全 文 ：·2658· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 18 期 2014 年 9 月

二神丸不同提取部位温脾止泻的谱效关系研究
耿媛媛 1，胡昌江 1*，潘 新 1，赵 玲 1，熊 瑞 1，张 乐 1，胡 麟 2
1. 成都中医药大学药学院，四川 成都 610075
2. 成都中医药大学国际教育学院，四川 成都 610075
摘 要：目的 阐明二神丸中药物炮制后（盐炙补骨脂＋麸煨肉豆蔻）其不同提取部位的指纹图谱特征峰所代表的化学成分及
其对温脾止泻药效贡献的大小，表征二神丸的药效物质基础。方法 采用 HPLC 法建立二神丸不同提取部位的指纹图谱，以不
同提取部位对番泻叶所致急性腹泻小鼠腹泻指数的影响研究其止泻作用，采用灰关联分析法建立其谱效关系。结果 建立了二
神丸不同提取部位的指纹图谱，相似度均大于 0.90；二神丸温脾止泻的药效是多种成分共同作用的结果，各特征峰所代表的化
学成分对其止泻药效贡献的大小顺序（按特征峰编号）为 6 号＞18 号＞7 号＞20 号＞14 号＞21 号＞1 号＞25 号＞24 号＞23
号＞4 号＞3 号＞8 号＞11 号。结论 所构建的二神丸不同提取部位 HPLC 指纹图谱方法简单，重复性好，可为二神丸的质量
评价提供参考；不同部位指纹图谱与其止泻药效之间有一定的对应关系，为进一步研究二神丸的炮制机制奠定了基础。
关键词：二神丸；指纹图谱；温脾止泻；谱效关系；补骨脂；肉豆蔻；腹泻指数
中图分类号：R286.02 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)18 - 2658 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.18.016
Spectrum-effect relationship of different parts from Ershen Pill on warming
spleen to relieve diarrhea
GENG Yuan-yuan1, HU Chang-jiang1, PAN Xin1, ZHAO Ling1, XIONG Rui1, ZHANG Le1, HU Lin2
1.College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, China
2.International Education College,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, China
Abstract: Objective To clarify the contribution of the fingerprint peaks from different parts of prepared Ershen Pill to the effect of
warming spleen to relieve diarrhea, and to reflect the material basis. Methods The HPLC fingerprints of different parts of Ershen Pill
(composed of Psoraleae Fructus stir-baked with saltwater and Myristica Fragrans simmered with bran) were established. The diarrhea
index of acute diarrhea in mice caused by senna leaf was researched to compare the effect of warming spleen to relieve diarrhea.
Results The fingerprints of different parts of Ershen Pill were established, and all of the similarity degrees were over 0.90. The effect
of warming spleen to relieve diarrhea of Ershen Pill was obtained from many constituents collaboratively. The contribution of different
peaks to relieve diarrhea with astringents was ranked as 6 > 18 > 7 > 20 > 14 > 21 > 1 > 25 > 24 > 23 > 4 > 3 > 8 > 11. Conclusion The
method for establishing HPLC fingerprints of different parts of Ershen Pill is simple and repeatable. The relationship between the
fingerprints and the effect of warming spleen to relieve diarrhea is paralleled to some extent. And this will lay a foundation for the
research of processing mechanism of Ershen Pill.
