全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 7 期 2013 年 4 月

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• 药材与资源 •
半夏及近缘种叶绿体非编码区序列分析
郑丹书 1，张君毅 1*，郭巧生 2
1. 华侨大学化工学院，福建 厦门 361021
2. 南京农业大学中药材研究所，江苏 南京 210095
摘 要：目的 通过测定半夏及近缘种的 DNA 叶绿体的非编码区序列，为半夏的分子鉴别和遗传多样性研究提供依据。方
法 在我国半夏主要分布区收集到43份半夏及滴水珠和虎掌半夏2个近缘种，采用PCR法克隆叶片基因组DNA中psbK-psbI
和 atpF-atpH 两段序列，借助生物信息学软件进行比对分析。结果 半夏 atpF-atpH 序列长为 337～342 bp，较为保守，仅含
变异位点 7 个，其中信息位点 1 个，遗传距离为 0～0.024。半夏 psbK-psbI 序列长为 432～435 bp，变异位点 37 个，其中信
息位点 17 个，遗传距离为 0～0.069。聚类分析结果均显示出与表型以及地理居群的不一致。结论 psbK-psbI 序列较 atpF-atpH
有更好的鉴别能力，在半夏种内具有较丰富的变异位点。
关键词：半夏；psbK-psbI；atpF-atpH；分子鉴定；非编码区序列；遗传多样性
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)07 - 0881 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.07.020
cpDNA non-coding sequence analysis of Pinellia ternata and its related species
ZHENG Dan-shu1, ZHANG Jun-yi1, GUO Qiao-sheng2
1. College of Chemical Engineering, Huaqiao University, Xiamen 361021, China
2. Institute of Chinese Medicinal Materials, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: Objective To provide the evidence for the identification and genetic diversity of Pinellia ternata by studying cpDNA
non-coding sequences of P. ternata and its related species. Methods Besides P. cordate and P. pedatisecta, 43 P. ternata samples were
collected from the main habitats in China. psbK-psbI and atpF-atpH sequences in leaf genome DNA were cloned by PCR. Comparative
analysis was carried out by bioinformatics software. Results The sequence length of atpF-atpH in P. ternata was 337—342 bp and
conservative. The numbers of variable sites and parsimony information sites were only 7 and 1, respectively. The genetic distance was
0—0.024. The length of psbK-psbI was 432—435 bp, with 37 variable sites, including 17 information sites, and the genetic distance
was 0—0.069. Cluster analysis was not consistent with the phenotype or the geographical distributions. Conclusion The discrimination
of psbK-psbI is better than that of atpF-atpH, and there are more mutation sites in psbK-psbI sequence among species in P. ternata.
Key words: Pinellia ternata (Thunb.) Breit. ; psbK-psbI; atpF-atpH; molecular identification; cpDNA non-coding sequence; genetic diversity

半夏 Pinellia ternata (Thunb.) Breit. 是我国传
统中药，具有燥湿化痰、降逆止呕之功效，药理研
究表明其具有抗肿瘤、抗早孕等疗效[1]。半夏在我
国分布广泛、种质多样、资源丰富，但由于自然环
境的破坏、大量农药的使用和过度的采挖，导致半
夏野生资源急剧减少，而人工栽培发展相对缓慢，
造成市场上半夏质量参差不齐、真假难辨。此外，
经过长期演化、地理隔离和栽培种植等因素导致半
夏各居群表型出现严重的分化[2]，表现出丰富的遗传
多样性[3-4]。因此，亟需对现存遗传资源进行有效地
鉴别和评价，以保障用药安全和资源的可持续利用。
目前半夏遗传多样性研究已在诸多方面展开。
植物形态学方面研究半夏叶形变化和珠芽数量的
表形性状[5]，孢粉学方面研究花粉形态、大小及表
面纹饰等[6]，细胞学方面研究染色体的倍性和数目
等[7]，微观结构方面研究叶片叶绿体、基粒、淀粉
粒等[8]，化学成分方面有生物碱[9]、鸟苷[10]等，分
子标记方面研究包括利用 ISSR 技术[11]、SRAP 技

收稿日期：2013-01-24
基金项目：国家科技支撑计划项目（2009BAI74B01-01-04）；华侨大学基本科研业务费专项基金资助项目（JB-ZR1115）
作者简介：郑丹书（1988—），女，硕士研究生，研究方向为药用植物的开发与利用。
*通信作者 张君毅 E-mail: zjy0054@yhaoo.com.cn
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术[12]、AFLP 技术[13]、MSAP 技术[14]等。在半夏鉴
别方面，核糖体 ITS 序列已被用于半夏真伪品的
鉴定[15]，并发现此序列在半夏种内不同居群间存
在相当的变异位点[16]。
叶绿体 DNA（cpDNA）在大部分被子植物中
为母系遗传，但其编码区高度保守，仅适合科内、
科间乃至整个被子植物的较高分类阶元的系统发育
研究，而非编码区（基因间区和内含子）适用于种
间及种以下水平的植物研究[17]。常用的非编码区有
trnL-trnF、trnH-psbA、psbK-psbI、atpF-atpH 等序
列，并在繁缕[18]、石蒜[19]、砂仁[20]等药用植物中开
展应用，但在半夏中尚未见报道。本实验拟利用叶
绿体的非编码区检测半夏种内的遗传变异性，同时
在一定程度上提供种间分子鉴定依据。
1 材料
在我国半夏主要分布区共收集了 16 个地区 43
份半夏资源。贵州是半夏野生资源分布集中地区之
一，所以重点收集贵州省 20 份。同时收集到同属近
缘种福建泰宁的滴水珠（Pinellia cordata N. E.
