全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 1 期 2015 年 1 月

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不同厂家香砂六君丸的 HPLC 指纹图谱研究
刘潇潇 1，戴慧贤 1，周颖仪 1，王 磊 2*
1. 广东省食品药品检验所，广东 广州 510180
2. 暨南大学药学院，广东 广州 510632
摘 要：目的 建立香砂六君丸的 HPLC 指纹图谱，考察不同厂家不同批次香砂六君丸质量的一致性，为完善该制剂的质
量评价体系奠定基础。方法 采用 HPLC 法进行测定，Sepax Bio-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，乙腈-0.1%醋酸水
溶液梯度洗脱，检测波长 260 nm，体积流量 1.0 mL/min，柱温 30 ℃，对所得各样品的指纹图谱进行整体相似度计算，并对
其共有色谱峰峰面积进行聚类分析。结果 首次建立了香砂六君丸的 HPLC 指纹图谱，标定共有峰 17 个，分别确定了其归
属药材，并通过对照品对照、UPLC-Q-TOF-MS 鉴定了 16 个色谱峰的化学成分。16 家生产企业 49 批次样品的指纹图谱相
似度分布在 0.617～0.988，通过聚类分析大致可聚为 4 类。结论 市售香砂六君丸的质量参差不齐，不同厂家样品的质量差
异较大。该方法简便、可靠，可用于香砂六君丸的质量评价，为进一步完善香砂六君丸的质量标准提供参考。
关键词：香砂六君丸；指纹图谱；质量评价；相似度；聚类分析
中图分类号：R286.02 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)01 - 0067 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.01.014
HPLC fingerprint of Xiangsha Liujun Pills from different manufacturers
LIU Xiao-xiao1, DAI Hui-xian1, ZHOU Ying-yi1, WANG Lei2
1. Guangdong Institute for Food and Drug Control, Guangzhou 510180, China
2. College of Pharmacy, Jinan University, Guangzhou 510632, China
Abstract: Objective To establish an HPLC fingerprint of Xiangsha Liujun Pills (XLP), and to apply this method to determining 49
batches of samples from 16 different manufacturers for quality evaluation, supporting the foundation of quality control system of XLP.
Methods The HPLC separation was performed on a Sepax Bio-C18 reversed-phase column in gradient mode of acetonitrile-0.1%
acetic acid with UV detection at 260 nm. The column temperature was kept at 30 ℃, and the flow rate of mobile phase was 1.0 mL/min.
The fingerprint similarities and cluster analysis based on the chromatographic peaks in detected samples were obtained. Results The
HPLC fingerprint of XLP was developed firstly. Seventeen common fingerprint peaks were indicated and attributed to raw materials,
and 16 of them were identified by comparison with reference standards and UPLC-Q-TOF-MS. The analyzed samples were
geographically classified into four classes with the similarities between 0.617—0.988. Conclusion Significant differences of quality
in XLP on the market are observed. The method is simple, reliable, and suitable for the quality control of XLP, supplying helpful
information for the comprehensive evaluation of XLP.
Key words: Xiangsha Liujun Pills; fingerprint; quality evaluation; similarity; cluster analysis

香砂六君丸收载于《中国药典》2010 年版一部，
为国家基本药物目录品种，处方来源于《太平惠民
和剂局方》，由党参、陈皮、甘草（炙）、茯苓等 10
味药组成，具有益气健脾和胃的功效，临床上用于
脾虚气滞、消化不良、嗳气食少、脘腹胀满、大便
溏泄等证[1-2]。目前香砂六君丸的使用频率较高，全
国有生产企业 85 家[3]，其药品质量受到原料药来
源、生产工艺参数等众多因素影响。为了评价该制
剂的质量一致性和产品稳定性，同时最大限度地表
征香砂六君丸的特征成分，满足中药整体性、专属
性和重现性的要求[4-5]，本研究以市售 16 个生产厂
家共 49 批次的香砂六君丸为研究对象，首次建立其

