全 文 :中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 6 期 2013 年 3 月
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• 药理与临床 •
应用 SOS/umu 测试筛选抗丝裂霉素 C 遗传毒性的植物源细胞保护剂
古绍彬 1,杨 彬 1,贺嘉怡 1,吴 影 1,杨剑波 2,李 浩 2
1. 河南科技大学食品与生物工程学院,河南 洛阳 471023
2. 安徽省农业科学院,安徽 合肥 230031
摘 要:目的 建立一种快速筛选抗丝裂霉素 C 遗传毒性的植物提取物的体系和方法。方法 采用鼠伤寒沙门氏菌 Salmonella
typhimurium TA1535/pSK1002 以及小鼠急性毒性实验,通过 SOS/umu 测试评价菊花、大蒜、生姜、银杏叶、人参、葡萄籽、
绿茶、灵芝、刺五加、大豆 10 种植物提取物及部分提取物组合对丝裂霉素 C 遗传毒性的影响。结果 大蒜、葡萄籽、绿茶、
刺五加、大豆提取物有较强的抗突变能力,刺五加提取物 1.5 g/L 对丝裂霉素 C 遗传毒性的抑制率达 67.12%;这 5 种植物提取
物两两组合的抗细胞畸变能力明显优于单个提取物,尤以刺五加-绿茶和刺五加-葡萄籽两种组合的作用最强,其中刺五加-绿茶
组合物对丝裂霉素 C 遗传毒性的抑制率最高达 83.2%。小鼠体内实验显示,刺五加-绿茶显著降低经丝裂霉素 C 作用的小鼠
微核率和精子畸变率,明显提高小鼠胸腺指数。结论 SOS/umu 测试不仅是一种快速评价植物提取物的抗突变能力的有效
方法,还可作为一种细胞保护剂快速筛选模型对候选植物提取物或化合物进行高通量筛选。
关键词:植物提取物;丝裂霉素 C;遗传毒性;细胞保护剂; SOS/umu 测试
中图分类号:R282.710.5 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2013)06 - 0709 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.06.015
Application of SOS/umu in screening cytoprotectors of plants against mitomycin
C-induced genotoxic damage
GU Shao-bin1, YANG Bin1, HE Jia-yi1, WU Ying1, YANG Jian-bo2, LI Hao2
1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China
2. Anhui Academy of Agricultural Science, Hefei 230031, China
Abstract: Objective To establish a system and method for screening plant extract against mitomycin C-induced genotoxic damage.
Methods Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002 and acute toxicity experiment of mice were used, and the effects of the
extracts from ten plants, Chrysanthemis Flos, Allii Bulbus, Zingiberis Rhizoma Recens, Ginkgo Folium, Ginseng Radix et Rhizoma,
Vitis Viniferae Semen, Gemmae Camelliae Sinensis Folium, Ganoderma, Acanthopanacis Senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis, and
Sojae Semen, and the extract combinations on mitomycin C-induced genotoxic damage were observed by SOS/umu test. Results
Significantly protective effects of five extracts, including the extracts from Allii Bulbus, Vitis Vindferae Semen, Gemmae Camelliae
Sinensis Folium, Acanthopanacis Senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis, and Sojae Semen against mitomycin C-induced genotoxicity
were observed. Acanthopanacis Senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis extract (1.5 g/L) could inhibit the mitomycin C-induced
genotoxicity (67.12%). Combinations of any two extracts showed higher antimutagenic capacity than any single one. Among all the
combinations, Acanthopanacis Senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis-Gemmae Camelliae Sinensis Folium and Acanthopanacis
Senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis-Vitis Viniferae Semen showed the highest activity, and the inhibition rate of the former against
the mitomycin C-induced genotoxicity was 83.2%. In vivo tests showed that Acanthopanacis Senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis-
Gemmae Camelliae Sinensis Folium could significantly decrease the micronucleus rate and sperm abnormality rate of mice induced
by mitomycin C and also increase the thymus indexes. Conclusion Based on the results, it is clearly proved that the SOS/umu is not
收稿日期:2012-05-26
基金项目:安徽省农业科学院委托开发项目(1848)
作者简介:古绍彬(1975—),男,副教授,博士,研究方向为环境毒理学。E-mail: shaobingu@haust.edu.cn
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only a useful and convenient way to evaluate the antimutagenic ability of plant extracts, but also could be used as a kind of rapid
screening model for cytoprotector with high throughput screening of candidate extracts or compounds.
