全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 13 期 2015 年 7 月

• 1966 •
丹参晚期胚胎富集蛋白基因的克隆及表达模式分析
武玉翠，葛 茜，周宏骏，晋鑫鑫，王喆之*
陕西师范大学生命科学学院，药用资源与天然药物化学教育部重点实验室，西北濒危药材资源开发国家工程实验室，陕
西 西安 710062
摘 要：目的 克隆丹参晚期胚胎富集蛋白（late embryogenesis abundant protein，LEA）基因，并进行生物信息学和表达模式分析。
方法 对丹参转录组数据库进行BLAST同源性比对，发现一条新的与LEA基因家族同源性较高的序列，命名为SmLEA2，GenBank
登录号为 HQ676610。进一步利用 PCR 和 RT-PCR 技术从丹参 gDNA 以及 cDNA 水平克隆得到了 SmLEA2 基因全长。采用软件
分析蛋白质结构性质和系统进化关系。利用实时荧光定量 PCR 的方法对不同部位、不同发育时期以及不同处理丹参的 SmLEA2
表达量进行检测。结果 获得 SmLEA2 gDNA 长 1 961 bp，由 1 个外显子和 1 个内含子组成，并且内含子位于 ATG 的上游；开放
阅读框长为 960 bp，共编码 319 个氨基酸。生物信息学分析显示，SmLEA2 是存在于细胞质中的亲水蛋白，无跨膜结构域和信号
肽，其相对分子质量为 35 340，等电点为 4.77。该基因在丹参的根、茎、叶中均有表达，并且在茎中的表达量最高。随着花的成
熟和种子的发育，该基因表达量逐渐升高，并且该基因的表达受茉莉酸甲酯（MeJA）以及脱落酸（ABA）的诱导作用影响。结
论 克隆得到的丹参 SmLEA2 可能参与种子发育过程，并在丹参防御反应中发挥作用。
关键词：丹参；晚期胚胎富集蛋白；基因克隆；表达分析；茉莉酸甲酯； 脱落酸
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)13 - 1966 - 09
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.13.019
Molecular cloning and expression analysis of a late embryogenesis abundant
protein gene (SmLEA2) from Salvia miltiorrhiza
WU Yu-cui, GE Qian, ZHOU Hong-jun, JIN Xin-xin, WANG Zhe-zhi
Key Laboratory of Medicinal Resource and Natural Pharmaceutical Chemistry of Ministry of Education, National Engineering
Laboratory for Resource Developing of Endangered Chinese Crude Drug in Northwest of China, College of Life Science, Shaanxi
Normal University, Xi’an 710062, China
Abstract: Objective To clone and characterize a late embryogenesis abundant protein SmLEA2 with its promoter region from Salvia
miltiorrhiza, and to predict its probable function. Methods SmLEA2 was cloned by PCR and RT-PCR from genomic DNA and
cDNA. Protein structure and phylogenetic relationships were carried out by bioinformatic analysis. Gene expression in different organs
and different development periods was detected by qPCR. Gene expression was also detected under different treatments. Results
By analyzing the cDNA library for S. miltiorrhiza with BLAST program, one of these sequences showed a high homology with late
embryogenesis abundant (LEA) protein and was named as SmLEA2 (GenBank: HQ676610). We obtained 1 961 bp gene sequences of
SmLEA2, which contained an intron and a single opening reading frame (ORF) of 960 bp encoding 319 amino acid peptides.
Bioinformatic analysis showed that the putative SmLEA2 protein was a hydrophilic protein without signal peptides and transmembrane
domains. The SmLEA2 protein was predicted with a molecular weight of 35 340 and a theoretical isoelectric point of 4.77. SmLEA2
was expressed in the roots, stems, and leaves of S. miltiorrhiza, and the most abundant in the stems. With the development of the
flowers and seeds, its expression increased gradually. Expression of SmLEA2 could be induced by methyl jasmonate (MeJA) and
abscisic acid (ABA). Conclusion Thus, we speculate that SmLEA2 may be involved in seed development and plant defenses.
Key words: Salvia miltiorrhiza Bunge; late embryogenesis abundant protein; gene cloning; expression analysis; methyl jasmonate; abscisic acid

