全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 21期 2015年 11月

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山麻黄内生菌Myrothecium roridum LLY的化学成分及其体外细胞毒活性
研究
申 丽 1，王 晶 1，李玲玉 1，张小君 1，杨长水 1，宋勇春 2
1. 扬州大学医学院，江苏 扬州 225001
2. 南京大学功能生物分子研究所，江苏 南京 210046
摘 要：目的 研究山麻黄 Ephedra equisetina 内生真菌 Myrothecium roridum LLY 固体发酵产物的化学成分，并进行体外细
胞毒活性研究。方法 采用硅胶柱、Sephadex LH-20 凝胶柱色谱和高效液相色谱法进行分离纯化，利用高分辨质谱、核磁
共振谱等方法鉴定化合物的结构。MTT 法进行化合物体外细胞毒活性筛选，并采用流式细胞术和 Western blotting 法进行化
合物细胞毒活性机制初步研究。结果 从 M. roridum LLY 固体发酵产物中分离得到 9 个化合物，分别鉴定为吩嗪-1-羧酸（1）、
1-甲氧基吩嗪（2）、N-methyl-1H-indole-2-carboxamaide（3）、甲基硫赭曲菌素（4）、ditryptophenaline（5）、7,8-二甲基异咯
嗪（6）、deoxyleporin B（7）、尿嘧啶（8）和胸腺嘧啶（9）。MTT 测定发现，化合物 3对人肝癌细胞株 SMMC-7721 增殖具
有一定的抑制活性，其 IC50值为 38.0 μg/mL，阳性对照顺铂的 IC50值为 11.5 μg/mL。细胞周期分析发现，化合物 3可导致
SMMC-7721 细胞 S 期阻滞；Western blotting 分析发现，化合物 3可使 SMMC-7721 细胞中细胞周期负调控蛋白 p27 的表达
上调，并且 Cleaved-PARP 蛋白被明显活化。结论 化合物 7为 1 个新的天然产物。化合物 3能诱导 SMMC-7721 细胞凋亡；
其对 SMMC-7721 细胞的增殖抑制作用与 S 期细胞周期阻滞相关，并受到 p27 蛋白的调控。
关键词：山麻黄；内生真菌；细胞毒活性；N-methyl-1H-indole-2-carboxamaide；deoxyleporin B
中图分类号：R284.1 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)21 - 3155 - 07
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.21.005
Chemical constituents of endophyte Myrothecium roridum LLY from Ephedra
equisetina and their in vitro cytotoxicity
SHEN Li1, WANG Jing1, LI Ling-yu1, ZHANG Xiao-jun1, YANG Chang-shui1, SONG Yong-chun2
1. Medical College of Yangzhou University, Yangzhou 225001, China
2. Institute of Functional Biomolecules, Nanjing University, Nanjing 210046, China
Abstract: Objective To study the chemical constituents of solid fementation product of endophyte Myrothecium roridum LLY from
Ephedra equisetina and their in vitro cytotoxic activity against cancer cells. Methods Isolation and purification were performed
through silica gel and Sephadex LH-20 gel filtration column chromatography as well as HPLC method, and structures of obtained
compounds were elucidated by HR-MS and NMR comparised with the data of literatures. In vitro cytotoxicity was evaluated through
MTT method and preliminary cytotoxicity mechanism was studied using flow cytometry and Western blotting. Results Nine
compounds were isolated from the solid fementation product of endophyte M. roridum, which were identified as
1-phenazinecarboxylic acid (1), 1-methoxyphenazine (2), N-methyl-1H-indole-2-carboxamaide (3), monomethylsulochrin (4),
ditryptophenaline (5), lumichrome (6), deoxyleporin B (7), uracil (8), and thymine (9), respectively. In vitro cytotoxicity assay showed
that compound 3 was cytotoxic to the human hepatoma cell line SMMC-7721 with an IC50 value of 38.0 μg/mL, while positive control
cisplatin had an IC50 value of 11.5 μg/mL. Cell cycle analysis indicated that compound 3 could delay SMMC-7721 cells in S phase and
Western blotting showed that compound 3 could up-regulate the expression of cell cycle negative regulation protein p27 and induce the
cleavage of PARP. Conclusion Compound 7 is a new natural product. Compound 3 could induce the apoptosis of SMMC-7721 cells
and the anti-proliferation activity of compound 3 to SMMC-7721 cells is related to S phase arrested and regulated by protein p27.
Key words: Ephedra equisetina Bge.; endophyte; cytotoxicity; N-methyl-1H-indole-2-carboxamaide; deoxyleporin B

