全 文 ：庙变 · 琦变 · 突变 1, 93 年第 5卷第 4 期
原位缺口翻译技术检测兴安升麻总皂贰的抗突变作用
林 新 李 革 ` 李文魁 蔡有余 , 肖培根
中国医学科学院药用植物资源开发研究所 北京 10 0 0 94
, 中国医学科学院实验动物研究所 北京 10 。。21
摘要 本文采用原位缺口翻译技术 , 液闪计数测定 , 观察了兴安升麻总皂贰拮抗诱变剂丝裂霉素
q M M c) 对人外周血细胞的致突变作用 . 结果表明 : 兴安升麻总皂贰具有很强的抗突变作用 , 同时提
示 : 此技术是 1种快速 、 灵敏 、 定量检测 D N A 损伤的方法 .
关键词 原位缺口翻译 ; 兴安升麻 ; 总皂贰 ; 抗突变 ; 丝裂霉素 c
L又 S IT U N I C K T R A N S L A T I O N M E T H O D R E V E A L S T H E
AN T IM U T A G E N I C E F F E C
`
T O F T H E T O T A L S A P O N I N S
O F C 刀汀 I C L尸口G A D A H U ,R I C A
工in ,ir n , 二一` e ] , 乙一脸。无u i , ca i 物妙 u ] , x at o 尸日ig e 刀
nI s t i t u t e o f M e d i e i n a l P l a
n t D e v e l o P m e n t
,
C h i n e s e A e a d e m y o f M e d i
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B e i jin g 10 0 09 4
I n s it t u t e o f L a b o r a t o r y A n im a l S e i e n e e s
,
C h i n e s e A e a d e m y o f M e d i e a l S e i e n e
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B e i jin g 10 00 2 1
A加 t r a e t T h e a : l it m u t a g e n ie e cf e t o f t h e t o t a l s a P o n i n s o f C加 ic J’fo g a da h u r ic a o n
m u t a g e n i c i t y o f n o r m a l l z u m a n p e r iP h e r a l b l o o d e e l l s i n d u e e d b y M M C w e
r e q u a n it t a it v e l y
d e t e e t e d b y u s i n g i n s i t u n i e k t r a n s l a t i o n m e t h o d a o d il q u i d s e in t il l a t i o n e o u n it n g
.
T h e r。
su l t s s h o w e d t h a t t h e t o t a l s a P o n i n s o f C ha i
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n ie k t r a n s l a t i o n m e t h o d P r o v id e d a r a P id a n d s e n s i t i v e q u a n it t a it v o a s s a y
fo r d。协e it n g D N A d a m a g e .
K e y w o r d s i n s it u n i e k t r a n s l a ti o n ; e如 i e ifo g a 由h u r i e a . t o t a l s a P o n i n s ; a n t :扭 u t a t i o n ;
m i t o x m y e i n
兴 安 升 麻 ( e im i e i fu g a d a h u r i c a
汀 u cr a . ) M a ix m )作为民间常用 中草药已有
1千多年的历史 . 宋朝前 , 升麻主要用于
` 毒 ’ , 对 中医辨证时定性为 “ 毒 ’ 的情
, 如 `温毒 , 、 伙毒 ” 、 `疫毒 ” 和误食某些
一 36一
药物或食物引起的中毒等均有不同程度的
解 `毒 ’ 疗效 (1) . 宋朝后 , 升麻传统疗效为
散风解毒 、 透疹 、 去风湿 , 升阳止泻治疗
子宫下垂 、 胃下垂等疾病 . 现代药理研究
表明 : 兴安升麻具有抗炎 、 镇痛作用 (.)z
解况
但在分子水平上检测兴安升麻的抗突变作
用尚未见报道 , 为此 , 我们进行了这方面
的工作 .
10 m l蒸锢水破细胞 、 10 m 15 % 三氛醋酸去
细胞蛋白 , IOm l无水乙醇固定细胞 D N A
进行抽滤 , 用 B e比m an 闪烁仪测定 C pm
值 .
材料和方法
1
. 主要试剂
1
.