Brown，编号 D50）和江苏南京的虎掌半夏（Pinellia
pedatisecta Schott，编号 H53）。供试材料经南京农
业大学郭巧生教授鉴定，见表 1。
表 1 样品采集信息
Table 1 Information of samples
编号 来源 纬度 经度 编号 来源 纬度 经度 编号 来源 纬度 经度
B1 贵州兴义 25.09 104.90 B19 贵州大方 27.15 105.60 B37 甘肃西和 34.01 105.30
B2 贵州兴仁 25.44 105.18 B20 贵州大方 27.15 105.60 B38 广西贵港 23.11 109.60
B3 贵州盘县 25.71 104.47 B21 湖北京山 31.02 113.11 B39 江苏邳州 34.34 118.01
B4 贵州安顺 26.25 105.94 B22 湖北荆州 30.33 112.23 B40 云南昭通 27.34 103.71
B5 贵州赫章 27.12 104.72 B23 湖北荆州 30.33 112.23 B41 湖北潜江 30.40 112.90
B6 贵州关岭 25.87 105.62 B24 湖北来凤 29.49 109.40 B42 河南唐河 32.70 112.84
B7 贵州关岭 25.87 105.62 B25 湖北来凤 29.49 109.40 B43 河南唐河 32.70 112.84
B8 贵州普安 25.78 104.94 B26 湖南怀化 27.57 110.02 B44 安徽芜湖 30.89 118.36
B9 贵州册亨 24.98 105.81 B27 山东临沂 35.07 118.36 B45 安徽芜湖 30.89 118.36
B10 贵州湄潭 27.75 107.47 B28 陕西商洛 33.88 109.95 B46 江苏连云港 34.74 119.44
B11 贵州安龙 25.09 105.44 B29 山东菏泽 35.25 115.47 B47 安徽金寨 31.67 115.88
B12 贵州安龙 25.09 105.44 B30 重庆涪陵 29.70 107.38 B48 辽宁大连 38.92 121.59
B13 贵州遵义 27.72 106.92 B31 湖北恩施 30.29 109.48 B49 天津蓟县 40.04 117.41
B14 贵州遵义 27.72 106.92 B32 湖北恩施 30.29 109.48 D50 福建泰宁 26.90 117.08
B15 贵州凤冈 27.96 107.71 B33 浙江杭州 30.27 120.15 B51 江苏邳州 34.34 118.01
B16 贵州贵阳 26.65 106.67 B34 四川南充 30.83 106.12 B52 江苏泰州 32.45 119.91
B17 贵州德江 28.26 108.11 B35 重庆三岔 29.57 106.57 H53 江苏南京 31.95 118.84
B18 贵州毕节 27.30 105.30 B36 广西西林 24.48 105.09

2 方法
2.1 基因组 DNA 提取
每份半夏材料取 1～2 个样品（共 51 个），采用
改良 CTAB 法从新鲜叶片中提取基因组 DNA，DNA
的质量及浓度分别通过琼脂糖凝胶电泳及超微量紫
外分光光度计检测，并稀释至 20 mg/L，置于−20 ℃
冰箱中保存备用。
2.2 PCR 扩增和测序
选用 psbK-psbI 区和 atpF-atpH 区 2 段 cpDNA
基因间隔区序列，PCR 扩增均使用通用引物。
psbK-psbI 引物序列为 psbKF：5’-TTAGCCTTTGTT-
TGGCAAG-3’；psbIR：5’-AGAGTTTGAGAGTAA-
GCAT-3’ ； atpF-atpH 的 引 物 序 列 为 atpFF ：
5’-ACTCGCACACACTCCCTTTCC-3’ ； atpHR ：
5’-GCTTTTATGGAAGCTTTAACAAT-3’。引物由上
海英潍捷基生物技术有限公司合成。利用 EDC—
810 型基因扩增仪（东胜创新生物科技有限公司）
进行 PCR 扩增。
PCR 扩增反应总体积为 50 μL，终浓度为 30
ng 模板 DNA，25 μL 1×PCR Reaction Mix，2.5 μL
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10 μmol/L 引物，0.25 μL 5 U/μL Taq DNA 聚合酶，