收稿日期：2014-12-26
基金项目：陕西省科技计划项目（2012K19-02-04）；陕西省自然科学基础研究项目（2014JQ3100）；陕西省教育厅项目（2013JK0739）；院级
科研项目（2014QNKJ079）；陕西省教育厅科学研究计划（14JK1178）
作者简介：武玉翠（1985—），女，博士在读，研究方向为植物生物技术。Tel: (029)85301260 E-mail: wuyucui224@163.com
*通信作者 王喆之，男，博士，教授，博士生导师，主要从事植物学研究。Tel: (029)85301260 E-mail: zzwang@snnu.edu.cn
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 13 期 2015 年 7 月

• 1967 •
植物在生长过程中总是受到不良环境因子的影
响，包括非生物胁迫和生物胁迫[1]。为了适应各种
胁迫植物自身逐步形成了一系列特有的形态结构特
征和生理生化机制。在逆境胁迫下，植物体内的基
因表达会发生变化，产生渗透调节物质，并且合成
一系列的胁迫诱导蛋白，其中包括晚期胚胎富集
（late embryogenesis abundant，LEA）蛋白。1981 年，
Dure 等 [2]首次在棉花种子胚胎发育后期发现了
LEA 蛋白。LEA 蛋白广泛存在于高等植物中，是
胚胎发育后期种子中高水平积累的一系列蛋白质。
LEA 基因受到干旱、脱水、盐渍、低温等胁迫因子
和脱落酸（ABA）的诱导而大量表达[3]。
LEA 蛋白是一个庞大的家族，Wise 等[4]分析了
拟南芥基因组中 51 种 LEA 蛋白，将其分为 9 个组，
有研究证实其可能与植物的各种胁迫相关[5]，并且
不同的家族成员具有不同的序列特异性和空间结构
特征，因而可通过不同的作用机制发挥作用。LEA
蛋白有分子伴侣的作用，它可以和异常或变性的蛋
白质结合防止细胞内蛋白质变性沉淀，保护敏感性
的酶。另外大多数 LEA 蛋白具高度的亲水性，能
将水分捕获到细胞内，保护细胞免受水分胁迫的伤
害[6-7]。利用转基因技术过表达 LEA 蛋白得到了一
些抗旱、耐盐植株[8-10]，为植物育种提供了新方法。
目前 LEA 蛋白的研究已经成为一个热点，对该蛋白
基因的深入研究可为揭示该家族蛋白基因的功能奠
定一定的基础。
丹参 Salvia miltiorrhiza Bunge 为唇形科
（Labiatae）鼠尾草属 Salvia L. 植物，以其干燥根
及根茎入药，在临床上被广泛应用于心脑血管疾
病、癌症以及各种炎症的治疗[11-12]。随着丹参资源
的开发和利用，丹参药材的需求量日益增长。使用
生物技术手段来挖掘丹参的抗逆基因并进一步研
究植物抗逆机制，是筛选和培育优良丹参种质的有
效策略。在前期研究中，从丹参 EST 文库中筛选
并克隆得到一条胁迫相关基因 SmLEA，推测该基
因所编码的蛋白属于晚期胚胎蛋白LEA14家族成
员[13-15]。SmLEA 基因在丹参的根、茎、叶中均有
表达，并且受到 ABA、脱水、高盐和低温等诱导
作用[16]。研究表明，SmLEA 基因在大肠杆菌和丹
参中过量表达后提高了大肠杆菌的耐盐性和丹参
的耐盐、耐旱性[10]。为进一步深度挖掘丹参的抗
逆基因和阐述丹参的抗逆机制，本研究从丹参中克
隆得到一个新的 LEA 基因 SmLEA2，采用生物信
息学方法对该基因进行了预测和分析，通过实时荧
光定量 PCR 检测分析 SmLEA2 的表达特征，初步
预测该基因的功能，为该领域的研究提供一定的理
论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
丹参 Salvia miltiorrhiza Bunge 种子经笔者鉴定
后收集于陕西天士力植物药业商洛有限公司商州药
源基地，在盛有蛭石-草木灰（2∶1）的土壤中萌发，
将长至 2～3 cm 的幼苗移到营养钵中，在人工气候
箱（宁波，RXZ 型-500D）中培养，光照强度 8 000
lx，光周期为光照 16 h/黑暗 8 h，温度（25±2）℃，
湿度 48%。培养 2 个月的丹参幼苗用于 DNA、RNA
的提取和各种胁迫处理。取苗龄 2 个月丹参不同部
位的新鲜组织，用于基因器官特异性的表达检测。
取二年生丹参的花苞（F1），盛开 1 d（F2）、3 d（F3）、