收稿日期：2014-08-13
基金项目：国家自然科学基金青年科学基金资助项目（81302654）
作者简介：刘潇潇（1982—），女，副主任药师，主要从事中药及其制剂的质量评价和标准提高工作。
Tel: (020)81886161 E-mail: cpulxx@126.com
*通信作者 王 磊，男，副研究员。Tel: (020)85223553 E-mail: cpuwanglei@126.com
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HPLC 指纹图谱，对指纹图谱中主要特征峰进行化
学成分指认以及组方中药来源的初步确定，并通过
相似度计算和聚类分析对样品进行评价，以期完善
该制剂的质量控制体系，也为进一步探讨引起其质
量差异的原因奠定基础，保证该药的质量和临床疗
效稳定。
1 仪器与试药
Agilent 1260 系列，包括四元泵、UV 检测器、
柱温箱、自动进样器、工作站；Agilent 1290 UPLC-
Q-TOF 质谱仪，包括 1290-ALS G4226A，1290-Bin
pump G4220A，1290-Column，1290-DAD G4212A，
MS Q-TOF；Sartorius CP224S、CP225D 电子天平；
Elmasonic 300H 超声波清洗器，德国 Elma 公司；
Millipore 纯水仪。
乙腈为色谱纯，德国 Merck 公司；水为纯净水，
其他试剂均为分析纯。对照品甘草苷（批号
111610-200503）、橙皮苷（批号 110721-200512）、
甘草酸铵（批号 110731-200614）均由中国食品药
品检定研究院提供。香砂六君丸，共计 16 个生产厂
家 49 批次样品，覆盖北京、天津、安徽、湖北、江
西、福建、河南、山西、广东 9 省，见表 1。党参
Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf.、陈皮 Citrus
reticulata ‘Chachi’、甘草（炙）Glycyrrhiza uralensis
Fisch. 、茯苓 Poria cocos (Schw.) Wolf 、木香
Aucklandia lappa Decne.、砂仁 Amomum villosum
Lour. var. xanthioides T. L. Wu et Senjen、炒白术
Atractylodes macrocephala Koidz.、姜半夏 Pinellia
ternata (Thunb.) Breit.、生姜 Zingiber officinale
Rosc.、大枣 Ziziphus jujuba Mill. 10 味药材均由广东
省食品药品检验所中药室刘潇潇副主任药师鉴定，
均符合《中国药典》2010 年版及相关法定标准规定，
由佛山冯了性药业有限公司提供。
表 1 样品信息
Table 1 Information of samples
序号 批号 序号 批号 序号 批号 序号 批号 序号 批号 序号 批号 序号 批号
B01 110003 B09 120001 C01 1082032 E04 111001 H02 C118030 K04 100304 N03 MC002
B02 110008 B10 120002 C02 2082024 E06 120401 H04 C118031 L01 110805 O01 110702
B03 110010 B11 120003 C08 2082025 F03 1108701 H05 C118032 L02 120301 O02 120301
B04 110011 B14 120004 D03 1008171Z F05 1204702 I03 110701 M01 111101 S01 20110701
B05 110012 B15 120006 D06 1106231Z G02 110807 I04 111001 M02 111101 T01 20091003
B06 110013 B17 120007 E02 110701 G04 120612 K01 120401 N01 MC001 U01 20110801
B07 110014 B19 120003 E03 110801 H01 C118026 K03 120402 N02 MC001 U02 20120601
1-序号中的大写字母为企业代号，同一字母代表同一企业；2-B11 和 B19，M01 和 M02，N01 和 N02 分别为同厂家同批号样品，来自不同的经营
和使用单位
1-number of capital letters for business code, the same letter on behalf of the same enterprise; 2-B11 and B19, M01 and M02, N01 and N02 with the same
batch manufacturers respectively, from different business and use units