收稿日期：2015-05-20
基金项目：国家自然科学基金资助项目（21372191）；江苏省自然科学基金青年基金项目（BK2013429）
作者简介：申 丽，副教授，研究方向为天然药物化学。Tel: (0514)87992233 E-mail: shenli@yzu.edu.cn
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从天然产物中筛选生物活性成分或先导化合物
是研究创新药物的有效途径之一。因微生物资源的
可再生性，越来越多的科研人员将目光转向微生物
次生代谢物，尤其是特境微生物，如海洋微生物、
植物内生菌和昆虫共生菌等的次生代谢物[1]。植物
内生菌是一种种类繁多而研究甚少的微生物，通过
共生方式，它们能在其生活史的一定阶段或全部阶
段生活于正常植物组织内。植物内生菌既能产生和
宿主植物相同或相似的活性成分[2]，也能产生与宿
主植物不同的生物活性成分[3]。植物内生菌广泛存
在于植物体内，目前研究较多的是来源于特殊生境
植物和药用植物的内生菌。
南京大学功能生物分子研究所从药用植物山麻
黄 Ephedra equisetina Bge. 中分离获得 1 株内生真
菌 Myrothecium roridum（菌株编号 LLY），本实验
对该菌株固体发酵产物粗浸膏的化学成分进行研
究，以期发现新颖、强抗肿瘤活性的化合物。通过
研究，分离纯化获得 9 个化合物，分别鉴定为吩嗪-
1-羧酸（1-phenazinecarboxylic acid，1）、1-甲氧基
吩嗪（1-methoxyphenazine，2）、N-methyl-1H-indole-
2-carboxamaide（3）、甲基硫赭曲菌素（monomethyl-
sulochrin，4）、ditryptophenaline（5）、7,8-二甲基异
咯嗪（lumichrome，6）、deoxyleporin B（7）、尿嘧
啶（uracil，8）和胸腺嘧啶（thymine，9），结构见
图 1。其中化合物 7 为新的天然产物。体外细胞毒
活性测定表明，化合物 3 对人肝癌细胞株
SMMC-7721 增殖具有一定的抑制活性。对化合物 3
进行了初步的作用机制研究，结果发现，化合物 3
能诱导 SMMC-7721 细胞凋亡，其增殖抑制作用与
S 期细胞周期阻滞相关，并受到 p27 蛋白的调控。
N
N
COOH
1
1
3
6
8
4a
9a N
N
OCH3
2
1
3 6
8
4a
9a
H
N
C
O
CH3NH
3
1
34
6
8
9
10 12
OCH3
OH
H3C HO
O
OCH3
H3CO O
4
1
3 5
7
1
2
4
6
H
N
N
H3CN
O
O
H
N
H
N
NCH3
O
OH5
3
1 10
5
7
16
17 19
24
1312
9
N
N
N
H
NH
H3C
H3C
O
O
6
3
1
5
8
6
10
13 16
22
19
23
1
6
8
17
3
4
7
12
HN
O
O
7
N
H
NH
O
O
8
5
6
9
N
H
NH
H3C
O
O
5
6