5 d（F4）的花，未成熟种子（S1），成熟种子（S2），
用于基因不同发育时期的表达检测。
DNA 提取试剂盒、RNA 提取试剂盒和 DNase
消化试剂购自 Omega 公司；反转录试剂盒、限制性
内切酶（Dra I/EcoR V/Pvu II/Stu I）、T4 DNA 连接
酶、PrimeScript®RT Reagent Kit、SYBR Green II
Premix Ex Taq、pMD19-T simple vector、DL 2000
Marker 购自 TaKaRa 公司；大肠杆菌 DH5α 为本实
验室保存。
1.2 MeJA、ABA 处理方法
茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）处理
时，用 500 μmol/L MeJA 溶液喷洒于 2 个月龄的丹
参实生苗叶表面，分别于处理后 0、1、2、4、6、8、
24、48 h 取全株样品。ABA 处理时，用 100 μmol/L
ABA 溶液喷洒于二月龄的丹参实生苗叶表面，分别
于 0、1、2、4、6、8、10、24、48 h 取全株样品。
所有样品收集后迅速置于液氮中速冻，置于
−80 ℃冻存备用。
1.3 核酸提取
丹参基因组 DNA 的提取参照 CTAB 法[17]。用
Omega 公司试剂盒提取总 mRNA，按照反转录试剂
盒说明书，以总 mRNA 为模板合成 cDNA 第一链。
1.4 文库的构建
文库构建按照 BD Genome WalkerTM Universal
Kit（Clontech）试剂盒说明书进行。
1.5 丹参 LEA 蛋白的克隆
对丹参转录组数据库序列进行 BLAST 分析，
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• 1968 •
发现 Unigene55769_danshen（844 bp）与其他物种
中已报道的 LEA 基因具有很高的相似度，命名为
SmLEA2。在其序列两端设计，上游引物 LEA2-S：
5’-TTGCTCACTTCACTTGTTCTCG-3’；下游引物
LEA2-A：5’-CTTCCCCGTTCTTCGCAAT-3’。分别
以丹参 cDNA 和 gDNA 为模板进行 PCR 扩增。将
扩增产物回收，连接至 pMD19-T simple vector，转
化大肠杆菌 DH5α，挑取单克隆，经菌落 PCR 筛选
阳性克隆送至华大基因进行测序。
根据 SmLEA2 基因已有的序列设计引物，采用
DNA Walking 方法扩增得到该Unigene 的 5’和 3’端侧
翼序列，所用引物见表 1。该过程包含 2 个独立的 PCR
扩增，每一个扩增由 2 步 PCR 反应组成，反应条件
参照文献方法[16]，PCR 产物经过纯化克隆连接到
pMD19-T simple vector，转化大肠杆菌 DH5α，经菌
落 PCR 筛选阳性克隆送至华大基因进行测序。利用
DNAStar软件将DNA Walking所得序列进行拼接得到
该基因的全长以及启动子区。在此基础上设计基因全
长引物 SmLEA2s：5’-ATGGCGTCTTATGATAAGCC-
AG-3’；SmLEA2a：5’-AGTGATGAATGTATACCAG-
CTAAGG-3’。以丹参 cDNA 和 gDNA 为模板进行
扩增。
表 1 SmLEA2 基因 5’和 3’端侧翼序列克隆所用引物
Table 1 Primers used in cloning of 5’ and 3’ region of SmLEA2 gene
引物名称 编号 引物序列 (5’-3’)
AP1 GTAATACGACTCACTATAGGGC 接头序列引物
AP2 ACTATAGGGCACGAGTGGT
3’端特异扩增引物 GSP1 CGTGCCCGTGTTTGGTAGGCTTACTTTC
GSP2 GGTTCAGTTTGACAAGTTCTCATTCGA
5’端第 1 次特异扩增引物 GSP3 AACGGGATCACGGTCAAAGGGTACTCA
GSP4 GGAGTAGCGAGAACAAGTGAAGTGAGCAAACC
5’端第 2 次特异扩增引物 GSP5 CTGGATCAATGGGATGACGCCACGT
GSP6 GGTGGTTCTTGGAGTGGATGGGGA