Key words: Ershen Pill; fingerprint; warming spleen to relieve diarrhea; spectrum-effect relationship; Psoraleae Fructus; Myristica
Fragrans; diarrhea index

二神丸出自宋代许叔微的《普济本事方》，由
补骨脂和肉豆蔻 2 味药组成，具有温肾暖脾、涩
肠止泻的功效，是治疗脾肾阳虚之五更泄泻的基
础方[1]。课题组前期工作已证实盐炙补骨脂和麸
煨肉豆蔻组成的二神丸温脾止泻效果优于生品组
合 [2]。然而，将中药炮制纳入复方二神丸中进行
研究，其药物炮制后导致药效增加的物质基础尚
不明确。

收稿日期：2014-03-24
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81274085）
作者简介：耿媛媛（1988—），女，硕士在读，研究方向为中药炮制学。Tel: 13438020595 E-mail: yyg1103@126.com
*通信作者 胡昌江（1952—），男，教授，博士生导师，主要从事中药炮制原理与质量标准方面的研究工作。
Tel: 13980980796 E-mail: hhccjj@hotmail.com
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中药及复方化学成分复杂，从中寻求其产生疗
效的物质基础会有较大难度[3]。本实验采用系统溶
剂法分离二神丸中药物炮制后（盐炙补骨脂＋麸煨
肉豆蔻）的不同部位，通过建立各部位的指纹图谱
并比较其温脾止泻药效的不同，采用灰色关联分析
方法计算指纹图谱共有峰与止泻药效的关联度，以
关联度的大小衡量各指纹图谱共有峰对药效贡献的
大小，最终确定其主要药效成分，从而为科学阐明
二神丸的止泻药效提供物质基础，为二神丸中药物
炮制机制的研究提供依据。
1 仪器与材料
Agilent1200 高效液相色谱仪，含 DAD 检测器，
美国 Agilent 公司；KQ5200DB 型数控超声波清洗
器，昆山市超声仪器有限公司；RE—52A 旋转蒸发
器，上海亚荣生化仪器厂；SHZ—（III）型循环水
式真空泵，天津华鑫仪器厂；小鼠代谢笼、电子天
平，德国 Sartorius 公司。
补骨脂、肉豆蔻：10 批药材均购自成都市荷花
池中药材市场，经成都中医药大学卢先明教授鉴定
补骨脂为豆科植物补骨脂 Psoralea corylifolia L. 的
干燥成熟果实，肉豆蔻为肉豆蔻科植物肉豆蔻
Myristica fragrans Houtt. 的干燥种仁。
盐炙补骨脂：称取净补骨脂，加入盐水闷润 24
h，以 40 次/min 的频率于 150 ℃的炒锅中炒炙 10
min 后取出，置烘箱内（40 ℃）烘干。每 100 g 补
骨脂用食盐 2 g，50 mL 水溶解食盐[4]。
麸煨肉豆蔻：取净肉豆蔻与麦麸同置锅内，用
文火加热，温度控制在 130～150 ℃，翻炒 20 min，
至麦麸呈焦黄色，肉豆蔻呈棕褐色时取出。麦麸用
量以能掩埋药物为度。
石油醚（60～90 ℃，批号 20130712）、氯仿（批
号 20110413）、醋酸乙酯（批号 20120312）、正丁醇
（批号 20120308），成都市科龙化工试剂厂；色谱纯
甲醇、乙腈，娃哈哈纯净水；1 g/mL 番泻叶药液（自
制）；易蒙停购自西安杨森制药有限公司，批号
110901627，作为阳性药。
补骨脂素、异补骨脂素、去氢二异丁香酚对照
品，均由成都曼斯特生物科技有限公司提供，质量
分数均大于 98%，批号分别为 MUST-12122112、
MUST-12081804、MUST-12062804。
昆明种小鼠，雄性，体质量 18～22 g，由成都
达硕生物科技有限公司提供，合格证号 SCXK（川）
2008-24。
2 方法与结果
2.1 二神丸不同提取部位供试品溶液的制备
采用醇水双提法以使药物提取完全，分别取 10
批次的盐炙补骨脂 20 g和麸煨肉豆蔻 10 g，粉碎（过
2 号筛），加入 8 倍量 75%乙醇回流提取 2 次，时间
分别为 1.5、1 h，合并滤液得醇提液。药渣加入 10
倍量水煎煮 2 次，时间分别为 1、0.5 h，合并滤液
得水提液。醇提液减压回收乙醇至无醇味，与水提
液合并，浓缩得到药液稠膏，加入适量硅藻土拌干，
依次用石油醚（60～90 ℃）、氯仿、醋酸乙酯、正
丁醇和水进行索氏提取，得到 5 个不同提取部位的
浸出物[5]，分别挥干有机溶剂后称取浸膏质量，再
称取浸膏总质量的 2%加入甲醇-氯仿（7∶3）混合
溶液[6]定容至 10.00 mL（由于纯甲醇不能充分溶解
浸膏，加入一定比例的氯仿后可以完全溶解），经
0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得，以备建立不同提取