图 1 化合物 1～9的结构
Fig. 1 Structures of compounds 1—9
1 仪器与材料
AVANCE 600 型核磁共振仪；maXis 超高分辨
飞行时间质谱仪；Hitachi U-3900 紫外分光光度计；
Eppendorf 722 型紫外分光光度计；Agilent 1260 高
效液相色谱仪；P200Ⅱ高效液相色谱仪；Sinochrom
ODS-AP 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Thermo
Series IICO2细胞培养箱；Eppendorf 5475R 超速低
温离心机；SW-CJ-1F 超净工作台；Bio-Tek ELX800
多功能酶标仪；QILINBEIER 摇床；Eppendorf
centrifuge 5415D 离心机；BD FACSCalibur 流式细
胞仪；Bio-Rad JY-ZY5Western blot 电泳仪等。
人肝癌细胞株 SMMC-7721，由本实验室保存；
柱色谱硅胶（200～300 目），青岛海洋化工厂分厂；
薄层色谱硅胶（GF254），青岛海浪硅胶干燥厂；
Sephadex LH-20，瑞典 Pharmacia Biotech；色谱纯
甲醇，TEDIA 公司；氘代三氯甲烷和二甲基亚砜
（DMSO），Aldrich 公司；氘代甲醇，Cambridge
Isotope Laboratories；RPMI 1640 培养基，GIBCO
公司；胰蛋白酶，Solarbio 公司；新生牛血清，上
海洛神生物技术有限公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）
和 DMSO，Amresco 公司；顺铂，江苏豪森药业股
份有限公司；碘化丙锭（PI），上海江莱生物有限公
司；兔抗人 p27、Cleaved-PARP 单克隆抗体，Cell
Signaling 公司；羊抗人-actin 单克隆抗体，Santa Cruz
公司；山羊抗兔 IgG 抗体，北京博士德公司；脱脂
奶粉，北京普利莱公司；蛋白质 Marker，Ferments
公司；Kodak X-感光片，柯达公司；ECL 化学发光
试剂，北京普利莱公司；显影粉、定影粉，天津市
世纪奥博商贸有限公司；其余试剂均为分析纯。
菌株 LLY 是从海南山麻黄茎中分离得到的一
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株内生真菌，南京大学宋勇春博士根据其形态特征
鉴定为 Myrothecium roridum，该菌株现保存在南京
大学功能生物分子研究所。
2 方法
2.1 固体发酵产物的提取与分离
M. roridum LLY 采用固体发酵法[4]进行发酵。
固体发酵产物粉碎、晒干后，采用三氯甲烷-甲醇混
合溶剂浸提 3 次（3×10 L），减压去除溶剂得粗浸
膏 52 g。粗浸膏经硅胶柱色谱进行粗分，三氯甲烷-
甲醇（100∶0、100∶1、100∶2、100∶4、100∶8、
100∶16、0∶100）梯度洗脱得到 7 个组分 Fr. 1～7。
Fr. 1（2.0 g）经硅胶柱色谱，石油醚-丙酮梯度
洗脱，得到组分 Fr. 1-3 和 Fr. 1-4。Fr. 1-3 经 Sephadex
LH-20 凝胶柱色谱（三氯甲烷-甲醇 1∶1）及 HPLC
进一步纯化得到 0.6 mg 化合物 1（甲醇-水 42∶58；
1.0 mL/min）和 0.6 mg 化合物 2（甲醇-水 5∶5，1.0
mL/min）。Fr. 1-4 经硅胶柱色谱（石油醚-丙酮梯度
洗脱）分离、再经 Sephadex LH-20 凝胶柱色谱（三
氯甲烷-甲醇 1∶1）分离得到 Fr. 1-4-2-2；Fr. 1-4-2-2
经 HPLC（甲醇-水 72∶28，0.8 mL/min）进一步纯
化得到化合物 7（0.7 mg）。Fr. 2（6.8 g）经硅胶柱
色谱（石油醚-丙酮梯度）得到的组分 Fr. 2-3，经 2
次 Sephadex LH-20 凝胶柱色谱（三氯甲烷-甲醇 1∶
1）分离得到 Fr. 2-3-3-1 和 Fr. 2-3-3-2。Fr. 2-3-3-1
经硅胶（三氯甲烷-甲醇梯度洗脱）、Sephadex LH-20
凝胶（三氯甲烷-甲醇 1∶1）等柱色谱及 HPLC 进
一步分离纯化得到化合物 4（甲醇-水 7∶3，1.0
mL/min，7.9 mg）和 5（甲醇-水 6∶4，0.8 mL/min，
2.7 mg）。Fr. 2-3-3-2 经 HPLC 纯化得到 13 mg 化合
物 3（甲醇-水 5∶5，0.8 mL/min）。Fr. 3（2.0 g）经
硅胶柱色谱得到组分 Fr. 3-3，经 HPLC 分离纯化（甲
醇-水 3∶7，1.0 mL/min）得到化合物 6（2.3 mg）。
Fr. 4（2.3 g）经硅胶柱色谱，三氯甲烷-甲醇梯度洗
脱，得到的组分 Fr. 4-4，再经 HPLC 分离纯化（甲
醇-水 2∶8，1.0 mL/min）得到化合物 8（11.8 mg）
和 9（16.8 mg）。
2.2 MTT法检测化合物体外细胞毒活性
SMMC-7721 细胞株在含 10%新生牛血清的
RPMI 1640 培养液中，于 37 ℃、5% CO2 的 CO2
培养箱内培养至对数生长期。收集对数生长期的
SMMC-7721 细胞，以 1×104 个细胞/孔接种于 96
孔板，常规贴壁培养 24 h 后，实验组分别加入 2 μL
待测化合物（少量 DMSO 助溶，DMSO 终浓度
0.2%），阴性对照组和空白组分别加入等体积
DMSO 和培养液。培养 48 h 后，每孔加入 20 μL
MTT，继续培育 4 h。然后弃去培养液，每孔滴加
150 μL DMSO，37 ℃振荡 10 min，使结晶充分溶
解，酶标仪在波长 490 nm 处测定各孔吸光度值。
计算 IC50 值。
2.3 流式细胞术检测细胞周期
取对数生长期肿瘤细胞接种在 6 孔板中，在 37
℃、5% CO2培养箱内培养 12 h。然后每孔分别加入
等量的不同质量浓度（0.01、0.1、1、2、10 μg/mL）