1.6 SmLEA2 的生物信息学分析
SmLEA2 基因采用 DNAStar、NCBI、EBI 以及
ExPASy 等生物信息学软件和数据库进行分析和预
测[13]。蛋白和核酸序列的组成、理化性质和开放阅
读框分析利用 DNAStar、ProtParam、pI/MV 和 ORF
Finder 等在线工具进行；蛋白质信号肽和跨膜结构
域用 SignalP 和 TMHMM 软件预测；通过在线工具
ProtScale 分析蛋白的亲水性/疏水性；利用 SOPMA
在线工具对蛋白质二级结构进行预测；多序列比对
利用 Clustal W2 和 BLAST 等在线工具完成；通过
MEGA4.0 邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系
统树；基因转录起始位点利用 Softberry TSSP 工具
预测；另外用 PlantCARE Database 分析启动子区转
录应答元件。
1.7 SmLEA2 基因的表达分析
分别以丹参根、茎、叶、花的不同发育时期以
及经 MeJA、ABA 处理的样品 cDNA 为模板进行实
时荧光定量 PCR 分析。以丹参 3-磷酸甘油醛脱氢酶
基因（GAPDH）为内参，对 SmLEA2 基因进行表
达分析，引物见表 2。反应条件参照文献方法[18]，
数据分析采用“2−ΔΔCt”的方法计算相对表达量[19]，
并用 SPSS 13.0 中 One-way ANOVA 方法进行单因
素方差分析，利用 Tukey test 分析各样品间基因表
达的显著性（P＜0.05）。
表 2 实时荧光定量 PCR 检测 SmLEA2 基因表达所用引物
Table 2 Primers used for analysis on expression of SmLEA2 by real-time qPCR
基因名称 产物大小/bp 引物名称 序列信息
GAPDH 183 GAPDHS 5’-ACCCTCACGGGGAAGACCAT-3’
GAPDHA 5’-CCACGGAGACGGAGGACAA-3’
SmLEA2 224 RLEAS 5’-AGAGGGGAGAAAGAGGAAAAGA-3’
RLEAA 5’-ATGAGAGGGATTGGAACAGGAT-3’
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• 1969 •
2 结果与分析
2.1 SmLEA2 基因的克隆与生物信息学分析
根据 Unigene55769_danshen 片段，通过 DNA
Walking 的方法获得了 SmLEA2 基因全长（图 1）。
拼接后得到该基因 gDNA 长为 1 961 bp，包含 1 个
外显子和 1 个内含子，并且内含子处于起始密码子
的上游，开放读码框 960 bp，编码 319 个氨基酸（图
2）。SmLEA2 基因编码的蛋白质相对分子质量为
35 340，等电点为 4.77，为稳定性蛋白。另外
SmLEA2 蛋白缺乏半胱氨酸和酪氨酸，而富含亲水
性氨基酸，这是大多数 LEA 蛋白的特征。进行
BLAST 保守性区域检索，发现 SmLEA2 蛋白包含
一个 LEA-2 蛋白结构域，与其他植物中 LEA 一样
具有典型的 LEA-2 结构域。