部位指纹图谱用；其余浸膏分别加入 5%聚山梨酯-80
助溶，配成药物 0.5 g/mL 的各部位药液，合并不同
批次相同部位的药液（10 批次药液混合的药效与 10
批次药物的图谱相对应），即得二神丸 5 个提取部位
的供试液，以备不同提取部位的药效实验用。
2.2 二神丸不同提取部位指纹图谱的建立
2.2.1 色谱条件 色谱柱为 Thermo 柱（250 mm×
4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水，梯度洗脱：0～
15 min，30%～45%乙腈；15～45 min，45%～65%
乙腈；45～55 min，65%～100%乙腈；55～65 min，
100%乙腈；柱温 35 ℃；检测波长 230 nm；进样量
10 μL；体积流量 1 mL/min。
2.2.2 方法学考察[7]
（1）精密度考察：按照“2.1”项下的方法制备
供试品溶液，同一样品精密吸取 10 μL，连续进样 6
次，按“2.2.1”项下色谱条件记录 HPLC 图谱，采
用中药色谱指纹图谱相似度软件（2004A 版）计算
其相似度[7]。结果表明，相似度大于 0.98，仪器的
精密度良好。
（2）重复性考察：取同一批次的二神丸 6 份，
按照“2.1”项下的方法制备供试品溶液，分别精密
吸取 10 μL进样，按“2.2.1”项下色谱条件记录HPLC
图谱，用中药色谱指纹图谱相似度软件（2004A 版）
计算其相似度[6]。结果表明，相似度大于 0.95，该
方法的重复性良好。
（3）稳定性考察：按照“2.1”项下的方法制备
供试品溶液，同一样品精密吸取 10 μL，分别在 0、
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2、6、12、24、48 h 时按“2.2.1”项下色谱条件记
录 HPLC 图谱，用中药色谱指纹图谱相似度软件
（2004A 版）计算其相似度[7]。结果表明，相似度大
于 0.96，样品在 48 h 内稳定性良好。
2.2.3 不同部位指纹图谱的建立 供试液按“2.2.1”
项下的色谱条件建立相应的 HPLC 图谱，通过
Agilent 液相化学工作站和中药色谱指纹图谱相似
度评价软件（2004A 版）处理，选取中位数法分别
生成二神丸 5 个不同提取部位的对照指纹图谱，并
计算其相似度。分离二神丸得到的石油醚部位、氯
仿部位、醋酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位的指
纹图谱，石油醚部位有 24 个共有峰，氯仿部位有
16 个共有峰，醋酸乙酯部位有 14 个共有峰，正丁
醇部位有 10 个共有峰，水部位有 2 个共有峰。见
图 1，其相似度均大于 0.9，共有峰的面积见表 1。
表 1 中编号为 3 号的峰为补骨脂素，编号为 4 号的
峰为异补骨脂素，编号为 21 号的峰为去氢二异丁
香酚。










A-石油醚部位 B-氯仿部位 C-醋酸乙酯部位 D-正丁醇部位 E-水部位
A-petroleum ether part B-chloroform part C-ethyl acetate parts D-n-butanol part E-water parts
图 1 二神丸不同提取部位的指纹图谱
Fig. 1 HPLC fingerprints of different parts of Ershen Pill
2.3 二神丸不同部位的药效实验对比
取健康的清洁级昆明种雄性小鼠（因二神丸
治疗脾肾阳虚之泄泻，故选用雄性小鼠）70 只，
随机分成 7 组，分别为对照组、阳性（易蒙停胶
囊内容物加蒸馏水配制，0.8 mg/kg）组、石油醚
部位组、氯仿部位组、醋酸乙酯部位组、正丁醇
部位组和水部位组，适应性喂养 2 d 后，各组分
别 ig 相应药液 0.2 mL/10 g，对照组 ig 等剂量的纯
A
1
3
4
B
C D
E
6
5 7
8
9 10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23 24
25
0 11.60 23.19 34.79 46.38 57.98
t / min
18
19
20
21
23 24
25
1
3

4
6
7
8
11
12
14
0 11.60 23.19 34.79 46.38 57.98
t / min
25
24 23
21
20
18
1
3
4
6
7
8
11
14
25
2
3
4
6
7 18 14
20
21
0 11.60 23.19 34.79 46.38 57.98
t / min
0 11.60 23.19 34.79 46.38 57.98
t / min
6 2
0 11.60 23.19 34.79 46.38 57.98
t / min