化合物，干预 24 h。收集细胞，用预冷的 70%乙醇
固定细胞，4 ℃保存过夜，至少固定 18 h。上机测
试前，2 400 r/min 离心 10 min 除去乙醇，将细胞重
悬于 0.4 mL 碘化丙锭染液中（其中含 RNaseA），
37 ℃保温 30 min（碘化丙锭染液终浓度为 50
μg/mL，RNaseA 终质量浓度为 20 μg/mL），然后用
400 目网筛滤过。最后，进行流式分析，应用 ModFit
LT3.0 软件分析细胞周期中各期细胞所占总细胞的
百分率。
2.4 Western blotting法检测蛋白表达
分组与给药同“2.3”项。取加药处理后的细胞，
弃去培养液，以预冷的 PBS 洗涤 2 次，加入相应体
积的 1×SDS 蛋白裂解液，冰上放置 30 min。以刮
棒刮下细胞，沸水浴 10 min，然后 4 ℃，12 000 r/min
离心 10 min。取上清，用改良 Lowry 法进行蛋白定
量。调整样品蛋白质浓度使其相等，保证每个样品
孔蛋白上样量一致。蛋白质经 SDS-PAGE 后，转移
至 PVDF 膜上。PVDF 膜以 5%脱脂奶粉封闭 4 h 后，
加入一抗过夜。经洗涤后，再加入辣根过氧化酶标
记的二抗，室温下反应 3～4 h。每步反应结束均用
PBST 洗涤 3 次，每次 10 min。最后用 ECL 化学发
光，经曝光、显影、定影后，胶片晾干保存，扫描
后用 Image J 软件进行图像定量分析。
2.5 统计分析方法
应用 SPSS17.0 进行单因素方差分析，组间差
异用 SNK 法比较，P＜0.05 为差异有显著性。
3 结果
3.1 结构鉴定
化合物 1：淡黄色针状结晶（三氯甲烷-甲醇），
分子式 C13H8N2O2，HR-ESI-MS: m/z 225.065 5 [M＋
H]+, 247.047 5 [M＋Na]+（C13H8N2O2Na，计算值
247.048 3）, 471.106 [2M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz,
DMSO-d6) δ: 8.21 (2H, m, H-6, 9), 7.99 (1H, dd, J =
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8.4, 1.2 Hz, H-2), 7.92 (2H, m, H-7, 8), 7.81 (1H, dd,
J = 9.0, 6.6 Hz, H-3), 7.55 (1H, dd, J = 6.6, 1.2 Hz,
H-4)。以上数据与文献报道基本一致[5]，故鉴定化
合物 1为吩嗪-1-羧酸。
化合物 2：淡黄色针状结晶（三氯甲烷-甲醇），
分子式 C13H10N2O，HR-ESI-MS m/z: 211.086 1 [M＋
H]+（C13H11N2O，计算值 211.087 1）, 233.068 1 [M＋
Na]+, 443.148 3 [2M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz,
CDCl3) δ: 8.42 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-9), 8.25 (1H, d,
J = 8.4 Hz, H-6), 7.85 (3H, m, H-4, 7, 8), 7.77 (1H, t,
J = 8.4 Hz, H-3), 7.10 (1H, d, J = 7.2 Hz, H-2), 4.20
(3H, s, 1-OCH3)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3) δ:
155.3 (C-1), 144.4 (C-4a), 143.6 (C-5a), 142.3 (C-9a),
137.0 (C-10a), 130.9 (C-7), 130.6 (C-3), 130.3 (C-8),
130.2 (C-9), 129.4 (C-6), 121.6 (C-4), 106.5 (C-2),
56.6 (1-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[6-7]，
故鉴定化合物 2为 1-甲氧基吩嗪。
化合物 3：白色针状结晶（甲醇），分子式
C10H10N2O。HR-ESI-MS m/z: 175.086 8 [M＋H]+
（C10H11N2O，计算值 175.087 1）, 197.068 6 [M＋
Na]+, 371.148 7 [2M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz,
CD3OD) δ: 7.55 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-4), 7.40 (1H, d,
J = 7.8 Hz, H-7), 7.17 (1H, t, J = 7.2 Hz, H-6), 7.02
(1H, t, J = 7.2 Hz, H-5), 6.97 (1H, s, H-3), 2.90 (3H, s,
H-12)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD) δ: 164.1 (C-10),
137.5 (C-8), 131.5 (C-2), 128.3 (C-9), 124.2 (C-6),
121.9 (C-4), 120.4 (C-5), 112.3 (C-7), 103.8 (C-3),
25.7 (C-12)。以上数据与文献报道基本一致[8]，故鉴
定化合物 3为 N-methyl-1H-indole-2-carboxamaide。
化合物 4：白色粉末，分子式 C18H18O7。HR-ESI-
MS m/z: 369.094 9 [M＋Na]+（C18H18O7Na，计算值
369.090 5）, 715.199 1 [2M＋Na]+。1H-NMR (600
MHz, CDCl3) δ: 12.99 (1H, s, 2′-OH), 7.03 (1H, d, J =