M-Marker；A-不同模板 Unigene55769_danshen 片段的扩增，1-以基因组 DNA 为模板，2-以 cDNA 为模板；B、C-丹参 SmLEA2 基因 5’侧翼区的 2 次
扩增，3-用 Dra I 消化，4-用 EcoR V 消化，5-用 Pvu II 消化，6-用 Stu I 消化；D-SmLEA2 基因 3’侧翼区的扩增 E-SmLEA2 基因开放阅读框验证
M-Maker.; A-PCR amplification products of Unigene55769_danshen obtained using different templates. Lane 1, genomic DNA as template. Lane 2, cDNA as
templates; B and C-PCR amplification products of the first and second cycles of 5’ flanking region of SmLEA2. Lanes showed different libraries used as
template. Lane 3, digested with DraI, lane 4 with EcoRV, lane 5 with PvuII and lane 6 with StuI.; D-PCR amplification products of 3’ flanking region of
SmLEA2; E-PCR amplification products of SmLEA2 gene.
图 1 丹参 SmLEA2 基因及其 5’侧翼区的扩增
Fig. 1 Analysis on size of SmLEA2 gene and its 5’ flanking region
蛋白质在细胞内的定位不同，预示着其将发挥
不同的功能。SmLEA2 蛋白无跨膜结构域和信号肽，
定位在细胞质中，可能在细胞质中发挥作用。蛋白
质的高级结构决定了蛋白质的生物功能，其预测分
析对蛋白质的功能研究具有十分重要的意义。
SmLEA2 蛋白的二级结构预测显示该蛋白不规则卷
曲为 43.57%、延伸链为 29.47%、α-螺旋为 21.00%
和 β-转角为 5.96%。SmLEA2 蛋白主要是由不规则
卷曲组成，其中 α-螺旋和不规则卷曲有助于蛋白束
缚水分子和盐离子[20-21]。SmLEA2 蛋白的三级结构
具有 1 个 α-螺旋和 7 个 β-折叠，β-折叠呈反向平行。
SmLEA2 蛋白的三级结构预测可进一步揭示该蛋白
的功能特征。
预测蛋白质的亲疏水性可为蛋白质的功能研究
提供理论参考。SmLEA2 的亲疏水性预测显示大部
分氨基酸的分值为负值，从总体来说该蛋白为亲水
性蛋白。其中氨基酸序列的两端多为亲水性氨基酸，
中间多为疏水性氨基酸，预示着该蛋白在保护细胞
脱水方面具有一定的作用。
2.2 同源性分析和系统发育比较
蛋白比对（Protein-protein BLAST）结果显示，
SmLEA2 蛋白与 GenBank 已注册的可可蛋白
（TcLEA2，XP_007026466）、刚毛柽柳蛋白（ThLEA，
AHF21584 ）、 红 蓖 麻 蛋 白 （ RcLEA14-A ，
XP_002533345）、拟南芥蛋白（AtLEA2，NP_181934）、
蒺藜苜蓿蛋白（MtLEA14，XP_003617191）的一致
性达到 70%以上，相似性（positives）达到 90%以上。
对这 6 个蛋白进行蛋白序列比对分析的结果显示，
SmLEA2 在氨基酸序列第 77～173 位和第 203～298
位包含有在其他物种中已报道的 LEA 蛋白的保守功
能域（图 3）。结合 Blast-CD Search 分析，SmLEA2
具有结构域WHy，将 SmLEA2 归属于LEA-2 超家族。
MEGA4.0 软件平台上采用 N-J 方法构建系统
进化树，对不同物种 LEA 氨基酸序列进行分子系统
进化分析（图 4），包括上述同源序列比对 5 种蛋白，
拟南芥 LEA 蛋白（AtLEA3、AtLEA5、AtLEA14、
AtEM1、AtXER02)，玉米 LEA 蛋白（玉米 LEA3、
玉米 LEA14-A、玉米 EMB5、玉米 DHN1）和棉花