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表 1 二神丸不同提取部位指纹图谱的峰面积
Table 1 Peak areas of HPLC fingerprints of different parts of Ershen Pill
编号
峰面积
石油醚部位 氯仿部位 醋酸乙酯部位 正丁醇部位 水部位
1 160.441 812 2 324.014 923 4 547.239 940 2 0 0
2 0 0 0 9 891.148 294 3 925.295 802
3 4 208.513 926 2 270.060 439 547.238 423 8 258.834 579 7 0
4 3 059.594 942 1 155.046 213 150.985 819 5 354.714 338 9 0
5 213.299 534 9 0 0 0 0
6 3 950.477 225 3 350.592 56 1 891.887 236 2 125.639 859 2 706.975 959
7 385.078 570 5 2 655.134 724 672.181 305 9 136.737 649 6 0
8 1 164.969 438 1 678.862 438 360.951 029 5 0 0
9 221.603 385 1 0 0 0 0
10 280.888 520 2 0 0 0 0
11 1 034.136 315 733.058 505 1 205.871 099 4 0 0
12 157.348 370 5 196.221 829 5 0 0 0
13 213.838 979 8 0 0 0 0
14 991.789 434 3 1 562.849 928 599.687 851 151.620 901 3 0
15 257.322 619 5 0 0 0 0
16 167.942 486 7 0 0 0 0
17 577.895 023 9 0 0 0 0
18 919.455 162 8 1 658.187 008 674.315 511 115.214 753 6 0
19 252.119 456 9 149.402 547 6 0 0 0
20 2 312.138 333 2 660.073 281 1 283.410 743 234.115 855 2 0
21 1 054.590 286 1 245.969 662 552.921 127 8 143.556 264 2 0
22 188.463 958 4 0 0 0 0
23 615.192 034 5 344.726 408 9 160.876 567 3 0 0
24 757.565 241 9 383.134 757 1 194.216 442 7 0 0
25 6 229.037 731 3 230.240 782 1 727.492 639 303.483 775 6 0

水，连续 5 d。实验前小鼠禁食不禁水 12 h，末次给
药后 0.5 h，各组小鼠分别 ig 1 g/mL 的番泻叶药液
0.1 mL/10 g，随后将小鼠放入自制代谢笼中，下垫
滤纸，每隔 1 h 更换 1 次，连续观察小鼠 5 h 内的排
便情况，记录干便数、稀便数、稀便直径，计算稀
便级、稀便率及腹泻指数[8]。结果见表 2。
稀便级：表示稀便的程度。以稀便污染滤纸形
成污迹面积的大小定级。分为 4 级，标准：级数（污
染直径）：1（＜1 cm）、2（1～1.9 cm）、3（2～3 cm）、
4（＞3 cm）。统计时先逐个统计每一堆稀便的级数，
然后将该鼠所有稀便级数相加除以稀便次数得稀便
的平均级数。
稀便率＝稀便数 / (干便数＋稀便数)
腹泻指数＝稀便率×稀便级
表 2 不同提取部位组药物对小鼠腹泻指数的影响
( ± = 10x s , n )
Table 2 Influence of different parts on diarrhea index
of mice ( ± = 10x s , n )
组别 剂量 / (g·kg−1) 腹泻指数
对照 — 0.65±0.20
阳性 0.000 8 0.46±0.15*
石油醚部位 10 0.39±0.16**
氯仿部位 10 0.44±0.16*
醋酸乙酯部位 10 0.55±0.14
正丁醇部位 10 0.66±0.26
水部位 10 0.68±0.26
与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01
*P < 0.05 **P < 0.01 vs control group
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表 2 结果显示，与对照组的腹泻指数相比，石
油醚部位组有极显著性差异（P＜0.01），阳性组和
氯仿部位组有显著性差异（P＜0.05）；与阳性组的
腹泻指数相比，石油醚部位和氯仿部位均无显著性