Key words: plant extract; mitomycin C; genotoxicity; cytoprotector; SOS/umu test
丝裂霉素 C(mitomycin C)是临床上广泛使用
的抗生素类抗肿瘤药物。然而丝裂霉素 C 在抑制癌
细胞增殖的同时,对机体细胞 DNA 也有很大损伤,
且其还是一种强的诱变剂,长期用药有诱发第 2 肿
瘤的风险[1]。因此开发一种合适的细胞保护剂与丝
裂霉素 C 合用,对降低丝裂霉素 C 的不良反应具有
重要意义。近年来,天然植物提取物因含有多种生
物活性成分,对细胞能产生抗氧化、免疫调节、抗
突变等多种药理作用,毒副作用小等特点而成为被
关注的焦点之一[2]。
依靠动物实验从天然物质中筛选抗突变药物,
耗时费力,经费投入大,且由于药物筛选要求实验
方案标准化和定量化,因此传统的动物实验在药物
筛选中较少应用。细胞水平的药物筛选虽然是更接
近生理条件的一种药物筛选模型,准确率更高,但
需要建立细胞模型,操作更复杂,成本更高,且干
扰较多,不易排除,数据间的平行较差[3]。鼠伤寒
沙门氏菌 Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002
为产生 β-半乳糖苷酶的 lacZ 报告基因与操纵子
umuC 基因相融合,通过 pSKl002 质粒整合于鼠伤
寒沙门氏菌 TAl535 菌株的 DNA 中,umuC 基因在
正常情况下被阻遏蛋白所封闭,一旦其 DNA 受到损
伤,细菌即产生 SOS 反应,生成具有活性的蛋白水
解酶 recA,该酶介导 lexA 蛋白的裂解,使受封闭的
umuC 操纵子启动,并带动 lacZ 基因转录、翻译,
生成 β-半乳糖苷酶,根据 β-半乳糖苷酶的生成量,
即可判断DNA受损的程度。本实验参考文献方法[4],
尝试利用单细胞微生物鼠伤寒沙门氏菌和 SOS/umu
测试,建立抗丝裂霉素 C 遗传毒性的植物提取物体
外筛选方法,并结合中药复方配伍理论[5-6],将筛选
到的具显著抗细胞畸变活性的植物提取物配对组
合,进行小鼠体内实验,以进一步评价和验证筛选
结果,从而建立抗细胞畸变药物或植物提取物的快
速、高通量的筛选体系。
1 材料
1.1 植物提取物与试剂
菊花、大蒜、生姜根、银杏叶、人参根、葡萄籽、
灵芝、绿茶、刺五加、大豆提取物,安徽宜城百草植
物工贸有限公司,有效成分及质量分数见表 1。
表 1 植物提取物有效成分及其质量分数
Table 1 Active components and their contents
in plant extracts
植物提取物 有效成分 质量分数 / %
菊花提取物 绿原酸 0.25
大蒜提取物 大蒜素 1.00
生姜提取物 姜酚 5.92
银杏叶提取物 银杏黄酮糖苷 26.75
人参根提取物 人参皂苷 13.12
葡萄籽提取物 原花色素 95.72
绿茶提取物 茶多酚 91.55
灵芝提取物 灵芝多糖 32.13
刺五加提取物 刺五加总苷 11.20
大豆提取物 异黄酮 41.22
丝裂霉素 C(批号 527AHA01),Sigma 公司;
氨苄青霉素(批号 05111059)、二甲基亚砜(DMSO)、
β-巯基乙醇、十二烷基硫酸钠(SDS)、2-硝基苯基-
β-D-半乳糖苷(ONPG),Fluka 公司。
1.2 主要仪器
SW—CJ—1F 型单人双面净化工作台,苏州净化
设备有限公司;MODEI680 酶标仪,美国伯乐公司。
1.3 菌株与动物
鼠伤寒沙门氏菌 TA1535/pSK1002,由安徽省
农业科学院提供;昆明种雄性小鼠,二级清洁,体
质量(20±2)g,河南省实验动物中心提供,许可