M 1 2 M 3 4 5 6 M 3 4 5 6 3 4 5 6 M M 1 2
A B C D E
100 bp
250 bp
500 bp
750 bp
1 000 bp
2 000 bp
100 bp
250 bp
500 bp
750 bp
1 000 bp
2 000 bp
100 bp
250 bp
500 bp
750 bp
1 000 bp
2 000 bp
100 bp
250 bp
500 bp
750 bp
1 000 bp
2 000 bp
100 bp
250 bp
500 bp
750 bp
1 000 bp
2 000 bp
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• 1970 •

a-SmLEA2 基因的核酸序列及其编码的蛋白序列 b-SmLEA2 基因的内含子序列（下划线表示）
a-nucleotides sequence and deduced amino acid sequence of SmLEA2 b-intron of SmLEA2（designated by an underline）
图 2 SmLEA2 基因核酸序列、编码蛋白序列以及内含子序列
Fig. 2 Nucleotide sequence, amino acid sequence, and intron DNA sequence of SmLEA2

“*”表示 6 个蛋白都相同的氨基酸残基 “：”表示 4 个蛋白都相同的氨基酸残基 “•”代表 3 个蛋白都相同的氨基酸残基 下划线表示WHy 结构域
“*”-incidates that six proteins with same amino acid residues; “：”incidates that four proteins with the same amino acid residues; “•”-incidates that three
proteins with the same amino acid residues; WHy domain was underlined
图 3 SmLEA2 与其他植物 LEA 蛋白的多序列比对
Fig. 3 Comparison on amino acid sequence of SmLEA2 with that of other LEA proteins
a b1
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
TcLEA2
RcLEA14-A
ThLEA
SmLEA2
MtLEA14
AtLEA2

TcLEA2
RcLEA14-A
ThLEA
SmLEA2
MtLEA14
AtLEA2

TcLEA2
RcLEA14-A
ThLEA
SmLEA2
MtLEA14
AtLEA2

TcLEA2
RcLEA14-A
ThLEA
SmLEA2
MtLEA14
AtLEA2

TcLEA2
RcLEA14-A
ThLEA
SmLEA2
MtLEA14
AtLEA2
41
44
49
48
52
59
101
104
109
108
112
119
161
164
169
168
172
179
221
224
229
228
232
239
280
283
288
287
292
298
311
313
318
319
324
325
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• 1971 •

图 4 SmLEA2 与其他相关 LEA 蛋白的系统进化树
Fig. 4 Phylogenetic tree of SmLEA2 with other related LEA
proteins
LEA 蛋白（DH11）。结果显示 SmLEA2 与抗逆蛋白
TcLEA2 和 RcLEA14-A 亲缘关系较近。
2.3 SmLEA2 基因启动子区的克隆和序列分析
基因启动子由核心元件和转录调控区域 2 部分
组成，核心元件包括 TATA 框和转录起始位点附近
的起始子。对启动子区的分析有利于阐释基因的表
达特征和调控机制。采用 DNA Walking 的方法获得
SmLEA2 基因 5’启动子区长约 860 bp 的片段，该片
段位于该基因内含子的上游，含有典型的植物启动
子核心元件。软件预测发现 SmLEA2 基因 ATG 上
游−983 bp 处有 1 个 TSS 转录起始位点（图 5），并
且该基因 TSS 的上游 23 bp 处有一个 TATA box（真
核基因转录核心元件）。启动子区有 9 个对转录效率
有影响的 CAAT box 序列和 1 个 5’ UTR Py-rich
stretch 元件。此外，该序列还包括多种顺式作用元
件，包括 ABRE、TGACG-motif、CGTCA-motif、
ERE 等与激素响应相关的顺式作用元件，MYB 转
录因子结合位点以及 Box 4、CACGTGG-Box 等与
光诱导相关的元件等（表 3）。
研究表明 2 个或 2 个以上 ABRE 元件可以激活