差异（P＞0.05）；石油醚部位组的腹泻指数与氯仿
部位组相比无统计学意义（P＞0.05），但石油醚部
位组降低番泻叶所致急性腹泻小鼠腹泻指数的趋势
更明显。
2.4 二神丸不同部位指纹图谱与其止泻药效的灰
关联分析
2.4.1 原始数据的变换 原始数据的变换采用均值
化变换法。以药效数据即腹泻指数作为参考序列，
指纹图谱共有峰的峰面积作为比较序列，采用均值
化的方法变换原始数据得到均值化处理序列。
2.4.2 求绝对差序列 经数据变换的参考序列记为
Y0(m)，比较序列记为 Yi(m)，计算各比较序列同参考
序列的绝对值，即绝对差序列 Δ0i(m)＝|Y0(m)－Yi(m)|。
2.4.3 求关联系数 关联系数反映 2 个被比较序列
的靠近程度。求参考序列 {Y0(m)} 与比较序列
{Yi(m)} 的关联系数，取分辨系数 ρ＝0.5（0＜ρ＜1，
这个系数可调，目的在于调节最后结果是否明显，一
般取 0.5），计算公式为 K0i＝(Δ0i min＋ρΔ0i max) / (Δ0i＋
ρΔ0i max)
2.4.4 求关联度，排关联序 关联度即各共有峰关
联系数的平均值，将各关联度按大小顺序排列起来
即得关联序[9-13]。关联序能直接反映比较序列对参
考序列贡献的大小，从而可阐明二神丸不同部位指
纹图谱中各共有峰对其止泻药效贡献的大小，揭示
二神丸产生止泻作用的主要药效物质。灰关联分析
数据见表 3。
表 3 二神丸不同部位指纹图谱与其止泻药效的灰关联分析
Table 3 Grey relational analysis of fingerprints and anti-diarrheic
effect of different parts from Ershen Pill
编号 关联度 编号 关联度 编号 关联度
1 0.712 4 10 0.604 4 19 0.620 6
2 0.714 4 11 0.659 9 20 0.722 7
3 0.665 8 12 0.614 2 21 0.719 1
4 0.675 6 13 0.604 4 22 0.604 4
5 0.604 4 14 0.719 6 23 0.684 9
6 0.838 7 15 0.604 4 24 0.688 9
7 0.723 5 16 0.604 4 25 0.700 7
8 0.662 8 17 0.604 4
9 0.604 4 18 0.729 6
由表 3 中不同部位指纹图谱与其止泻药效的会
关联分析数据可知，对止泻药效贡献较大的共有峰
（编号）主要有 6 号＞18 号＞7 号＞20 号＞14 号＞
21 号＞1 号＞25 号＞24 号＞23 号＞4 号＞3 号＞8
号＞11 号，且这些共有峰的关联度相差较小。虽然
2 号共有峰的关联度也较大，但结合表 1 可知，2
号峰在石油醚、氯仿和醋酸乙酯部位几乎没有，而
这 3 个部位又是产生止泻药效的部位，故 2 号峰所
代表的物质可能不是药效成分。
3 讨论
本实验建立了二神丸（盐炙补骨脂＋麸煨肉豆
蔻）不同部位的指纹图谱，方法简便，重复性良好。
经对比不同部位药液对番泻叶所致急性腹泻小
鼠腹泻指数的影响，可知石油醚和氯仿部位降低小
鼠腹泻指数的作用较强，提示二神丸中产生止泻作
用的主要是极性较小的化学成分。
经不同部位指纹图谱与其温脾止泻药效的灰关
联分析，可知多种成分对二神丸止泻药效的关联度
均较大，推测药效成分不是单一成分，可能是多种
成分共同产生作用的，二神丸不同部位指纹图谱与
其温脾止泻药效之间有一定的对应关系。
本实验在建立二神丸不同提取部位的指纹图谱
时，考察了甲醇-水和乙腈-水 2 种流动相系统，结
果表明以乙腈-水系统进行梯度洗脱时各色谱峰的
分离效果较好，且色谱峰的数目较多，故选用乙腈-
水系统为流动相；考察了 25、30、35 ℃ 3 种柱温，
表明 35 ℃是色谱峰的分离效果优于其他 2种柱温；
对于检测波长的选择，采用 DAD 检测器考察了
210、230、246、254、270、280 nm，在 230 nm 时
分离效果最佳；考察了溶解样品溶剂，单独用甲醇
溶解时样品溶液较浑浊，放置后有白色絮状沉淀析
出，在甲醇中加入不同比例的氯仿后沉淀逐渐溶解，
用甲醇-氯仿（7∶3）作溶剂时各部位样品溶解完全。
饮片炮制和复方入药是中医用药的特色，近年
来对中药炮制的研究多局限于单味药，很少纳入复
方中研究，导致中药炮制的研究与中医临床复方入
药的实际不相符。本实验将中药炮制纳入复方二神
丸中展开研究，经筛选出药效最佳的炮制品组合后，
经建立不同部位谱效关系以更全面地揭示其药效物
质基础，为二神丸中药物炮制机制的研究提供依据。
参考文献
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后在“二神丸”中对脾肾阳虚泄泻小鼠的止泻研究 [J].
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