全 文 ：植物遗传资源学报 2008, 9(3):346-349JournalofPlantGeneticResources
蒙药材阿给(小白蒿)基因组 DNA的提取
刘　越1, 2 ,包白音通拉嘎 3 ,潘丽霞 1 ,刘敬阁4 ,张琳霞 1 ,刘立亚1 ,崔　箭 1
(1中央民族大学生命与环境科学学院 /中国少数民族传统医学研究中心 ,北京　100081;2中国农业科学院作物科学研究所
/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 /农业部作物种质资源与生物技术重点开放实验室 ,北京　100081;
3内蒙古奈曼旗蒙医医院 ,通辽　028300;4 国家中医药管理局中国中医药科技开发交流中心 ,北京　100027)
　　摘要:为获得能用于蒙药材阿给(小白蒿)RAPD分析及其他分子生物学研究的高质量 DNA,选用经典的 CTAB法 、改进的
CTAB法和高盐低 pH法提取 DNA, 研究和改进几种 DNA提取法。由于蒙药材含有大量的多糖和酚类物质 , 改进法对样品进
行了预处理:先将样品与 PVP和 VitC共研碎 ,再用 Tris-HCl缓冲液洗涤样品 , 离心的沉淀用于进行下一步操作。通过电泳 、紫
外吸收 A260nm/A280nm和 PCR扩增检测所得 DNA的产量和质量。结果表明 , 改进的 CTAB法和高盐低 pH法都能获得高质量的
DNA进行 PCR扩增 ,其中以改进的 CTAB法效果最好。
关键词:蒙药材;阿给;DNA提取
收稿日期:2008-02-19　　　　　修回日期:2008-05-16
基金项目:国家自然科学基金(30672773);国家科技基础条件平台工作(2005DKA21601-10(01));国家 “ 985”工程项目 (CUN985-3-3);中央
民族大学青年教师科研基金(CUN0239)项目资助
作者简介:刘越 ,赫哲族 ,黑龙江佳木斯人 ,博士 ,讲师 ,研究方向为民族药物遗传多样性和功能基因组学。 E-mail:lziqilziqi@yahoo.com.cn
通讯作者:崔箭 ,朝鲜族 ,黑龙江哈尔滨人 ,中央民族大学 “ 985”工程民族医药重大研究项目首席专家。Tel:010-68933254
GenomicDNAExtractionofMongolianMedicineArtemisiaFrigidaWild.
LIUYue1, 2 , BAOBai-yintonglaga3 , PANLi-xia1 , LIUJing-ge4 , ZHANGLin-xia1 , LIULi-ya1 , CUIJian1
(1ColegeofLifeandEnvironmentalScience, ChinaMinorityTraditionalMedicineCenter/CentralUniversityforNationalities,
Beijing100081;2NationalKeyFacilityforCropGeneResourcesandGeneticImprovement/KeyLaboratoryofCropGermplasm
＆Biotechnology, MinistryofAgriculture/InstituteofCropSciences, ChineseAcademyofAgriculturalSciences, Beijing100081;
3InnerMongoliaNaimanqiMongolianMedicineHospital, Tongliao028300;4NationCenterfortheDevelopmentofTraditional
ChineseMedicineTechnology, StateAdministrationofTraditionalChineseMedicineofthePeople sRepublicofChina, Beijing100027)
　　Abstract:ToextracthighqualityDNAforRAPDandothermolecularbiologyresearchfromMongolianmedi-
cineAgi(ArtemisiaFrigidaWild.), classicCTABmethod, improvedCTABmethodandlowpHmediumwithhigh
salt(LPHS)methodwereemployedforDNAextraction.BecauseoftheMongolianmedicinecontainingalarge
numberofpolyphenolsandpolysaccharides, improvedmethodsaddpretreatmentstepasthefolowing:samples
weregroundwithPVPandVitCbyusingliquidnitrogen, thenwashedbyTris-HClbufer, centrifugalsedimentation
usedforthenextoperation.TheyieldandqualityofDNAwasanalyzedbyagarosegelelectrophoresis, ratiosof
A260nm /A280nmandPCRamplification.TheresultswereshowedthatimprovedCTABmethodandLPHSmethodcan
producehighqualityDNAforPCRamplification.ImprovedCTABmethodisthebestofthethree.