下划线表示核心启动子区
Promoter core region was underlined
图 5 SmLEA2 基因启动子区序列及顺式作用元件
Fig. 5 Flanking region promoter sequence and cis-acting elements of SmLEA2
ABA 响应作用[22]，在 SmLEA2 基因的启动子中，
发现了 5 个 ABRE 元件。Abe 等[23]发现 MYB 元件
存在于拟南芥脱水应答基因 rd22 的启动子中，与脱
水和 ABA 诱导有关。根据启动子区域中顺式作用
元件的分析，推测该基因可能受到 MeJA、ABA 和
逆境胁迫的诱导。
2.4 SmLEA2 基因的表达特征分析
利用实时荧光定量 PCR 的方法分析 SmLEA2

MtLEA14
AtLEA2
ThLEA
TcLEA2
RcLEA14-A
SmLEA2
玉米 LEA14-A
AtLEA14
SmLEA
AtLEA3
玉米 LEA3
AtLEA5
AtEM1
玉米 EMB5
棉花 DH11
AtXER02
玉米 DHN1
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• 1972 •
表 3 启动子区顺式作用元件的分析
Table 3 Analysis on cis-acting elements of promoter sequences
调控元件名称 序列 个数 作用
ABRE MACGYGB 5 参与 ABA 应答反应
Box 4 ATTAAT 2 参与光反应
Box 1 TTTCAAA 1 参与光反应
CAAT-box CAAT 9 启动子区和增强子区的作用元件
CGTCA-motif CGTCA 2 参与 MeJA 胁迫反应的作用元件
ERE ATTTCAAA 1 乙烯响应元件
CACGTGG-Box CACGTG 2 参与光反应的作用元件
ACACGTGGC G-Box ACACGTGGC 1 参与光反应的作用元件
GA-motif ATAGATAA 1 光反应的作用元件
HD-Zip 3 GTAAT (G/C)ATTAC 1 蛋白结合位点
MBS AACTG 2 参与干旱诱导的 MYB 结合位点
Skn-1_motif GTCAT 2 胚胎表达相关作用元件
TATA-box TATA 10 转录起始位点-30 处的核心启动子区
TCT-motif ATAGAA 1 光反应的作用元件
TGACG-motif TGACG 1 与 MeJA 胁迫反应的作用元件
Circadian CAANNNNATC 4 生理调控相关的作用元件
5UTR Py-rich stretch TTTCTTCTCT 1 赋予高转录水平的作用元件

基因的表达特征。结果表明：该基因为组成型
表达基因，在丹参的根、茎、叶、花、种子中
均有表达。在根、茎、叶中，SmLEA2 基因在
茎中的表达量最高；该基因在花和种子的各个
发育时期表达量不同，SmLEA2 的表达随着花
的盛开和种子的成熟表达量显著上调，在 S1 中
表达量最高，而在种子成熟后其表达量下降。
SmLEA2 基因在不同部位和各个发育阶段中不
均匀的表达可能与 SmLEA2 不同的功能密切相
关。结果见图 6。
SmLEA2 的表达响应 MeJA 的诱导，处理 4 h
后 SmLEA2 表达量显著上调，并在 8 h 达到峰值，
约是对照（0 h）的 3 倍。 ABA 处理后，SmLEA2
的表达量呈上调趋势，在 8 h 达到峰值，约是对照
（0 h）的 52 倍，8 h 后该基因的表达量下降并趋于
稳定。结果见图 6。

*P < 0.05 ***P < 0.001
图 6 SmLEA2 的表达分析
Fig. 6 Expression analysis on SmLEA2

5
4
3
2
1
0
相
对
表
达
量
1.5

1.0

0.5

0
相
对
表
达
量

根 茎 叶 F1 F2 F3 F4 S1 S2
﹡
﹡﹡﹡ ﹡﹡﹡
﹡﹡﹡
0 1 2 4 6 8 24 48 0 1 2 4 6 8 10 24 48
t/h
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不同组织 花和种子发育时期
500 μmol/L MeJA 100 μmol/L ABA
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 13 期 2015 年 7 月