2 方法与结果
2.1 HPLC 色谱条件
色谱柱为 Sepax Bio-C18（250 mm×4.6 mm，5
μm）；流动相为乙腈-0.1%醋酸水溶液，梯度洗脱：
0～60 min，5%～70%乙腈；检测波长 260 nm，体
积流量 1.0 mL/min；柱温 30 ℃。理论塔板数按橙
皮苷峰计，应不低于 3 000。
2.2 UPLC-Q-TOF-MS 质谱条件
色谱柱为 Agilent Eclipse Plus C18 RRHD（50
mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相为乙腈-0.1%醋酸水
溶液，梯度洗脱：0～60 min，3%～70%乙腈；检测
波长 260 nm；体积流量 0.15 mL/min。MS 分析条件：
离子源：ESI；扫描方式：正、负离子扫描；气体温
度 350 ℃；气体体积流量 8 L/min；喷雾器压力
241.325 kPa；TOF/Q-MS 质谱仪离子捕获方式：
MSI，扫描范围 m/z 100～1 700，扫描速度 m/z 1.4；
扫描源参数：毛细管电压 3 500 V，碰撞诱导解离
150 V，锥孔孔径 65 V。
2.3 溶液制备
2.3.1 对照品溶液的制备 取甘草苷、橙皮苷、甘
草酸铵对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成约
1 mg/mL 的对照品溶液，即得。
2.3.2 供试品溶液的制备 取本品适量，粉碎成细
粉，取约 5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加
入甲醇 25 mL，称定质量，加热回流 15 min，放冷，
再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm
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微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.3.3 各药材供试品溶液的制备 取党参、陈皮、
甘草（炙）、茯苓、木香等药材粉末，分别按照其在
处方中的投料量折算后取样，按“2.3.2”项下方法
制备，作为各原料药材对照溶液。
2.3.4 各药材阴性对照溶液 取按香砂六君丸处方
比例分别制备的缺各味药材的阴性样品，按“2.3.2”
项下方法制备，即得各药材阴性对照溶液。
2.4 指纹图谱方法学考察
取 B15 样品 6 份，按“2.3.2”项下方法制备供
试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，以指纹峰
的保留时间和峰面积为指标计算 RSD，考察方法的
重复性；取 B15 样品 1 份，连续进样 6 次，以指纹
峰的保留时间和峰面积为指标计算 RSD，考察方法
的精密度；取 B15 样品 1 份，在 24 h 内不同时间连
续进样检测，以指纹峰的保留时间和峰面积为指标
计算 RSD，考察方法的稳定性。重复性、精密度和
稳定性结果见表 2。结果表明，香砂六君丸指纹图
谱测定方法具有可信的精密度和重复性，供试品溶
液在 24 h 内稳定，可以获得可靠的指纹图谱。
2.5 指纹图谱的建立与共有峰的确定
分别按“2.3.2”项下方法制备 49 批香砂六君丸
的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，
表 2 指纹图谱的方法学考察
Table 2 Evaluation of fingerprint method
保留时间 RSD/% 峰面积 RSD/% 峰号 tR/min 重复性 精密度 稳定性 重复性 精密度 稳定性
1 5.328 1.7 1.0 2.8 2.0 1.5 2.7
2 6.235 2.2 1.1 2.6 2.8 2.7 3.0
3 9.347 1.8 1.9 3.2 4.5 1.7 5.3
4 13.049 2.2 2.3 1.7 2.5 2.0 3.3
5 17.267 1.6 2.3 1.4 1.4 2.2 2.4
6 19.313 1.5 2.4 2.2 3.3 3.1 3.9
7 20.718 0.8 1.7 1.2 1.1 1.0 2.5
8 24.354 1.7 1.6 2.3 3.2 2.3 3.2
9 33.685 1.9 1.2 2.3 2.1 1.7 2.8
10 37.274 2.4 2.2 1.4 1.7 1.3 3.6
11 40.941 1.9 1.5 2.0 1.9 2.4 2.9
12 42.623 2.7 1.9 2.2 4.2 2.8 4.5
13 43.473 2.2 2.4 2.8 3.7 2.7 3.0
14 49.783 1.8 1.1 2.3 3.1 2.6 3.5
15 51.063 1.7 1.9 3.1 5.1 3.4 4.2
16 53.655 1.4 2.6 2.0 2.9 1.9 3.1
17 55.784 1.2 1.8 1.6 2.5 1.3 3.2
对所测样品的指纹图谱进行数据分析，确定有 17
个色谱峰为香砂六君丸所共有，定为共有指纹峰，
且共有峰的总面积占总峰面积的 90%以上。记录 49
批香砂六君丸的 HPLC 指纹图谱色谱图，导入“中
药色谱指纹图谱相似度评价系统 2009A 版（国家药
典委员会）”，按照保留时间进行谱峰匹配后，生成
对照指纹图谱，见图 1。
2.6 指纹图谱相似度计算
将 49 批香砂六君丸的指纹图谱数据导入“中药
色谱指纹图谱相似度评价系统 2009A 版”，以 B01
的样品图谱作为相似度计算校正的参照谱，采用中
位数法生成对照图谱，计算各厂家各批次与对照指
纹图谱的相似度，结果见表 3，各厂家部分代表性
批次样品的指纹图谱见图 1。
厂家 D、F、G、I、L、M、O、S、U 的各批次
样品相似度均良好（0.891～0.988）；厂家 C、H、N
的各批次样品相似度低（0.617～0.640），但基本一
致；厂家 E、K、T 的各批次样品相似度较分散
（0.624～0.913）；厂家 B 的 13 批样品可分为 2 类，
相似度较高（0.907～0.960）的 7 批，批号为 110003、
110008、110010～110014，以及相似度较低（0.823～
0.878）的 6 批，批号为 120001～120004、120006～
120007。
2.7 指纹图谱色谱峰的确认和归属
2.7.1 原料药材归属 根据香砂六君丸的生产工
艺，除生姜、大枣水煎煮，其余 8 味药材均是粉末
入药。分别取供试品溶液，10 味药材的对照溶液
及各药材阴性样品溶液，按“2.1”项下色谱条件
测定。对保留时间一致且阴性样品图谱中未出现的
色谱峰进行分析比较，根据紫外光谱信息，对全方
与药材指纹谱中的相关峰进行归属，确认峰 1、2
归属党参药材，峰 4 归属大枣药材，峰 6、7、10、
11 归属陈皮药材，峰 3、5、8、9、12、13 归属炙
甘草药材，峰 14～17 归属茯苓药材（表 4）。其余
原料药材的色谱图在此检测条件下信息量较少，有
待进一步研究。
2.7.2 对照品法指认各色谱峰 分别吸取适当质量
浓度的甘草苷、橙皮苷和甘草酸铵对照品溶液进样
测定，通过与样品色谱图比较对照品的保留时间并
扫描对比其紫外吸收光谱，确认 5 号峰为甘草苷，7
号峰为橙皮苷，9 号峰为甘草酸铵。
2.7.3 UPLC-Q-TOF-MS 指认各色谱峰 为进一步
阐明香砂六君丸指纹图谱表征的化学成分，采用
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图 1 16 个生产厂家部分代表性批次香砂六君丸的指纹图谱 (A) 和对照指纹图谱 (B)
Fig. 1 HPLC fingerprint (A) and reference fingerprint (B) of typical batches of XLP from 16 manufacturers