Keywords:Mongolianmedicine;ArtemisiaFrigidaWild.;DNAextraction
　　阿给 [ Agi] ———冷蒿(AtremisiafrigidaWild.),
又名小白蒿 、菟毛蒿 , 为菊科蒿属的小灌木[ 1] 。阿
给为蒙医常用药 ,具有止血 、消肿之功效 ,临床上主
治各种出血 、关节肿胀 、肾热 、月经不调 、疮痛等 ,也
是蒙医上常用的 “人造圣水”组成之一 [ 2] 。小白蒿
在吉林 、河北 、辽宁 、青海 、陕西 、新疆 、甘肃 、宁夏以
及西南高山地区均有分布 ,蒙古 、西伯利亚和北美也
有分布[ 3] ,产地不同 ,其成分 、功效及药用品质有很
　3期 刘　越等:蒙药材阿给(小白蒿)基因组 DNA的提取
大差异 。随着 DNA分子标记技术的发展 ,人们已将
这一技术广泛地应用于传统药材资源 、鉴定 、栽培等
方面。而进行 DNA分子标记的关键前提是要获得
高质量的基因组 DNA。由于传统药材富含多糖 、蛋
白质 、酚类等物质 ,采用一般的方法往往难以得到理
想的 DNA。已有传统药材升麻 、石斛 、枸杞 、天麻等
相应药用部位 DNA提取的研究报道[ 4] ,尚未见有传
统蒙药材阿给 DNA提取的文献报道 ,且由于不同传
统药材的组织结构 、内部成分都有差异 ,尚无统一通
用的 DNA提取方法 ,因此 ,针对不同传统药材需要
根据其特性进行提取方法的摸索。 DNA提取方法
通常有十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法 、十二烷
基磺酸钠(SDS)法 、高盐低 pH值(LPHS)法等 ,其中
CTAB法是实验室首选的 DNA分离方法[ 5] 。本实
验采用经典 CTAB法 、改进的 CTAB法和 LPHS法对
小白蒿进行 DNA提取 ,改进法获得了满意的效果 ,
可为下游分子生物学实验的开展提供依据 。
1　材料与方法
1.1　材料
蒙药阿给购自内蒙古药材采购供应公司 ,由内
蒙古自治区中蒙医医院蒙药药房鉴定 。
CTAB、SDS、Tris碱 、EDTA、PVP、VitC、RNase、
dNTP、Taq聚合酶 、β -巯基乙醇 、SYBR GreenI等
试剂均购自鼎国生物技术有限公司 , RAPD引物购
自上海生工生物工程技术有限公司。
1.2　样品 DNA提取方法
1.2.1　经典的 CTAB法　参照经典 CTAB法 [ 6] ,
称取预先用双蒸水清洗干净的小白蒿约 1g,加液氮
多次 ,研磨成均匀的细粉 。将样品细粉移入预先在
60℃水浴中加热的含 6ml2×CTAB和 120μlβ -巯
基乙醇的 15ml离心管中 , 60℃保温 1h,每隔 10min
摇匀 1次。离心 20min(4000r/min),上清液转至新
离心管中 ,加入等体积的氯仿 -异戊醇(24∶1),上
下轻缓颠倒混匀 。离心 5min(4000r/min),转移上
清液至新离心管中 ,用等体积的氯仿 -异戊醇(24
∶1)重复抽提 ,直至上清液澄清 、中间蛋白层较少为
止 。在上清液中加入预先冷冻的 2/3倍体积的异丙
醇以沉淀核酸 ,混匀 ,于 -20℃条件下放置 30min。
4000r/min离心 10min,除去上清液 ,沉淀用 70%的
乙醇洗涤 3次 ,再用无水乙醇洗涤 3次 ,将沉淀挑出
转至 1.5ml的离心管中 ,并倒置滤纸上室温干燥 。
向离心管中加入含 2μl10mg/LRNaseA的 TE液
200μl,于 37℃水浴中消化过夜。加入冷异丙醇沉
淀 DNA, 10 000r/min离心 5min,沉淀用 70%乙醇洗
涤 3次 ,再用无水乙醇洗涤 3次 ,倒置滤纸上室温至
干燥 ,加入 200 ～ 300μlTE溶解 , 4℃保存 。
1.2.2　改进的 CTAB提取法　样品的预处理:取
0.5g样品加入 10%(w/w)PVP和 3%(w/w)VitC一
起用液氮研磨 ,磨碎后加入冰预冷的洗涤缓冲液
(100mmol/LTris-HCl, pH7.0)继 续研磨 , 冰浴
10min, 10 000r/min离心 5min,弃上清液 ,再用洗涤