• 1973 •
3 讨论
LEA 蛋白基因是植物体内一类重要的抗逆蛋
白。本研究在丹参转录组数据库的基础上利用 PCR
技术和DNA Walking的方法克隆到了SmLEA2基因
的 全 长 。 SmLEA2 与 抗 逆 蛋 白 TcLEA2 和
RcLEA14-A 亲缘关系较近，与拟南芥 AtLEA2 蛋白
（NP_181934）的相似性高达 90%以上，SmLEA2
具有 LEA-2 结构域，属于 LEA2 大家族。SmLEA2
蛋白的二级结构主要表现为不规则卷曲，富含甘氨
酸、赖氨酸等亲水性氨基酸，这也是 LEA 家族蛋白
的特点，属于 LEA 蛋白成员。生物信息学分析
SmLEA2 与已报道的 SmLEA 蛋白具有类似的三级
结构，但是它们的亲疏水性不同。SmLEA2 为亲水
性蛋白；SmLEA 为疏水性蛋白，属于 LEA14 大家
族[10]，这预示着 SmLEA 和 SmLEA2 可能具有不用
的功能和作用机制，这需要进一步的研究。
实时荧光定量 PCR 结果显示，SmLEA2 基因为
组成型表达基因，在丹参的根、茎、叶中均有表达，
以茎中表达最为丰富。SmLEA 则在根中表达最为丰
富，茎中表达量最低[13]。SmLEA2 与 SmLEA 在不
同部位的表达差异性，进一步暗示它们所发挥的功
能或者发挥功能的作用机制有所不同。
在胚胎发育中，LEA 蛋白在种子或胚胎的成熟
时大量积累，在种子萌发时很快消失，这被认为是
LEA 蛋白在胚胎发育中呈现的特定表达模式[5]。实
时荧光定量 PCR 结果显示，SmLEA2 随着种子成熟
其表达量逐步增加，而种子成熟后其表达量下降，
预示着它在种子发育阶段中发挥着一定的功能。正
常性种子发育末端都会发生成熟脱水事件，而
SmLEA2 蛋白在此阶段大量表达，表明该蛋白可能
与种子的脱水耐性获得有着密切的关系。
利 用 DNA Walking 的 方 法 克 隆 获 得 了
SmLEA2 基因的 5’侧翼序列。经顺式作用元件预
测，该区域含有多种与逆境胁迫相关的顺式作用元
件，如 ABRE、MYB、CGTCA-motif 等，该基因
可能受到 MeJA、ABA 和逆境胁迫的诱导。MeJA、
ABA 在植物各种环境胁迫应答中发挥着重要作
用。MeJA 参与植物生长发育调控，并且与植物抗
机械伤害和抗病性密切相关，可传导逆境信号并启
动下游抗逆基因来提高植物的抗逆境胁迫能力[24]。
实时荧光定量 PCR 分析结果显示，外源喷洒 MeJA
可显著诱导 SmLEA2 的表达。由此推测，SmLEA2
参与了丹参的抗逆反应过程。ABA 参与控制植物
生长和发育的多种生理过程，并且在植物抗逆性方
面具有重要作用[25]。研究表明，某些 LEA 基因的
启动子区域含有 ABA 响应元件（ABRES），胁迫
信号通过 ABA 作用于响应元件，来调节 LEA 基因
的表达 [24]。结合实时荧光定量 PCR 结果表明
SmLEA2 的表达受 ABA 诱导，并可能通过 ABA
依赖型途径参与丹参的耐受胁迫的过程。
SmLEA 基因受到 ABA 以及其他非生物因子如
低温、高盐、干旱等的诱导[18]，在大肠杆菌和丹参
中过量表达该基因，验证了 SmLEA 基因与丹参的
耐盐、耐旱作用有关[10]。SmLEA2 基因可对 MeJA
和 ABA 做出响应，基因表达结果与预测的调控元
件结果相符合。SmLEA2 和 SmLEA 基因的表达都
受到 ABA 的诱导，但它们的表达特征不尽相同。
因此推测 SmLEA2 基因可能在丹参抗逆和防御反
应中发挥作用，并且 SmLEA2 与 SmLEA 可能具有
不用的作用机制，这需要进一步研究得到证实。
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