1.8 Hz, H-6), 6.62 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-4), 6.46 (1H,
s, H-3′), 6.06 (1H, s, H-5′), 3.71 (3H, s, 3-OCH3), 3.69
(3H, s, 7-OCH3), 3.37 (3H, s, 6′-OCH3), 2.29 (3H, s,
4′-CH3)。以上数据与文献报道基本一致[9]，故鉴定
化合物 4为甲基硫赭曲菌素。
化合物 5：淡黄色粉末，分子式 C42H40N6O4。
HR-ESI-MS m/z: 693.317 8 [M＋H]+, 715.299 9 [M＋
Na]+（C42H40N6O4Na，计算值 715.300 9）, 731.273 9
[M＋K]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD) δ: 7.61 (4H,
t, J = 7.2 Hz, H-20, 20′, 22, 22′), 7.54 (2H, t, J = 7.2
Hz, H-21, 21′), 7.22 (4H, d, J = 7.8 Hz, H-19, 19′, 23,
23′), 7.09 (2H, t, J = 7.8 Hz, H-7, 7′), 7.02 (2H, d, J =
7.8 Hz, H-5, 5′), 6.71 (2H, t, J = 7.8 Hz, H-6, 6′), 6.62
(2H, d, J = 7.8 Hz, H-8, 8′), 5.07 (2H, s, H-2, 2′), 4.45
(2H, brs, H-15, 15′), 3.70 (2H, dd, J = 10.8, 4.8 Hz,
H-11, 11′), 3.55 (2H, d, J = 13.8 Hz, H-17a, 17′a),
3.36 (2H, overlapped, H-17b, 17′b), 3.09 (6H, s, H-24,
24′), 1.95 (2H, dd, J = 12.0, 4.8 Hz, H-12a, 12′a), 1.53
(2H, t, J = 12.0 Hz, H-12b, 12′b)；13C-NMR (150
MHz, CD3OD) δ: 167.7 (C-13, 13′), 165.6 (C-16, 16′),
152.7 (C-9, 9′), 136.1 (C-18, 18′), 130.7 (C-7, 7′),
130.51 (C-20, 20′, 22, 22′), 130.49 (C-19, 19′, 23, 23′),
129.2 (C-21, 21′), 127.8 (C-4, 4′), 126.5 (C-5, 5′),
119.2 (C-6, 6′), 110.3 (C-8, 8′), 79.9 (C-2, 2′), 64.4
(C-15, 15′), 60.5 (C-3, 3′), 59.7 (C-11, 11′), 37.5
(C-12, 12′), 37.0 (C-17, 17′), 33.2 (C-24, 24′)。以上数
据与文献报道基本一致[10-12]，故鉴定化合物 5 为
ditryptophenaline。
化合物 6：淡黄色粉末，分子式 C12H10N4O2。
HR-ESI-MS m/z: 265.069 [M＋Na]+（C12H10N4O2Na，
计算值 265.070 1）和 507.150 1 [2M＋Na]+。1H-NMR
(600 MHz, DMSO-d6) δ: 11.84 (1H, s, 3-NH), 11.67
(1H, s, 1-NH), 7.92 (1H, s, H-9), 7.71 (1H, s, H-6),
2.49 (3H, s, 7-CH3), 2.47 (3H, s, 8-CH3)。以上数据与
文献报道基本一致[13]，故鉴定化合物 6为 7,8-二甲
基异咯嗪。
化合物 7：白色粉末，分子式为 C22H25NO2。
HR-ESI-MS: m/z 336.195 6 [M＋H]+（C22H26NO2，
计算值 336.196 4）, 358.177 5 [M＋Na]+。1H-NMR
(600 MHz, CDCl3) δ: 11.22 (H, s, 2-NH), 7.41 (2H, d,
J = 7.2 Hz, H-18, 22), 7.36 (2H, t, J = 7.8 Hz, H-19,
21), 7.31 (1H, t, J = 7.2 Hz, H-20), 7.16 (1H, s, H-3),
5.74 (1H, m, H-15), 5.38 (1H, m, H-14), 4.85 (1H, dd,
J = 11.4, 8.4 Hz, H-13), 2.78 (1H, dd, J = 10.8, 3.6
Hz, H-7), 1.79～1.76 (3H, m, H-12, 11, 9), 1.73 (3H,
dd, J = 6.0, 0.6 Hz, H-16), 1.61 (2H, m, H-8, 11), 1.54
(1H, m, H-10), 1.42 (1H, m, H-10), 1.29 (1H, m, H-9),
1.01 (3H, d, J = 6.0 Hz, H-23)；13C-NMR (150 MHz,
CDCl3) δ: 164.4 (C-1), 160.3 (C-5), 134.4 (C-17),
131.0 (C-3), 130.8 (C-15), 129.5 (C-14), 129.1 (C-18,
22), 128.1 (C-19, 21), 127.0 (C-20), 115.2 (C-6), 111.6
(C-4), 78.1 (C-13), 37.1 (C-7), 36.0 (C-12), 35.9
(C-8), 35.2 (C-9), 26.5 (C-11), 20.9 (C-10), 20.5 (C-23),
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 21期 2015年 11月