18.25 μL 超纯水。两段序列均采用上述体系进行
PCR 扩增。
atpF-atpH 区扩增程序为：94 ℃预变性 5 min；
94 ℃变性 30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，
40 个循环；72 ℃总延伸 5 min。psbK-psbI 区扩
增程序为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，
50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，35 个循环；72 ℃
总延伸 5 min。PCR 产物用 1.5%的琼脂糖凝胶在
DYY—8C 型电泳仪（北京六一仪器厂）上检测，
利用凝胶成像系统（上海培清科技有限公司）拍照
记录。PCR 产物的纯化及序列双向测定均由上海英
潍捷基生物技术有限公司完成。
2.3 数据处理
atpF-atpH 序列起止范围参照 Genebank 中天南
星科巨魔芋 Amorphophallus titanium Becc. ex
Arcang.（FJ455768）和欧海芋属 Arum maculatum L.
（J395275）确定边界。psbK-psbI 序列起止范围参照
浮萍属浮萍 Lemna minor L.和紫萍属紫萍 Landoltia
punctata (G. Mey.) C. H. Thomps.，登录号分别为
GU454328 和 GU454310。所得 DNA 序列用 BioEdit
软件进行编辑校准，然后用 CLUSTAL X 2.0 进行多
序列比对。利用 MEGA 4.0 进行序列差异分析，并
统计序列间的碱基突变位点、信息位点，计算 GC
量等，基于 UPGMA 法构建系统发育树。
3 结果与分析
3.1 序列扩增测定分析
从 trnH-psbA、trnL-trnF、atpF-atpH和 psbK-psbI
4 段叶绿体非编码序列着手进行预扩增，通过扩增
效率和测序成功率的比较，优先选择扩增效果较好
的 atpF-atpH和 psbK-psbI两段序列对半夏及其近缘
种进行分析，见表 2。
3.2 atpF-atpH 序列长度及变异
供试的 43 份半夏和 2 份近缘种 atpF-atpH 序列
均得到扩增并测序。将半夏所得 atpF-atpH 序列中
的相同序列合并，最终得到 4 个单倍型，见表 3，
即 H1、H2、H3、H4，长度为 337～342 bp，A 占
碱基总数的 30.0%，T 占 38.7%，G 占 16.6%，C 占
14.7%，GC 量为 31.2%～31.3%。单倍型之间进行
比对后可发现 6 处变异位点，包含了 5 处插入/缺失
和 1 处碱基置换。其中 5 处插入/缺失分别为 161、
162、163、186、187 bp 处的单碱基插入/缺失；1
处置换是位于 263 bp（C→G）。滴水珠和半夏的长
度分别为 336 bp 和 337 bp。GC 量分别为 31.2%和
31.3%。与半夏相比滴水珠差异位点有 11 个，包括
4 个单碱基插入/缺失，即 140、141、142、143；7
处碱基置换，即 2 处 162 bp（G→A）、170 bp（G→
A）的置换和 5 处 117 bp （T→A）、136 bp（T→A）、
表 2 半夏 4 段叶绿体非编码区基本信息
Table 2 Information of four cpDNA non-coding sequences from P. ternata
序列 扩增效率 / % 测序效率 / % 长度 / bp GC 量 / %
trnL-trnF 80 60 748 32.5～33.4
atpF-atpH 80 80 343 31.2～31.3
psbK-psbI 100 80 448 23.6～27.6
trnH-psbA 0 0 — —

表 3 半夏及 2 个近缘种 atpF-atpH 变异位点分析
Table 3 Variation sites in atpF-atpH of P. ternata and its two related species
变异位点 / bp 类型 长度
/ bp
GC 量
/ % 117 136 140 141 142 143 145 156 157 161 162 163 164 166 167 170 171 186 187 263 总数