表 3 各样品 HPLC 指纹图谱的相似度
Table 3 Similarities of HPLC fingerprint of each sample
序号 相似度 序号 相似度 序号 相似度 序号 相似度 序号 相似度 序号 相似度 序号 相似度
B01 0.907 B09 0.856 C01 0.640 E04 0.692 H02 0.629 K04 0.624 N03 0.636
B02 0.944 B10 0.878 C02 0.630 E06 0.897 H04 0.634 L01 0.918 O01 0.894
B03 0.929 B11 0.854 C08 0.621 F03 0.979 H05 0.638 L02 0.891 O02 0.988
B04 0.928 B14 0.871 D03 0.914 F05 0.980 I03 0.897 M01 0.985 S01 0.969
B05 0.916 B15 0.823 D06 0.908 G02 0.955 I04 0.905 M02 0.979 T01 0.810
B06 0.940 B17 0.866 E02 0.913 G04 0.934 K01 0.777 N01 0.636 U01 0.920
B07 0.960 B19 0.850 E03 0.831 H01 0.617 K03 0.847 N02 0.636 U02 0.918

UPLC-Q-TOF-MS 技术对色谱峰进行确认。由于香砂
六君丸的处方药味多，化学成分差别较大，故同时采
用正、负离子模式进行扫描。通过质谱中分子离子峰
和碎片离子峰的信息，结合紫外吸收光谱特征，与相
关文献报道[6-10]以及对照品进行对照，鉴定了香砂六
君丸指纹图谱中 16 个色谱峰，结果见表 4、图 2。
U02
U01
T01
S01
O02
O01
N03
N02
N01
M02
M01
L02
L01
K03
K01
I04
I03
H02
H01
G04
G02
F05
F03
E04
E02
D06
D03
C02
C01
B14
B09
B03
总参照
A
B
1
2
3 4
5
6
9
8
7
10
11
1213
14
15 16
17
0 10 20 30 40 50 60
t/min
0 10 20 30 40 50 60
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表 4 香砂六君丸 UPLC-MS 分析结果
Table 4 UPLC-MS analytic results of XLP
准分子离子峰 色谱峰 tR/min 归属药材 化合物 相对分子质量
[M－H]− [M＋H]+
参考文献
1 3.496 党参 党参炔苷 267 268.154 2 6
3 9.411 炙甘草 根皮酸 166 165.055 9 6
4 13.654 大枣 无刺枣苄苷 II 594 593.151 0 6
5 16.927 炙甘草 甘草苷 418 417.118 6 6-7
6 18.963 陈皮 柚皮苷 580 579.172 1 581.186 2 8-9
7 19.855 陈皮 橙皮苷 610 609.182 9 611.196 9 8-9
8 22.423 炙甘草 异甘草苷 418 417.118 8 419.133 5 7
9 33.281 炙甘草 甘草酸 822 821.392 7 823.411 0 7
10 37.589 陈皮 heptamethoxyflavone 432 433.149 8 9
11 38.743 陈皮 红桔素 372 373.128 1 9
12 38.859 炙甘草 甘草香豆素 368 367.118 9 369.133 1 7
13 43.227 炙甘草 异甘草酚 366 365.103 2 367.132 4 7
14 50.656 茯苓 16α-羟基齿孔酸 486 485.327 6 469.330 9 10
15 54.989 茯苓 多孔酸 482 481.332 2 483.347 0 10
16 63.464 茯苓 去氢茯苓酸 526 525.359 4 527.372 7 10
17 64.431 茯苓 茯苓酸 528 527.374 1 529.388 4 10