·3159·
17.8 (C-16)。以上数据与文献报道基本一致[14-15]，故
鉴定化合物 7为 deoxyleporin B。
化合物 8：白色粉末，分子式为 C4H4N2O2。
HR-ESI-MS m/z: 113.036 8 [M＋H]+, 135.018 0 [M＋
Na]+（C4H4N2O2Na，计算值 135.017 0）和 247.042 2
[2M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD) δ: 7.39
(IH, d, J = 7.8 Hz, H-6), 5.62 (1H, d, J = 7.8 Hz,
H-5)。以上数据与文献报道基本一致[16]，故鉴定化
合物 8为尿嘧啶。
化合物 9：白色粉末，分子式为 C5H6N2O2。
HR-ESI-MS m/z: 127.050 6 [M＋H]+, 149.032 [M＋
Na]+（C5H6N2O2Na，计算值 149.032 7）和 275.074 8
[2M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 11.0
(1H, s, H-3), 10.6 (1H, s, H-1), 7.25 (1H, s, H-6), 1.72
(3H, s, 5-CH3)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD) δ:
167.5 (C-4), 153.8 (C-2), 139.2 (C-6), 110.5 (C-5),
12.2 (5-CH3)。以上数据与文献报道基本一致[16]，故
鉴定化合物 9为胸腺嘧啶。
3.2 化合物的体外细胞毒活性
采用 MTT 法对化合物进行体外细胞毒活性测
定，结果发现，化合物 3 对人肝癌细胞株
SMMC-7721 具有较强的细胞毒活性，其 IC50 值为
38.0 μg/mL，阳性对照顺铂的 IC50 值为 11.5 μg/mL。
3.3 化合物 3 对 SMMC-7721 细胞的细胞周期的
影响
细胞增殖受细胞周期的精密调控，为探讨化合
物 3对 SMMC-7721 细胞的增殖抑制作用是否与细
胞周期阻滞相关，采用一定质量浓度（0.01、0.1、1、
2 和 10 μg/mL）的化合物 3处理 SMMC-7721 细胞
24 h，然后收集细胞，经乙醇固定、PI 染色，然后
进行细胞周期分析。结果发现，化合物 3干预后，
SMMC-7721 细胞的 S 期细胞比例由阴性对照（NC）
的 24.33%分别增加至 27.35%、25.33%、25.88%、
26.77% 和 28.93% 。这表明化合物 3 可导致
SMMC-7721 细胞的 S 期细胞增多，即 S 期细胞周
期阻滞，但该阻滞作用较弱（图 2）。