H1 341 31.2 T T T T T G T A T T G A A T T G A T − C 48
H2 341 31.3 T T T T T G T A T T G A A T T G A T − G 1
H3 337 31.3 T T T T T G T A T − − − A A T G A − − C 1
H4 342 31.2 T T T T T G T A T T G A A T T G A T T C 1
D50 336 31.2 A A − − − − T A T T A A T T A A T − − C 1
H53 337 31.3 T T T T T G A T G − − − A T T G A − − C 1
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164 bp（A→T）、167 bp（T→A）、和 171 bp（A→
T）的颠换。虎掌半夏的差异位点有 3 处，即 145 bp
（T→A）、156 bp（A→T）和 157 bp（T→G）的颠换。
3.3 psbK-psbI 序列长度及变异
43 份半夏居群 psbK-psbI 区的序列长度 432～
435 bp，A 占碱基总数的 39.0%，T 占 36.4%，G 占
13.0%，C 占 11.6%，平均 GC 量为 24.6%。变异位
点 37 个，其中信息位点 17 个，转换为 8，颠换为 9。
合并相同序列，得到 46 条不同的序列，即 46 个单
倍型。滴水珠和虎掌半夏的长度分别为 429 bp 和
430 bp，GC 量分别为 24.2%和 25.8%。相较于半夏，
二者各具有 17 个变异位点，单倍型数目为 1。结果
见表 4。
表 4 半夏及近缘种 psbK-psbI 序列分析
Table 4 Sequence analysis on psbK-psbI of P. ternata
and its two related species
类型 长度 / bp GC / % 变异位点数 信息位点数 单倍型
半夏 432～435 23.6～27.6 37 17 46
滴水珠 429 24.2 17 − 1
虎掌半夏 430 25.8 17 − 1

3.4 遗传相似性分析
应用 MEGA 4.0 计算出半夏居群间的遗传距离
为 0.003～0.061，半夏属 3 个种间的遗传距离分别
为 0.035（半夏/滴水珠）、0.038（半夏/虎掌半夏）
和 0.045（滴水珠/虎掌半夏）。半夏种内出现个别居
群间的遗传距离大于种间的情况，如 B39 和 B51 来
自江苏邳州的材料，其中 39 号同半夏中半数以上居
群之间的距离均大于 0.035，显示出了较大的差异性。
这可能是由于半夏长期处于不同生态条件及遗传性
状方面出现变化已形成了一定的生态型所致[21]。基
于遗传距离构建聚类图，见图 1。从聚类结果中可
以看出D50和H53两个近缘种明显地同半夏种内绝
大部分居群区分开来，同时，半夏种内个别居群显
示出了较大的差异性，即 B8、B43、B42、B45、
B48号材料。其余的半夏材料分为 3组，具体为B10、
B24、B29、B30、B44、B32、B35、B31、B50、
B22、B25、B21、B49、B40、B11、B27、B3、B5、
B14、B23、B20、B38、B28、B6、B19、B51、B17、
B4、B47、B34、B33、B15 和 B39 为一组；第 2 组
包含了 B16、B37、B18、B26、B12、B7、B9、B46、
B2、B1、B36 和 B13；B41 自成一组。聚类结果均
未显示出与表型及地理信息相一致。

图 1 43 份半夏以及 2 个近缘种基于 Nei’s 遗传距离的
UPGMA 聚类图
Fig. 1 UPGMA dendrogram of Nei’s genetic
distance among 43 P. ternata samples
and its two related species
4 讨论
4.1 序列选择
叶绿体非编码区序列受外界选择压力小，进化
速率较快，因此常作为植物 DNA 条形码的候选序
列，已被广泛应用于药用植物种间鉴别及亲缘关系
的研究。当前属下以至种内的鉴别是条形码鉴别工
作的瓶颈[22]，这可能要求针对某一物种以下水平的
鉴别要有特定的序列，能够对种内不同的居群或不