证号:SCXK(豫)2005-0001。
2 方法
2.1 丝裂霉素 C 质量浓度的筛选
取培养过夜的鼠伤寒沙门氏菌悬液 1 mL,分别
涂布于含 0.1、1、5、10、50、100、500、1 000 mg/L
丝裂霉素 C 的 LB 平板培养基上(每个培养皿含 50
μg/mL 氨苄青霉素),37 ℃ 培养 24~48 h,观察丝
裂霉素 C 对鼠伤寒沙门氏菌生长的影响。
2.2 SOS/umu 测试筛选细胞保护剂
2.2.1 筛选实验 参照Oda等[7]的SOS/umu遗传毒
性测试方法,通过分析鼠伤寒沙门氏菌 TA1535/
pSK1002 β-乳糖苷酶活性及抑制率,研究菊花、大
蒜、生姜根、银杏叶、人参根、葡萄籽、绿茶、灵
芝、刺五加、大豆 10 种植物提取物对丝裂霉素 C
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遗传毒性的影响,提取物使用剂量参照《中国药典》
2010 年版相关使用剂量[8]。筛选出的具有显著活性
的提取物,两两组合,使单一提取物有效成分质量
浓度为 1 g/L,将其加至含 0.1 mg/L 丝裂霉素 C 的
LB 液体培养基中,同法考察各组合物对丝裂霉素 C
的抗畸变作用,筛选出具有最佳细胞保护作用的植
物提取物组合物。同时以无菌生理盐水代替植物提
取物作为对照组。
2.2.2 评价指标
(1)通过菌液在 550、420、600 nm 处的吸光
度(A)值,计算 β-半乳糖苷酶活性[8]。
酶活性=1 000×(A420-1.75×A550) / (t×v×A600)
A600为 600 nm 波长下的 A 值;A420为菌液在 420 nm 波长下
的 A 值(显色剂 ONPG 的显色强度);A550为菌液在 570 nm
波长下的 A 值(细胞破壁后的碎片浊度);t 为加入 ONPG
后的反应时间(25 min),v 为反应菌液在显色过程中的稀释
倍率(0.1)
(2)通过 β-半乳糖苷酶活性计算样品对其的诱
导比(R),R>2 时,样品的致突变性为阳性。
R=给药组β-半乳糖苷酶活性 / 对照组β-半乳糖苷酶活性
(3)计算提取物对丝裂霉素 C 遗传毒性的抑
制率。
抑制率=(R 对照-R 样品) / R 对照
2.3 体内实验
将 30 只小鼠随机分成 3 组(每组 10 只),其中
2 组分别给予具有较强细胞保护作用的前 2 种植物
提取物组合,每日均 ig 给予药液 2 mg/kg(0.10 g/L,
0.2 mL/10 g)1 次,连续给药 2 周后,每天 ip 丝裂
霉素 C 1 mg/kg ,连续给药 1 周,期间继续给予提
取物组合;另一组小鼠 ig 生理盐水。给药结束后小
鼠颈椎脱臼处死,打开腹腔,取股骨骨髓细胞、胸
腺和副睾,分别检查微核指数、胸腺指数和精子畸
变率,以判断提取物组合的抗畸变和细胞保护作用。
3 结果
3.1 丝裂霉素 C 质量浓度的确定
丝裂霉素 C 为 1 mg/L 时,鼠伤寒沙门氏菌停
止生长。丝裂霉素 C 为 0.1~1 000 mg/L 时,对鼠
伤寒沙门氏菌生长的抑制毒性见表 2。为确保实验
的可靠性,故选取 0.1 mg/L作为实验最高质量浓度。
3.2 SOS/umu 测试筛选细胞保护剂
从R值可见,随着丝裂霉素C质量浓度的增加,
其对鼠伤寒沙门氏菌 TA1535/pSK1002 的遗传毒性
急剧增强;丝裂霉素 C 在 0.02 mg/L 时,其遗传毒
表 2 丝裂霉素 C 对鼠伤寒沙门氏菌 TA1535/pSK1002
生长的影响
Table 2 Effect of mitomycin C on growth of S.