1
. 兴安升麻总皂贰 : 为药植所化学
室博士李从军从辽宁本溪采集的兴安升麻
(C im ic ifo g
a
da 加 r i e a (T u r e z . ) M a 劝m )的根
茎中提取的水提物 .
1
.
2
. 缺口翻译试剂盒 : 华美生物工程
公司产品 .
1
.
3
.
.E C iol D N A 聚合物 I : 华美生
物工程公司产品 .
1
.
4
. 丝裂霉素 C (M M C ) : 5 1脚 a 公司
产品 ,
1
.
5
. ’ H 一dT :R 北京原子能所产品 .
2
. 方法
2
.
1
. 细胞培养及其处理 : 将健康人外
周 静 脉抗 凝血 接 种于 24 孔 培养 板 中
( 10 。川 / 孔 ) , 每孔加人 P H A s m g 及含
10 % 的小 牛血 清 R PM I 16 40 培养液 至
l m l
,
3 7℃饱和湿度下培养 24 h 后 , 分别
加人致突变剂 M M C ( 0 . 0 5料g / m 一) 和不
同浓度的兴安升麻总皂贰 , 阴性对照组每
孔加等量的 R PM I 1 640 培养液 , 继续培
养 2 4 h 。
.2 2
. 缺 口翻译 : 收集上述细胞于小试
管中 , 离心 ( 90 o r / m i n )后用 P B S 洗涤 l
次 , 于各管中依次加人下列试剂 : ( l) 核
昔酸混合液 d( G TP , d C T P , d A仰 等量混
合 ) 5井l ; ( 2 ) 缺 口翻译缓冲液 5拜1: ( 3 )
3
H一 T d R ( 1m e i / m l ) 5月1; ( 4 ) 无菌去离
子 水 2 3料l : ( 5 ) E . c o il D N A 聚 合 酶
1 a U / m l) 5川 . 将上述反应管迅速放人
15 ℃水浴 , 反应 l h 后 , 每管加 知 1终止液
终止反应 .
.2 3
. 液闪侧定 : 将上述终止反应的各
管细胞转移至抽滤玻璃纤维纸上 , 依次用
结 果
M M C 对细胞 D N A 有明显的损伤作
用 , 但若同时加人不同浓度的兴安升麻总
皂贰 , 其对 M M c 致突变作用有不同的拮
抗 , 随着兴安升麻总皂贰的浓度增高 , 其
拮坑作用逐渐增强 , 见表 1 及图 1、 2 . 经
统计学处理 , 与阳性对照组和阴性对照组
比较 , 分别有显著统计学差异 (尸 < 0 . 0 5一
尸 < 0 . 0 1 ) .
表 1 兴安升麻拮抗 M M C 的致突变作用
月曰气ó.、砂呢口n目o甘nà…刃00ōU
胡比呀
朋性对照组
阳性对照组
高剂盆组
中剂 t 组
低剂盆组
M M C 兴安升麻
伽g / 功】) 伽g / m l ) 印mx( 土刁
17 5
.
0
4 3
.
7 5
1 0
.
9 4
3 2 7 8
.
0 土 5 6 2 . 2 , .
印 , 4 . 6 7土 4 6 1 ` 5二
4 5 7
.
0 0土 1 6 3. 0 1
1 17 7
一
33土 2 39 . 5 0
16 ,` . 0 士 2 54 . 1 6
, 与阴性对照组比较 P < .0 01
与阳性组寸照组比较 尸 《 .0 0 5
讨 论
已有报道 (3) , M M c 具有较强诱发姐
妹染色单体交换频率升高和染色体畸变的
效应 , M M C 诱发的染色体畸变多为单体
断裂和单体交换 , M M C 的结构与烷化剂
相似 , 其损伤 D N A 的机制一般认为是由
于 M M C 的活性基因与碱基 (主要是鸟嚷
吟 ) 结合所致 .
