓，阻止其发生增殖，进一步证明其具有
抗 HSF 细胞增殖作用。对三七醋酸乙酯提取物进行
HPLC 谱效关系研究发现人参皂苷 Rg1、三七皂苷
R2、人参皂苷 Rg2 和人参皂苷 Rh1具有潜在的生物
增
殖
抑
制
率
/
%

50
40
30
20
10
0
对照 氢化可 三七醋酸 500 250 100 500 250 100
的松 乙酯 人参皂苷Rh1 / (μg·mL−1) 人参皂苷Rg1 / (μg·mL−1)
对照 氢化可的松 三七醋酸乙酯
人参皂苷Rg1 人参皂苷Rh1
**
**
**
** **
**
**
B A
**
细胞增殖
·806· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 6 期 2014 年 3 月

活性。三七皂苷的抗纤维化活性已经被报道，林丽
等[9]通过三七皂苷干预人肾小管上皮细胞，发现三
七皂苷可以抑制细胞转化生长因子-β1（TGF-β1）和
纤维连接蛋白的表达，从而抑制细胞外基质的形成，
有效地防治肾间质纤维化的发生。韦颖等[10]研究发
现三七皂苷可明显抑制人肾成纤维细胞的增殖及 I
型胶原的分泌，明显降低细胞整合素 β1 的表达，表
明三七皂苷可成为防治肾间质纤维化的药物。董向
前等[11]在三七总苷及其部分单体对四氯化碳致大
鼠肝纤维化模型的治疗中发现人参皂苷 Rg1 和三七
总苷具有抗肝纤维化的作用。本研究中鉴定的活性
成分与文献结果较为一致。
利用PharmMapper和KEGG等生物信息学手段
对三七活性成分的预测分析结果显示其可能通过
MAP2K1、MAPK14、HRAS 等 7 个主要靶点作用
于抗细胞增殖的 MAPK、黏着斑等信号通路。MAPK
信号通路参与包括细胞的形成、运动、凋亡、分化
及生长增殖等细胞的多种生理过程，包括胞外信号
调节激酶（ERKs）、p38 MAPK 和 JNK 等 3 条通路。
有研究表明，三七总皂苷可以明显抑制 PDGF 诱导
的 ERK 磷酸化，其抑制人血管平滑肌细胞（VSMC）
的增殖与 ERK/MAPK 信号通路有关[12]。此外，研
究发现三七总皂苷可以抑制人 PC-3 细胞的增殖，
其机制可能与 p38/MAPK 有关[13]。Wong 等[14]研究
认为，促进创伤的修复和预防瘢痕组织的过度增生
是 MAPK、黏着斑等相互关联形成复杂信号网络共
同调控的过程。这些报道与本研究中的对接结果基本
一致。前期工作证实了这种预测方法的正确性[15-16]，
故未在本研究中对预测的靶点及通路进行验证，后
续研究将完善对预测结果的验证。
本研究关于三七醋酸乙酯提取物对 HSF 增殖的
抑制作用及其中活性成分的明确将为三七在临床上
用于治疗增生性瘢痕提供实验依据，对通路和靶点的
预测也为今后阐明三七抗增殖的作用机制奠定基础。
参考文献
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