typhimurium TA1535/pSK1002
丝裂霉素 C /
(mg·L−1)
生长抑制率 /
%
丝裂霉素 C /
(mg·L−1)
生长抑制率 /
%
0.1 0.03 50 100.00
1 35.10 100 100.00
5 94.20 500 100.00
10 98.70 1 000 100.00
性增强开始放缓;0.05 mg/L 时,呈现明显的平台效
应区,见图 1。为确保在后续具细胞保护作用提取
物筛选过程中丝裂霉素 C 遗传毒性的稳定性,并参
考临床人用药剂量和对哺乳动物细胞模型的丝裂霉
素 C 的用量[9],将后续实验中丝裂霉素 C 质量浓度
确定为 0.1 mg/L 进行。
图 1 丝裂霉素 C 对鼠伤寒沙门氏菌 TA1535/pSK1002 umu
基因表达影响
Fig. 1 Effect of mitomycin C on gene expression
of S. typhimurium TA1535/pSK1002 umu
刺五加、大蒜、绿茶、葡萄籽、大豆提取物中
有效成分质量浓度较高时,对丝裂霉素 C 处理后的
S. typhimurium TA1535/pSK1002 均表现出细胞保护
作用,与文献报道相符[10-16]。灵芝提取物和银杏叶
提取物的作用则弱于上述 5 种提取物,其余 3 种植
物提取物无明显作用。结果见表 3。
大蒜、刺五加、大豆、绿茶及葡萄籽提取物两
两组合,均比单一提取物的细胞保护作用更强,其
中绿茶和刺五加提取物组合对丝裂霉素 C 遗传毒
性的抑制率达 83.2%。结果见图 2。化疗药物可激
发胞内内源性活性氧(ROS)的产生,而 ROS 进
一步攻击细胞膜及生物大分子物质,从而造成脂质
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
R
丝裂霉素 C / (mg·mL−1)
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表 3 植物提取物对丝裂霉素 C 致 S. typhimurium TA1535/pSK1002 遗传毒性的影响 ( 6=± n , sx )
Table 3 Effects of plant extracts on mitomycin C-induced genotoxicity in S. typhimurium TA1535/pSK1002 ( 6=± n , sx )
植物提取物 有效成分 / (g·L−1) R 抑制率 / % 植物提取物 有效成分 / (g·L−1) R 抑制率 / %
葡萄籽提取物 0.001 9.33±0.48 2.00 菊花提取物 0.000 1 9.11±0.58 4.31
0.01 8.73±0.69 8.30 0.001 9.02±0.65 5.25
0.1 7.57±0.52** 20.48 0.01 8.90±0.49 6.51
1 6.50±0.53** 31.72 0.05 9.33±0.51 2.00
5 5.76±0.61** 39.50 0.25 8.67±0.57 8.93
绿茶提取物 0.01 9.16±0.50 3.78 大蒜提取物 0.001 7.33±0.54** 23.00
0.1 8.02±0.55** 15.76 0.01 6.23±0.62** 34.56
1 6.78±0.46** 28.78 0.05 5.85±0.66** 38.55
10 5.52±0.52** 42.02 0.25 5.36±0.54** 43.70
50 4.23±0.66** 55.57 1.25 4.84±0.71** 49.16
灵芝提取物 0.001 10.21±0.62 - 生姜提取物 0.001 9.27±0.52 2.63
0.01 9.35±0.56 1.79 0.01 9.81±0.66 -
0.1 8.79±0.48 7.67 0.1 8.98±0.54 5.67
1 8.32±0.49* 12.61 1 9.04±0.59 5.04
5 7.06±0.57** 25.84 5 8.86±0.58 6.93
刺五加提取物 0.001 8.29±0.76* 12.92 银杏叶提取物 0.01 8.95±0.53 5.99
0.01 7.43±0.71** 21.95 0.1 9.43±0.43 0.95
0.1 4.86±0.60** 48.95 1 9.21±0.49 3.26
0.5 3.93±0.77** 58.72 5 8.58±0.58 9.87
1.5 3.13±0.87** 67.12 25 7.54±0.60** 20.80
大豆提取物 0.001 8.91±0.72 6.41 人参根提取物 0.01 9.76±0.48 -
0.01 8.19±0.70* 13.97 0.1 9.82±0.57 -
0.1 7.43±0.57** 21.95 0.5 8.59±0.55 9.77
1 6.85±0.55** 28.05 2.5 8.76±0.49 7.98
5 6.28±0.77** 34.03 12.5 8.97±0.56 5.78