兴安升麻总皂贰具有广泛的生物学活
性 , 考虑到升麻传统的解 “ 毒 ’ 疗效及现代
研究的抗炎作用 , 我们进行了兴安升麻的
抗突变实验 , 结果表明兴安升麻总皂贰具
有拮抗 M M C 的致突变作用 . 其作用机制
可能与兴安升麻能够提高抗氧化酶 (S O D ,
G s H一 P x , C A )T 活性和解酶酶谷胧甘肤转
一 3 7一
硫酶 (G sT) 的活性 (’) , 清除致突变剂产生的 作用机制有待进一步探讨 .
亲核基因及减少自由基的产量有关 . 详细
.三对恻
男`二
. 曰` ~ . ~一一-一~ ~ ~ ~ 翻一 X1 0 . 93 4 3 . 7弓 1了5 . 0兴安升麻的终浓度 ( ” / 恤幼图 l 兴安升麻的剂量与其阻断丝裂霉素 (C M M c) 诱导染色体单链断裂的关系。O弓位U`护、。`皿
乞一减
华忿台
10
. 兮3 43. ?弓 5 . 0
兴安升麻的终浓度 ( p g项切
图 2 兴安升麻的剂量与其阻断丝裂霉索 (C M M )C诱导染色体单链断裂的关系
本实验提示原位缺口翻译技术 , 液闪
测定是 1 种十分敏感的定量检测 D N A 损
伤的方法 . 其原理在于大肠杆菌 D N A 聚
合酶 I 对 D N A 缺 口有剪除与连接核昔酸
的能力 , 同时可将反应混合液中的核昔酸
三磷酸来代替原来的核昔酸 (5) . 因此新合
成的核昔酸量可反映出 D N A 链的损伤 .
(下转第 13 页 )
一 38一
而增加 ( P < 0. 0 1) , 呈典型 的剂量一效应
关系 . 在我们的实验中 , M M c 、 N is o 小
B【a ]P 、 e s E 等不同类型 的诱变剂均可直
接或间接诱剂发细胞微核的形成 , 表明
C B 微核法适用于多种不同类型环境诱变
齐呀的检测 .
表 4 不同细胞株对 lB al P 和 C S E 代谢活化能力反应的差异
细胞株
C H L
诱变剂 5 9 C B 傲核率沁 5 9、 与 5 9一间的 尸值
绍3126职
B A L B / C
一 3丁3
C S E
( 10召g / m l)
B [a JP
( 5刀g / m l)
对照组
C S E
( 5召g / m 】)
B l a ]P
( 5户g / m l)
对照组
+ 9 7 * > 0 0 5
一 8 8 *
< .0 0 5
/
> 0
.
0 5
9 7 今
10 6
. < 0
.
0 1
> 0
,
0 5
牢,ùné甘``,J,
与对照组比较微核率的增高有统计学意义 (P < .0 05 )
参考文献
1
.
F e n e e h M
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r m a t io n b y o o a l一 d u s t e x tar e t in B A L B / 33T
A 3卜 l一 1 3 e e ! 1 lin e . 汀 u ra r R盯 19 9 0 ; 2 4 2 ( 3 ): 2 2 5 .谧嘴 谧护矛 J 尸含 告个 吞今 占心` 召` 之产宁 各宁 各宁 杏令 J尸奋 J 尸, 奋勺 . 魂嘴 J产宁 J冲
(上接第 38 页 )
该技术是在分子水平上反 映遗传物质的改
变程度 , 所以其敏感性要 比诸如检测染色
体畸变 、 断裂 、 姐妹染色单体交换频率改
变 、 微核率改变 以及碱洗脱与荧光分析
法 (6, 7)敏感得多且更具有价值 .
目前国内学者章静波等 (8) 报道的利用
原位缺 口翻译技术检测药物对细胞 D N A
的断裂损伤 , 采用 的是放射 白显影方法 ,
而本实验所采用的是放射自显影方法 , 不
仅简化了实验步骤 、 缩短了实验周期 , 而
且还提高了实验的敏感性 . 因此 , 可以预
测该技术在环境诱变因子的筛选及研究其
对细胞 D N A 的损伤 、 研究抗肿瘤 、 抗致
畸 、 抗突变药物的机制方面必将得到 日益
广泛的应用 ,
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