图 2 化合物 3对 SMMC-7721细胞周期的影响
Fig. 2 Effect of compound 3 on cell cycle of SMMC-7721 cells
3.4 化合物 3对 SMMC-7721细胞的细胞周期负调
控蛋白 p27的影响
细胞增殖受细胞周期的精密调控，而 p27 是一
种重要的细胞周期负调控蛋白[17]。为探讨化合物 3
诱导 SMMC-7721 细胞周期阻滞机制，本实验采用
一定浓度（0.01、0.1、1、2 和 10 μg/mL）的化合物
3处理 SMMC-7721 细胞，24 h 后收集细胞蛋白，
采用 Western blotting 分析 p27 蛋白的量，以未加药
孔蛋白作阴性对照，β-actin 为内参。结果发现，化
合物 3 处理后，SMMC-7721 细胞中 p27 蛋白表达
均明显增加，分别为阴性对照的 1.10、1.16、1.27、
1.22 和 1.24 倍（图 3），这提示化合物 3 可能通过
G1: 71.21%
S: 24.33%
G2: 4.46%
G1: 68.23%
S: 27.35%
G2: 4.42%
G1: 68.66%
S: 25.33%
G2: 6.01%
G1: 70.94%
S: 25.88%
G2: 3.18%
G1: 63.90%
S: 26.77%
G2: 9.33%
G1: 62.45%
S: 28.93%
G2: 8.62%
1 600
1 200
800
400
0
1 200
900
600
300
0
细
胞
数