同一植物提取物不同质量浓度比较:*P<0.05 **P<0.01
*P < 0.05 **P < 0.01 vs the same plant exact at different concentration
过氧化、蛋白质氧化及 DNA 氧化损伤等。因此推
测绿茶中的黄酮类及刺五加中的皂苷类化合物影
响丝裂霉素 C 活化过程中半醌自由基的产生,降
低半醌自由基在胞内引发的自由基链反应,减轻
DNA 损伤,从而降低丝裂霉素 C 对鼠伤寒沙门氏
菌的遗传毒性。此外,这两种植物提取物中的其他
组分是否通过与丝裂霉素 C 形成复合物,或者通
过某种形式激活 DNA 修复机制,减少 DNA 损伤
还有待进一步的研究。
3.3 体内实验
与丝裂霉素 C 组相比,绿茶-刺五加提取物组合
组的微核率仅为 0.437%,精子畸变率为 18.42%,
胸腺指数为 2.42;葡萄籽-刺五加组合物组的微核率
仅为 0.524%,精子畸变率为 25.08%,胸腺指数为
2.18,与丝裂霉素 C 组相比,绿茶-刺五加组合组、
葡萄籽-刺五加组合组的微核率、胸腺指数和精子畸
变率差异显著(P<0.05、0.01),但 2 组间微核率、
胸腺指数和精子畸变率差异不显著(P>0.05)。实
验结果初步证实绿茶-刺五加和葡萄籽-刺五加提取
物组合具有较好抗细胞畸变能力。结果见图 3。
4 讨论
近年来发现了一些对丝裂霉素 C 遗传毒性具有
抑制作用的药用植物及其有效成分[17-22],且用于筛
选抗遗传毒性的药物方法很多[23-28]。如何用一种简
单经济的方法,在同一水平上快速筛选和评价抗化
疗药物遗传毒性作用的药物,尤其是中药或天然植
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与组合中单一植物提取物比较:*P<0.05 **P<0.01
*P < 0.05 **P < 0.01 vs individual extract in plant combination
图 2 植物提取物及其组合对丝裂霉素 C 致 S. typhimurium TA1535/pSK1002 遗传毒性的影响 ( 6=± n , sx )
Fig. 2 Effects of plant extracts and their various combinations on mitomycin C-induced genotoxicity
in S. typhimurium TA1535/pSK1002 ( 6=± n , sx )
与丝裂霉素 C 比较:*P<0.05 **P<0.01
*P < 0.05 **P < 0.01 vs mitomycin C
图 3 植物提取物组合对丝裂霉素 C 诱导的小鼠遗传毒性的影响 ( 10=± n , sx )
Fig. 3 Effects of various plant extract combinations on mitomycin C- induced genotoxicity of mice ( 10=± n , sx )
物提取物是研究者关注的课题。Bartolome 等[29]曾尝
试用大肠杆菌 RS4U(携带红色荧光蛋白基因)来快
速评价几种植物提取物的抗遗传毒性。在基于对微
生物的遗传毒性测试体系中,SOS/umu 是目前国际
标准化组织(ISO)和国际经济合作与发展组织
(OECD)唯一推荐使用的[30]。本研究以鼠伤寒沙门
氏菌 TA1535/pSK1002 为材料,应用 SOS/umu 测试,
并结合中药复方配伍及其作用机制研究成果[5-6],将
筛选到的具有显著抗丝裂霉素 C 遗传毒性的植物提
取物两两组合,再经 SOS/umu 测试复筛以获得效果
最佳的候选药物,并用小鼠体内实验对这些组合进一
步进行评价和验证,从而建立了一种快速、高通量筛
选抗遗传毒性药物或植物提取物的体系。SOS/umu
试验不仅在遗传毒理学、酶代动力学、环境监测与质
量评估以及药效学评价等方面得到应用,也将在抗遗
传毒性药物的快速筛选方面发挥优势。
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大蒜 葡萄籽 绿茶 刺五加 大豆 大蒜+ 大蒜+ 大蒜+ 大蒜+ 葡萄籽+ 葡萄籽+ 葡萄籽+ 绿茶+ 绿茶+ 刺五加+
葡萄籽 绿茶 刺五加 大豆 绿茶 刺五加 大豆 刺五加 大豆 大豆
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
抑
制
率
/
%
* **
50
40
30
20
10
0
7
6
5
4
3
2
1
0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
**
**
**
**
**
*
精
子
畸
变
率
/
%
微
核
率
/
%
胸
腺
指
数
绿茶+刺五加 葡萄籽+刺五加 丝裂霉素C 绿茶+刺五加 葡萄籽+刺五加 丝裂霉素C 绿茶+刺五加 葡萄籽+刺五加 丝裂霉素C
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