图 2 香砂六君丸样品的总离子流图
Fig. 2 Total ionic chromatogram of XLP

2.8 样品色谱数据的聚类分析
将各样品所得指纹图谱的 17 个共有峰峰面积
相对于称样量量化，运用 SPSS 18.0 软件对所有香
砂六君丸样品进行系统聚类分析。采用 Ward 法，
利用平方Euclidean距离（squared euclidean distance）
为测度，计算不同样品间相似程度，结果见图 3。
聚类分析将不同厂家的样品大致分为 4 类：第 I 类
包括厂家 L、D、G 的样品，第 II 类包括厂家 I、F、
M、O、S、B（B09～B11、B14～B15、B17、B19）
的样品，第 III 类包括厂家 U、B（B01～B07）的样
品，前 3 类样品的质量较稳定，且相似度较高（＞0.8）。
第 IV 类包括厂家 C、H、N、E、K、T 的样品，这
6 个厂家的样品相似度或较低或较分散，质量差异
性较大。同厂家的样品基本聚在同一类中，除了厂
家 B 的样品分在 2 类，与 2 种不同的生产批号一致。
聚类分析得到的样品之间的相关性，与相似度计算
得到的样品之间的相关性，结果较一致。
3 讨论
本实验以香砂六君丸《中国药典》2010 年版
标准为基础，首次建立其 HPLC 指纹图谱，标定共
有峰 17 个，确定其归属药材并指认了其中 16 个化
学成分。将建立的指纹图谱应用于 16 个生产厂家
49 批次样品的质量评价，通过相似度计算和聚类
分析，发现不同厂家香砂六君丸的质量差异较大，
现行标准的质量控制内容难以保证临床疗效稳定，
而 HPLC 指纹图谱更全面表征不同厂家药品的质
量信息，较常规检验和单个成分定量测定，更能全
面反映该制剂质量的一致性和稳定性[11-12]，对香砂
Q-TOF(−) Q-TOF(+)
0 10 20 30 40 50 60 70 0 10 20 30 40 50 60 70
t/min
17
1716 16
15
15
14
14
13
13
12
12
10
11
9
9
8
8
7
7
6
6
5
4 3 1
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图 3 聚类分析树状图
Fig. 3 Dendrogram of cluster analysis

六君丸的质量比较与评价有更积极的意义，为保证
临床用药的安全性、有效性和稳定性提供了方法和
依据。
本实验对样品前处理方法和指纹图谱色谱条件
进行了优化，对所建立的 HPLC 指纹图谱能最大限
度地表征香砂六君丸的特征成分。以 HPLC 指纹图
谱中 17 个共有峰的单位质量峰面积为指标，对不同
的提取溶剂进行了筛选，结果以甲醇提取效果较好。
在提取方法上，比较了超声与加热回流以及不同的
提取时间，结果表明，采用甲醇加热回流提取 15 min
的提取方法总峰面积较大，提取效率较高。在流动
相选择上，比较了乙腈、甲醇与水、甲酸、醋酸、
磷酸溶液等组合，最后确定以乙腈-0.1%醋酸水溶液
梯度洗脱效果最佳。在检测波长选择方面，采用
DAD 检测器于 200～400 nm 下检测样品，观察等高
线图及不同波长色谱图，结果显示在 260 nm 下检
测到的样品成分相对较多，各峰均有良好的吸收。
对所测样品的HPLC指纹图谱进行比较，厂家E、
K、T 样品指纹图谱的相似度较分散，主要考虑与样
品的生产工艺参数不稳定相关，导致生产批号相近的
样品质量差异明显。而厂家 B 的样品根据生产批号
不同恰好分为 2 类，比较色谱图发现 2 类样品主要是
来源于陈皮的峰 10 和 11 的峰面积不同，提示陈皮药
材的来源可能不稳定。另有厂家 C、H、N 样品指纹
图谱的相似度低但基本一致，与其他厂家的样品指纹
图谱比较发现，其色谱图中来源于党参的峰 1 和 2 的
量极低，提示这 3 个厂家的党参投料可能存在一定问
题。结果显示，本实验所收集的香砂六君丸中有近一
半厂家的样品质量或多或少存在问题，反映出目前市
售的香砂六君丸的质量参差不齐。
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