同的亚种进行鉴定[23]。本研究选择了 4 段序列进行
半夏种内不同类群间分析。
trnH-psbA 序列是叶绿体非编码序列中进化速
度较快且被认为适用于植物属间及种间的系统发育
研究[24]，但在本研究中，该序列在半夏及其近缘种
中全部扩增失败。对于 trnL-trnF 序列，张乐容等[25]

B10
B24
B29
B30
B44
B32
B35
B31
B50
B22
B25
B21
B49
B40
B11
B27
B3
B5
B14
B23
B20
B38
B28
B6
B19
B51
B17
B4
B47
B34
B33
B15
B39
B41
B16
B37
B18
B26
B12
B7
B9
B46
B2
B1
B36
B13
B8
B43
B42
B45
H53
B48
D50
0.015 0.010 0.005 0
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就用其对半夏属药用植物进行过种间关系的遗传分
析，而本研究 trnL-trnF 序列的测序成功率较低。
atpF-atpH 和 psbK-psbI 均为叶绿体非编码区序
列，二者和编码区 matK 基因的组合于第二届国际生
物条形码大会上提出，即 matK＋ atpF-atpH＋
psbK-psbI 组合，同时提出的还有 matK＋atpF-atpH＋
trnH-psbA 组合。2008 年 Fazekas 等[26]对上述组合
在 32 属 92 种共 251 个植物个体中进行了验证，结
果得出 matK＋atpF-atpH＋psbK-psbI 的正确识别率
最高，可达 69%，而单片段进行检测时 atpF-atpH
和 trnH-psbA 的成功率仅有 44%和 45%，然而鉴别
能力较优的单一片段在片段组合中却不一定能够显
示出相似的结果，反之亦然。目前还未有报道对半
夏 atpF-atpH和 psbK-psbI这两段区域进行过系统发
育的相关研究，而在此次预实验中，二者均显示出
了较好的扩增效果，故本实验采用这两段序列进行
半夏及其近缘种的克隆分析。
4.2 遗传变异
本研究中半夏 43个居群 51个样本的 atpF-atpH
存在 7 个变异位点，信息位点 1 个，psbK-psbI 存在
37 个变异位点，信息位点 17 个，半夏种内遗传距
离为 0.003～0.061，可以看出半夏种内具有较高水
平的遗传多样性。张乐容等[25]对半夏属 5 个种 9 个
类群的 trnL-trnF 序列进行统计分析，半夏种内遗传
距离为 0.001～0.005，这与本研究结果基本一致。
张君毅等[16]测定了半夏主要的 16 个居群 18 个样本
rDNA 中的 ITS 和 5.8 S rDNA 完全序列。ITS1 遗传
距离为 0～0.36%，ITS2 为 0～2.06%，这与本实验
结果差异较大，可能所选序列的进化速率有关。
从半夏表型变异的连续性以及半夏染色体的变
异情况来看，半夏种内很可能经历了形态学种-半隐
性种-隐性种这样的一个演化过程[27]，毫无疑问地给
形态学及分子分类学在鉴定工作制造了较大的困
难，这也可能是半夏以及其他复合体种内鉴定问题
至今仍未得到解答的根源，在一定程度上可以为传
统形态学同现代分子分类学还未达到有机结合做出
解释。从本实验的聚类结果中可以看出，半夏各居
群的聚集显示出较杂乱的情况，与表型及地理分布
明显不相一致。半夏居群内个别样品显示出了较大
的差异性，如 B8、B42、B43、B45 和 B48 号材料，
其中B42和B43来自河南唐河的半夏材料表现出较
少见的双珠芽特点。此外，个别样品间的遗传距离
甚至超出了半夏种间的距离，如 B39 与 B51 来自江
苏邳州的材料，其中 B39 同半夏种内半数以上的居
群之间的遗传距离均大于 0.035。
在细胞学半夏属各自然居群染色体存在严重
的复合多倍体现象，甚至还存在非整倍体数目的变
异[28]，半夏由此成为至今发现的染色体倍性最多的多
倍体种群之一。在本实验测序结果中，核酸变异位点
中亦存在杂合子现象，这与前述半夏染色体的多倍性
特点是一致的。序列分析后的聚类结果显示与表型及
产地分布均不相关，这可能由半夏染色体倍性变化复
杂，以至于可能出现不同居群染色体数目相同而同一
居群半夏染色体数目各异的特点导致。
参考文献
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