缓冲液洗涤沉淀一次 ,离心后沉淀备用 。
参照李晓波等 [ 4] 的方法加以改进。取上述预
处理样品 , 加入 10倍体积的 3 ×CTAB缓冲液
(100mmol/L Tris-HClpH8.0, 20mmol/L EDTA,
1.4mol/LNaCI, 2% β -巯基乙醇 , 5% PVP, 3%
CTAB), 65℃温育 lh, 加入 l/10体积的 3mol/L
NaAC溶液 , 混匀 , 冰浴 30min, 10 000r/min离心
10min,将上清液吸人另一离心管 ,加入等体积的氯
仿∶异戊醇(24∶l)抽提 3次 ,上清液用 2倍体积的冰
预冷无水乙醇于 -20℃沉淀 30min, 15 000r/min离
心 15min,所得沉淀用 70%乙醇和无水乙醇洗涤 ,空
干沉淀。其余步骤同 1.3.1。
1.2.3　改进的 LPHS法　参照王培训等 [ 7]的方法
加以改进 。取 1.3.2预处理样品 ,加入 10倍体积的
提取缓冲液(100mmol/L醋酸钠 , 50mmol/LEDTA,
5mmol/LNaCl, 5% PVP, 3% SDS, 2% β -巯基乙
醇 , pH 5.5), 65 ℃温育 1h, 10 000r/min离心
10min,上清液加入 1/3倍体积的 5mol/LpH4.8的
KAC,冰浴 20min, 10 000r/min离心 10min,上清液
用 2倍体积的冰预冷无水乙醇于 -20℃沉淀
30min, 15 000r/min离心 15min,所得沉淀用 70%乙
醇和无水乙醇洗涤 ,空干沉淀 。其余步骤同 1.3.1。
1.3　DNA鉴定
1.3.1　DNA质量检测　取 2μlDNA液 ,加 2μl含有
SYBR GreenI染料的溴酚蓝 ,在 1%琼脂糖凝胶中进
行电泳 ,以 λDNA/HindII为分子量标记 ,用 Bio-RAD
凝胶成像分析系统扫描电泳结果 。取 1μlDNA液置
于核酸蛋白分析仪(SMA3000)上测定 A260nm及 A280nm。
1.3.2　PCR扩增检测 　以经典的 CTAB法 、改进
的 CTAB法和 LPHS法提取的样品 DNA为模板 ,进
行 RAPD-PCR(引物序列见表 2)。 25μl反应体系中
含 10×PCRbufer2.5μl(含 Mg2+), dNTP(10mmol/L)
0.5μl,引物(10μmol/L)1μl(双引物各 0.5μl), Taq
DNA聚合酶(2U/μl)0.5μl,模板 50ng, ddH2O补足
25μl。上述药品全部购自鼎国生物技术有限公司。
反应程序为:94℃ 5min;94℃ 1min, 37℃ 1min, 72℃
347
植　物　遗　传　资　源　学　报 9卷
1.5min,共 45个循环;72℃ 5min。 PCR扩增产物
10μl加 2μl含有 SYBR GreenI染料的溴酚蓝 ,在
1.5%琼脂糖凝胶上电泳 ,以 100bpladder为分子量标
记 。在凝胶成像系统上成像 、记录。
2　结果与分析
2.1　DNA纯度与质量检测
采用经典的 CTAB法不能很好地除掉材料中多
糖和多酚化合物 ,提取的 DNA呈棕褐色 ,胶冻状 ,凝
胶电泳未检测出 DNA,也无法进行紫外检测 。改进
的 CTAB法和 LPHS法能有效除去细胞内杂质 ,抑
制次生代谢物与 DNA的结合 ,所得的 DNA溶液呈
浅黄色或浅棕色 ,虽然也存在一定程度的降解 ,但仍
然可见一条约 20 kb的 DNA主带 , 其中改进的
CTAB法所提 DNA主带最亮 、最清晰(图 1)。根据
以往的研究结果 ,若提取的基因组 DNA分子量大于
10kb,则基本上符合 RAPD反应的要求 [ 8] 。采用核
酸蛋白分析仪检测的结果表明改进法提取的样品纯
度较高 , A260nm/A280nm在 1.65 ～ 1.88之间(表 1)。
表 1　不同提取法获得的阿给基因组 DNA紫外检测结果
Table1　UVtestresultforAgigenomicDNAfromdiffer-
entextraction
方法
Method
编号
No.A260nm A280nm
A260nm
/A280nm