细
胞
数

1 200
900
600
300
0
细
胞
数

1 600
1 200
800
400
0
细
胞
数

1 600
1 200
800
400
0
细
胞
数

1 000
800
600
400
200
0
细
胞
数

0 30 60 90 120 150
FL2-A
0 40 80 120 160
FL2-A
0 40 80 120 160
FL2-A
FL2-A
0 40 80 120 160 0 40 80 120 160 200
FL2-A
0 40 80 120 160 200
FL2-A
阴性对照 0.01 μg·mL−1 0.1 μg·mL−1
1 μg·mL−1 2 μg·mL−1 10 μg·mL−1
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 21期 2015年 11月

·3160·

与阴性对照比较：*P＜0.05 **P＜0.01
*P < 0.05 **P < 0.01 vs negative control
图 3 化合物 3对 SMMC-7721细胞中 p27蛋白表达的影响
Fig. 3 Effect of compound 3 on expression of protein p27 in
SMMC-7721 cells
上调 p27 蛋白的表达而诱导 SMMC-7721 细胞的 S 期
阻滞。
3.5 化合物 3对 SMMC-7721细胞凋亡的影响
研究表明，细胞凋亡对细胞的增殖有负调控作
用。裂解的 PARP 通常作为凋亡的标志，因此，通
过检测裂解的 PARP 蛋白是否被活化，可以确定化
合物是否具有诱导肿瘤细胞凋亡作用。采用一定浓
度（0.01、0.1、1、2 和 10 μg/mL）的化合物 3处理
SMMC-7721 细胞，24 h 后收集细胞蛋白，用 Western
blotting 分析 Cleaved-PARP 蛋白的表达。结果发现，
化合物 3作用后 SMMC-7721 细胞的 Cleaved-PARP
蛋白被明显活化，说明化合物 3 可以诱导 SMMC-
7721 细胞凋亡（图 4）。

图 4 化合物 3对 SMMC-7721细胞中Cleaved-PARP的影响
Fig. 4 Effect of compound 3 on Cleaved-PARP in
SMMC-7721 cells
4 结论
植物内生菌广泛存在于植物体内，与宿主植物
互惠共生、协同进化，其次生代谢产物具有结构多
样性和生物学功能多样性的特点[1]，能够成为新药
先导化合物的重要来源。本研究从山麻黄内生真菌
M. roridum LLY 固体发酵产物中分离获得 8 个生物
碱和 1 个二苯酮化合物，其中化合物 7为新的天然
产物。文献表明，化合物 1具有较强的抗蜡样芽胞
杆菌 Bacillus cereus 活性（MICs＜0.5 μg/mL）[5]；
化合物 4 具有较强的抗幽门螺旋杆菌 Helicobacter
pylori 的活性（MICs＝10 μg/mL）[9]；化合物 5是
一种神经递质抑制剂[18]。本实验采用 MTT 法测定
了化合物的体外细胞毒活性，结果表明，化合物 3
对 SMMC-7721 细胞具有较强的细胞毒活性（IC50
值为 38.0 μg/mL）。进一步细胞周期分析发现，化合
物 3 可导致 SMMC-7721 细胞 S 期阻滞；Western
blotting 分析发现，化合物 3 作用后，SMMC-7721
细胞中 p27 蛋白的表达上调，并且 Cleaved-PARP
蛋白被明显活化。这说明，化合物 3 能诱导
SMMC-7721 细胞凋亡；其对 SMMC-7721 细胞增殖
的抑制作用与 S 期细胞周期阻滞相关，并受到 p27
蛋白的调控，其作用机制有待进一步深入研究。上
述研究表明，山麻黄内生真菌 M. roridum LLY 固体
发酵代谢产物具有丰富的结构多样性和药理活性多
样性，能够为进一步药理活性研究提供化合物来源。
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β-actin
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
阴性对照 0.01 0.1 1 2 10
阴性对照 0.01 0.1 1 2 10
化合物 3/(μg·mL−1)
**
相
对
表
达
量

** **
化合物 3/(μg·mL−1)
阴性对照 0.01 0.1 1 2 10
Cleaved-PARP
β-actin
化合物 3/(μg·mL−1)
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 21期 2015年 11月

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