浓度(ng/μl)
Concentration
得率(μg/g)
Yield
改进的 LPHS法 1 3.361 2.04 1.65 168.0 33.6
2 3.538 2.034 1.74 176.8 35.4
改进的 CTAB法 3 5.114 2.755 1.86 255.7 76.7
4 4.743 2.517 1.88 237.1 71.1
图 1　蒙药材阿给基因组 DNA的琼脂糖凝胶电泳图
Fig.1　AgarosegelelectrophoresisofgenomicDNA
fromArtemisiaFrigidaWilld.
M:λDNA/HindII;1～ 2:改进的 LPHS法提取的 DNA;
3～ 4:改进的CTAB法提取的 DNA
改良的 CTAB法是提取蒙药材阿给基因组 DNA
的较佳方法 ,所提取的 DNA不仅纯度高 , A260nm/A280nm
>1.80, DNA产率也较高 ,可达 70μg/g以上 ,符合分
子生物学研究要求。改良的 LPHS法虽然去除多糖 、
多酚的能力不及 CTAB强 ,所提取的 DNA纯度也不
及 CTAB法的高 ,但其 A260nm /A280nm也达到 1.70左右 ,
基本符合分子生物学的一般操作要求 ,且该法操作简
单 ,试剂便宜 ,加入 l/3倍体积的 KAC(5mol/L, pH4.8)
后即能除去大部分蛋白质 ,避免了氯仿的多次抽提 ,减
少了毒性 ,也不失为提取阿给 DNA的一种方法。
2.2　PCR扩增
采用改进法提取的样品 DNA为模板 ,用 10碱
基寡核苷酸随机引物(s266 +s19)和引物 s77进行
RAPD扩增 ,结果表明用改进的 CTAB法提取的样
品 DNA都能扩增出清晰 、稳定的条带 ,且实验结果
重复性好;改进的 LPHS法虽然也能扩增出带 ,但扩
增效果不好 ,条带模糊 ,扩增结果也不太稳定 ,经常
出现弱扩增(图 2)。利用 RAPD引物组合(表 2)对
图 2　RAPD扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig.2　Agarosegelelectrophoresisoftheresults
ofRAPDPCRamplification
1～ 4:引物(s266+s19)的扩增结果;5～ 8:引物(s77)的扩增结果;1和
5:H2O;2和 6:经典CTAB法提取的DNA;3和 7:改进的LPHS法提取
的 DNA;4和 8:改进的 CTAB法提取的DNA;M1和M2:100bpladder
表 2　RAPD扩增引物和序列
Table2　Listofprimerlabelsandprimersequences
引物
Primer
序列(5′-3′)
Primersequences(5′-3′)
总扩展条带
Totalbands
s266+s19 AGGCCCGATG+ACCCCCGAAG 4
s77 TTCCCCCCAG 3
s266+s91 AGGCCCGATG+TGCCCGTCGT 4
s266+s76 AGGCCCGATG+CACACTCCAG 3
s267+s12 CTGGACGTCA+CCTTGACGCA 2
s460+s8 ACACACGCTG+GTCCACACGG 4
s481+s9 GGGACGATGG+TGGGGGACTC 5
s253+s13 GGCTGGTTCC+TTCCCCCGCT 2
s388+s13 AGCAGGTGGA+TTCCCCCGCT 1
s64 CCGCATCTCA 4
s88 TCATGTCCAC 4
s279+s3 CAAAGCGCTC+CATCCCCCTG 2
s13 TTCCCCCGCT 1
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　3期 刘　越等:蒙药材阿给(小白蒿)基因组 DNA的提取
图 3　采用改进的 CTAB方法提取阿给 DNA的 RAPD扩增结果
Fig.3　TheresultsofRAPDamplificationfromgenomicDNAofArtemisiaFrigidaWild.
extractedbyimprovedCTABmethod
M1和 M2:100bpladder;1:s266+s91;2:s266+s76;3:s267+s12;4:s460+s8;5:s481+s9;6:s253+s13;7:s388+s13;8:s64;9:s88;10:s279+s3;11:s13
改进的 CTAB法提的 DNA进行扩增 ,尽管扩增条带
数目比从新鲜植物获得 DNA的扩增条带有所减
少 [ 9] ,但是每个引物组合均有清晰的条带(图 3),说
明完全可以用于下游分子生物学研究 。
3　讨论
CTAB是一种阳离子去污剂 [ 10-11] ,既可裂解细
胞壁 ,又能有效地沉淀多糖 ,是最常用的植物 DNA
提取方法 ,但对于富含糖类物质的蒙药材阿给(小
白蒿)单纯使用 CTAB还不能很好除去多糖 ,它们会
和蛋白质及核酸发生不可逆的结合 ,进而影响后续
的各种分子生物学操作 ,如严重抑制内切酶 、DNA
聚合酶和连接酶的活性 ,影响 DNA的溶解和浓缩
等 。因此 ,在提取阿给基因组 DNA时参照前人的方
法 ,加入 PVP和少量 VitC与材料共同研磨 , 并用
Tris-HCl洗涤样品 ,这不仅能阻止多糖 、多酚氧化物
等与 DNA的结合和反应 ,还能除去部分色素和杂
质 。在提取缓冲液中 ,加入 5% PVP和 2% β -琉
基乙醇可以防止氧化 、褐变 ,并使提取液的颜色变
浅 。郭宝林等 [ 12] 在提取丹参干叶片 DNA时加入
VitC也能使提取液的颜色变浅。因此 ,笔者认为在
提取含多酚类物质较多的传统药材 DNA时加入抗
氧化剂能有效防止氧化褐变 ,至于加入何种抗氧化
剂及加入量如何则视材料不同而异。
本研究采取了经典的 CTAB法 、改进的 CTAB
法和 LPHS法提取阿给的基因组 DNA,通过紫外检
测 、凝胶电泳及 PCR扩增表明 ,由改进的 CTAB法
和 LPHS法所提取的 DNA能满足一般分子生物学
操作要求 ,尤以改进的 CTAB法提取效果最好 ,提取
的 DNA产量最高 ,纯度最大 ,颜色最白也最易溶解;
而改进的 LPHS法虽然所提 DNA产量和纯度都不
及 CTAB法的高 ,但由于其试剂易得 、操作简单 、避
免了多次氯仿抽提 ,也不失为提取蒙药材阿给基因
组 DNA的一种方法;经典的 CTAB法则不适于提取
阿给的基因组 DNA。
致谢:感谢中国农业科学院作物科学研究所孔
秀英实验室的老师和研究生的指导与帮助。
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